E*4
2 楼
知道本版的牛人非常多，全部大隐隐于市。希望各位大神能帮忙指出mammalian Hela
lentivirus expression的问题。我们试图把一个蛋白从pCMV2-N terminal-Flag
vector上面subclone到另一个lentivirus vector上，然后在Hela里面建立over-
expression stable cell line。用的是psPAX2 and pMD2G在293T里面包装病毒（在
293T里面可以检测到蛋白表达）。问题是empty vector很顺利，但是我们的蛋白没有办
法产生病毒，或者说产生的病毒没有办法感染Hela细胞。我尝试过三种不同的
lentivirus expression vectors，同样的结果。后来怀疑是不是我的蛋白对细胞有毒
性，于是又尝试了另外一个安全无害的蛋白，还是同样的结果。现在我怀疑是不是在做
subcloning的时候，缺了或者多了什么部件？插入的位点是在multiple cloning sites
. 我的insert只包括N Flag-Protein of interest，没有polyA tail。之前也试过包括
polyA tail，同样无果。如果实在无解，我们已经考虑要包给公司做了，但是总是要告
诉他们subclone sequence的。希望大神能够指点迷津！跪谢！
lentivirus expression的问题。我们试图把一个蛋白从pCMV2-N terminal-Flag
vector上面subclone到另一个lentivirus vector上，然后在Hela里面建立over-
expression stable cell line。用的是psPAX2 and pMD2G在293T里面包装病毒（在
293T里面可以检测到蛋白表达）。问题是empty vector很顺利，但是我们的蛋白没有办
法产生病毒，或者说产生的病毒没有办法感染Hela细胞。我尝试过三种不同的
lentivirus expression vectors，同样的结果。后来怀疑是不是我的蛋白对细胞有毒
性，于是又尝试了另外一个安全无害的蛋白，还是同样的结果。现在我怀疑是不是在做
subcloning的时候，缺了或者多了什么部件？插入的位点是在multiple cloning sites
. 我的insert只包括N Flag-Protein of interest，没有polyA tail。之前也试过包括
polyA tail，同样无果。如果实在无解，我们已经考虑要包给公司做了，但是总是要告
诉他们subclone sequence的。希望大神能够指点迷津！跪谢！
u*y
3 楼
雪白雪白的一片～
h*y
4 楼
lenti 包装容量有限。你的基因有多大？
sites
【在 E*********4 的大作中提到】
: 知道本版的牛人非常多，全部大隐隐于市。希望各位大神能帮忙指出mammalian Hela
: lentivirus expression的问题。我们试图把一个蛋白从pCMV2-N terminal-Flag
: vector上面subclone到另一个lentivirus vector上，然后在Hela里面建立over-
: expression stable cell line。用的是psPAX2 and pMD2G在293T里面包装病毒（在
: 293T里面可以检测到蛋白表达）。问题是empty vector很顺利，但是我们的蛋白没有办
: 法产生病毒，或者说产生的病毒没有办法感染Hela细胞。我尝试过三种不同的
: lentivirus expression vectors，同样的结果。后来怀疑是不是我的蛋白对细胞有毒
: 性，于是又尝试了另外一个安全无害的蛋白，还是同样的结果。现在我怀疑是不是在做
: subcloning的时候，缺了或者多了什么部件？插入的位点是在multiple cloning sites
: . 我的insert只包括N Flag-Protein of interest，没有polyA tail。之前也试过包括
sites
【在 E*********4 的大作中提到】
: 知道本版的牛人非常多，全部大隐隐于市。希望各位大神能帮忙指出mammalian Hela
: lentivirus expression的问题。我们试图把一个蛋白从pCMV2-N terminal-Flag
: vector上面subclone到另一个lentivirus vector上，然后在Hela里面建立over-
