请教PCR问题 - 未名空间MITBBS历史存档

国际科技财经博客移民网络热点娱乐民生时事公众号

Redian新闻

>未名空间

>Biology - 生物学

请教PCR问题

请教PCR问题# Biology - 生物学

C*K2015-12-05 08:12

1 楼

我知道放室溫12hr是OK的. 不知有沒有人放更久的? 我把Wellness塞在冰盒裡凍成幾個
ice cubes, about 1 oZ size. 從冷
凍庫拿出來後在autofeeder放了24小時, 咪應該在15-24hr之間吃了最後一格, 但早上
我發現都吐在地上了. 我聞了聞剩下
的和他吐的(excuse me), 好像沒怪味. 他看起來也沒事, 早上依然吃早餐, 舔毛, 睡
覺, 沒什麼不一樣.
feeder附近室溫59-60F.
也許他只是吐毛犯了? 心裡還是有些毛毛的..

c*y2015-12-05 08:12

2 楼

要从基因组里扩两段片段，分别也就1kb左右，居然死活p不出来，求助
引物分别都设计了3对了，taq酶p，刚开始是p不出来，后来调整体系后会在300-500这
个区域出现非常特异的条带，但是1kb的位置什么都没有
基因组pcr不是应该很多非特异性条带的么。。。
求帮分析原因。。。

t*u2015-12-05 08:12

3 楼

坏了应该不会吃的
至少大米这样，叼着呢

T*e2015-12-05 08:12

4 楼

模板有问题吗？模板质量，模板浓度都会影响，可能你要稀释模板试试
引物GC含量多少？三对不同引物差别是什么？同一对引物你blast了吗？

C*K2015-12-05 08:12

5 楼

從來沒這樣餵過, 以前都餵乾糧.
爬螞蟻咪是拒吃的....

i*a2015-12-05 08:12

6 楼

genomic dna pcr的时候浓度不能太高，多稀释一下，引物3'端以g或c结尾。我做一般
用kod酶，现在谁还用taq。

【在 c********y 的大作中提到】

: 要从基因组里扩两段片段，分别也就1kb左右，居然死活p不出来，求助
: 引物分别都设计了3对了，taq酶p，刚开始是p不出来，后来调整体系后会在300-500这
: 个区域出现非常特异的条带，但是1kb的位置什么都没有
: 基因组pcr不是应该很多非特异性条带的么。。。
: 求帮分析原因。。。

o*y2015-12-05 08:12

7 楼

我家咪 12 小时候的罐头是肯定不吃的
得猫猫们应该能闻