: expression stable cell line。用的是psPAX2 and pMD2G在293T里面包装病毒（在
: 293T里面可以检测到蛋白表达）。问题是empty vector很顺利，但是我们的蛋白没有办
: 法产生病毒，或者说产生的病毒没有办法感染Hela细胞。我尝试过三种不同的
: lentivirus expression vectors，同样的结果。后来怀疑是不是我的蛋白对细胞有毒
: 性，于是又尝试了另外一个安全无害的蛋白，还是同样的结果。现在我怀疑是不是在做
: subcloning的时候，缺了或者多了什么部件？插入的位点是在multiple cloning sites
: . 我的insert只包括N Flag-Protein of interest，没有polyA tail。之前也试过包括
M*e
5 楼
都好漂亮！
E*4
6 楼
只有1.8kb
【在 h******y 的大作中提到】
: lenti 包装容量有限。你的基因有多大？
:
: sites
【在 h******y 的大作中提到】
: lenti 包装容量有限。你的基因有多大？
:
: sites
z*e
7 楼
俩娃都太美了！
v*e
8 楼
这种情况你只能一一排除，
首先你的lenti假病毒转染Hela的效率，这种试验，可以找携带GFP的假病毒做。如果效
率不是问题，
第二，你可以拿上清去测P24，检测一下你包的病毒怎么样？或者拿第二次（我一般收
集两次，第一次是转染293T后的24小时，第二次是第一次收集后的24小时，然后用第二
次收集的做转导）收集的上清去抽提DNA去测你的假病毒有没有包装了你的质粒
第三你的flag－tag是不是好用？有些情况下，不好用，除非你已经用这种构建表达过
蛋白，也可以检测的到
首先你的lenti假病毒转染Hela的效率，这种试验，可以找携带GFP的假病毒做。如果效
率不是问题，
第二，你可以拿上清去测P24，检测一下你包的病毒怎么样？或者拿第二次（我一般收
集两次，第一次是转染293T后的24小时，第二次是第一次收集后的24小时，然后用第二
次收集的做转导）收集的上清去抽提DNA去测你的假病毒有没有包装了你的质粒
第三你的flag－tag是不是好用？有些情况下，不好用，除非你已经用这种构建表达过
蛋白，也可以检测的到
s*r
9 楼
越长越像了
【在 M********i 的大作中提到】
: 祝各位巴巴麻麻兔年如意！祝各位宠物宝宝快乐健康！就像小白和哥哥一样:D
【在 M********i 的大作中提到】
: 祝各位巴巴麻麻兔年如意！祝各位宠物宝宝快乐健康！就像小白和哥哥一样:D
E*4
10 楼
我的这个载体就带有GFP，所以看到的结果是，空载体包装病毒没有问题，感染Hela效
率很高。但是插入我们的基因的病毒感染的Hela就是一片漆黑，完全没有GFP。这是不
是说明病毒没有包装我的质粒？关于Flag－tag，在293T里面可以检测到，信号很强。
谢谢分享经验！
【在 v********e 的大作中提到】
: 这种情况你只能一一排除，
: 首先你的lenti假病毒转染Hela的效率，这种试验，可以找携带GFP的假病毒做。如果效
: 率不是问题，
: 第二，你可以拿上清去测P24，检测一下你包的病毒怎么样？或者拿第二次（我一般收
: 集两次，第一次是转染293T后的24小时，第二次是第一次收集后的24小时，然后用第二
: 次收集的做转导）收集的上清去抽提DNA去测你的假病毒有没有包装了你的质粒
: 第三你的flag－tag是不是好用？有些情况下，不好用，除非你已经用这种构建表达过
: 蛋白，也可以检测的到
率很高。但是插入我们的基因的病毒感染的Hela就是一片漆黑，完全没有GFP。这是不
是说明病毒没有包装我的质粒？关于Flag－tag，在293T里面可以检测到，信号很强。
谢谢分享经验！
【在 v********e 的大作中提到】
: 这种情况你只能一一排除，
: 首先你的lenti假病毒转染Hela的效率，这种试验，可以找携带GFP的假病毒做。如果效
: 率不是问题，
: 第二，你可以拿上清去测P24，检测一下你包的病毒怎么样？或者拿第二次（我一般收
: 集两次，第一次是转染293T后的24小时，第二次是第一次收集后的24小时，然后用第二
: 次收集的做转导）收集的上清去抽提DNA去测你的假病毒有没有包装了你的质粒
: 第三你的flag－tag是不是好用？有些情况下，不好用，除非你已经用这种构建表达过
: 蛋白，也可以检测的到
f*n
11 楼
真干净漂亮
v*e
12 楼
你是表达GFP目的蛋白的融合蛋白？还是他们之间有某种序列比IRES或者T or P2A序列?
哪个在前哪个在后？如果你GFP看不到就要仔细检查下构建策略有没有问题
【在 E*********4 的大作中提到】
: 我的这个载体就带有GFP，所以看到的结果是，空载体包装病毒没有问题，感染Hela效
: 率很高。但是插入我们的基因的病毒感染的Hela就是一片漆黑，完全没有GFP。这是不
: 是说明病毒没有包装我的质粒？关于Flag－tag，在293T里面可以检测到，信号很强。
: 谢谢分享经验！
哪个在前哪个在后？如果你GFP看不到就要仔细检查下构建策略有没有问题
【在 E*********4 的大作中提到】
: 我的这个载体就带有GFP，所以看到的结果是，空载体包装病毒没有问题，感染Hela效
: 率很高。但是插入我们的基因的病毒感染的Hela就是一片漆黑，完全没有GFP。这是不
: 是说明病毒没有包装我的质粒？关于Flag－tag，在293T里面可以检测到，信号很强。
: 谢谢分享经验！
h*d
13 楼
好看~
F*p
14 楼
把构建好的lentivirus plasmid拿去测序， 可能序列有了问题。
m*u
15 楼
哇，已经这么大了。这孩子是blue point还是seal point的？
Z*5
16 楼
先把表达蛋白的质粒做个瞬转看看蛋白表达再包病毒比较靠谱。
M*i
17 楼
是blue point.脸还没有很黑哈。
谢谢夸奖:)
谢谢夸奖:)
Z*5
18 楼
先把表达蛋白的质粒做个瞬转看看蛋白表达再包病毒比较靠谱。
M*i
19 楼
zz新年好^^.祝你今年拍出更多美片！
【在 z*****e 的大作中提到】
: 俩娃都太美了！
【在 z*****e 的大作中提到】
: 俩娃都太美了！
a*a
20 楼
要看ltr到ltr的总长度。1.8k不小了，如果你的载体里面本来花样就不少，那么插进你
的片段以后可能会超过上限，病毒滴度会降几个数量级
也许你把ires gfp什么都删掉效果会好不少，
【在 E*********4 的大作中提到】
: 只有1.8kb
的片段以后可能会超过上限，病毒滴度会降几个数量级
也许你把ires gfp什么都删掉效果会好不少，
【在 E*********4 的大作中提到】
: 只有1.8kb
M*i
21 楼
小白不好意思地低下了头...左边还有一佗眼s没有擦:P
【在 f*********n 的大作中提到】
: 真干净漂亮
【在 f*********n 的大作中提到】
: 真干净漂亮
p*t
22 楼
请教一下，为什么要用lentivirus？如果只是做过表达细胞系，直接nucleofection然
后再FACS/抗生素筛选不就可以了吗？
sites
【在 E*********4 的大作中提到】
: 知道本版的牛人非常多，全部大隐隐于市。希望各位大神能帮忙指出mammalian Hela
: lentivirus expression的问题。我们试图把一个蛋白从pCMV2-N terminal-Flag
: vector上面subclone到另一个lentivirus vector上，然后在Hela里面建立over-
: expression stable cell line。用的是psPAX2 and pMD2G在293T里面包装病毒（在
: 293T里面可以检测到蛋白表达）。问题是empty vector很顺利，但是我们的蛋白没有办
: 法产生病毒，或者说产生的病毒没有办法感染Hela细胞。我尝试过三种不同的
: lentivirus expression vectors，同样的结果。后来怀疑是不是我的蛋白对细胞有毒
: 性，于是又尝试了另外一个安全无害的蛋白，还是同样的结果。现在我怀疑是不是在做
: subcloning的时候，缺了或者多了什么部件？插入的位点是在multiple cloning sites
: . 我的insert只包括N Flag-Protein of interest，没有polyA tail。之前也试过包括
后再FACS/抗生素筛选不就可以了吗？
sites
【在 E*********4 的大作中提到】
: 知道本版的牛人非常多，全部大隐隐于市。希望各位大神能帮忙指出mammalian Hela
: lentivirus expression的问题。我们试图把一个蛋白从pCMV2-N terminal-Flag
: vector上面subclone到另一个lentivirus vector上，然后在Hela里面建立over-
: expression stable cell line。用的是psPAX2 and pMD2G在293T里面包装病毒（在
: 293T里面可以检测到蛋白表达）。问题是empty vector很顺利，但是我们的蛋白没有办
: 法产生病毒，或者说产生的病毒没有办法感染Hela细胞。我尝试过三种不同的
: lentivirus expression vectors，同样的结果。后来怀疑是不是我的蛋白对细胞有毒
: 性，于是又尝试了另外一个安全无害的蛋白，还是同样的结果。现在我怀疑是不是在做
: subcloning的时候，缺了或者多了什么部件？插入的位点是在multiple cloning sites
: . 我的insert只包括N Flag-Protein of interest，没有polyA tail。之前也试过包括
m*u
23 楼
blue point不会变成小黑脸，再加上那么蓝的大眼睛，很美貌啊。我家包子他妈就是
blue point，爸爸是大黑脸的seal point,不过包子自己是seal bi-color,很奇怪的遗
传。
【在 M********i 的大作中提到】
: 是blue point.脸还没有很黑哈。
: 谢谢夸奖:)
blue point，爸爸是大黑脸的seal point,不过包子自己是seal bi-color,很奇怪的遗
传。
【在 M********i 的大作中提到】
: 是blue point.脸还没有很黑哈。
: 谢谢夸奖:)
E*4
24 楼
不是融合蛋白。蛋白下游有SV40 promoter启动的GFP和Puromycin 标签。
谢谢！
列?
【在 v********e 的大作中提到】
: 你是表达GFP目的蛋白的融合蛋白？还是他们之间有某种序列比IRES或者T or P2A序列?
: 哪个在前哪个在后？如果你GFP看不到就要仔细检查下构建策略有没有问题
谢谢！
列?
【在 v********e 的大作中提到】
: 你是表达GFP目的蛋白的融合蛋白？还是他们之间有某种序列比IRES或者T or P2A序列?
: 哪个在前哪个在后？如果你GFP看不到就要仔细检查下构建策略有没有问题
M*i
25 楼
可能包子爸妈都带了bi-color的隐性基因？小白的麻麻就是blue bi-color。如果
小白没有被KC,她的宝宝也可能是bi-color啵。
【在 m**u 的大作中提到】
: blue point不会变成小黑脸，再加上那么蓝的大眼睛，很美貌啊。我家包子他妈就是
: blue point，爸爸是大黑脸的seal point,不过包子自己是seal bi-color,很奇怪的遗
: 传。
小白没有被KC,她的宝宝也可能是bi-color啵。
【在 m**u 的大作中提到】
: blue point不会变成小黑脸，再加上那么蓝的大眼睛，很美貌啊。我家包子他妈就是
: blue point，爸爸是大黑脸的seal point,不过包子自己是seal bi-color,很奇怪的遗
: 传。
E*4
26 楼
全质粒都要测么？有可能是哪一段出了问题吗？
谢谢！
【在 F******p 的大作中提到】
: 把构建好的lentivirus plasmid拿去测序， 可能序列有了问题。
谢谢！
【在 F******p 的大作中提到】
: 把构建好的lentivirus plasmid拿去测序， 可能序列有了问题。
h*n
27 楼
好漂亮的猫猫啊~~
E*4
28 楼
已经做了，在293T里做transient expression，GFP有很强的信号，蛋白也表达，也有
Flag。
谢谢！
【在 Z******5 的大作中提到】
: 先把表达蛋白的质粒做个瞬转看看蛋白表达再包病毒比较靠谱。
Flag。
谢谢！
【在 Z******5 的大作中提到】
: 先把表达蛋白的质粒做个瞬转看看蛋白表达再包病毒比较靠谱。
g*a
29 楼
真美啊。就像两个仙女。。。
E*4
30 楼
想要做成stable cell line，用病毒的话效率会很高。如果直接转染，也可以整合到基
因组，就是效率太低。
【在 p****t 的大作中提到】
: 请教一下，为什么要用lentivirus？如果只是做过表达细胞系，直接nucleofection然
: 后再FACS/抗生素筛选不就可以了吗？
:
: sites
因组，就是效率太低。
【在 p****t 的大作中提到】
: 请教一下，为什么要用lentivirus？如果只是做过表达细胞系，直接nucleofection然
: 后再FACS/抗生素筛选不就可以了吗？
:
: sites
s*e
31 楼
thank you 小白和哥哥
v*e
32 楼
这种情况十有八九你包病毒出了问题，建议换一个系统看看，我们通常用的是plenti_
GFP GFP可以用其他基因替换，然后跟pCMV-VSV-G 和pSpAX2包装，从来没遇到过问题，
你可以试试
【在 E*********4 的大作中提到】
: 不是融合蛋白。蛋白下游有SV40 promoter启动的GFP和Puromycin 标签。
: 谢谢！
:
: 列?
GFP GFP可以用其他基因替换，然后跟pCMV-VSV-G 和pSpAX2包装，从来没遇到过问题，
你可以试试
【在 E*********4 的大作中提到】
: 不是融合蛋白。蛋白下游有SV40 promoter启动的GFP和Puromycin 标签。
: 谢谢！
:
: 列?
A*R
33 楼
小白也长大了，现在哥哥占了猫树的高处了？蓝眼睛真醉人啊！
M*i
34 楼
lol, 请看高地争夺战
【在 A*********R 的大作中提到】
: 小白也长大了，现在哥哥占了猫树的高处了？蓝眼睛真醉人啊！
【在 A*********R 的大作中提到】
: 小白也长大了，现在哥哥占了猫树的高处了？蓝眼睛真醉人啊！
y*g
35 楼
真漂亮
F*t
36 楼
哈哈
上面那个脸一看就是个男猫哈
虎头虎脑的好俊
上面那个脸一看就是个男猫哈
虎头虎脑的好俊
A*R
37 楼
家中的老大睡得都高一些，小白暂居下风。 俺家还是girl 蜜咪睡得高一些。
j*u
38 楼
太神气啦！
C*r
39 楼
好漂亮的猫猫！
n*e
40 楼
美
相关阅读
使用bookends遇到问题，求助真是烦死了什么样的Seminar才算是好的Seminar生物还有出路不?问个Y轴截断的图的做法中科院植物研究员因公殉职啥叫promiscuous plasmid中科院 回国面试的话 机票会报销吗？ (转载)好像生物转法律的人越来越多了嘛Paper help! Chromosome Res. 1995 Jan;3(1):32-40.collecting money讨论：信号通路上的蛋白酶功能研究策略哪种好？有人用过abmart做抗体吗？这个是忽 悠大家吗 (第三军医大学诚招海内外高层次人才)实验室同事偷用自己结果，我该怎么办？Paper help... Current Protocols in Molecular Biology阿拉巴马大学生物教授毕晓普承认谋杀罪诚聘生物制药研发高级人才诚聘：生物 英才有个国内杂志review机会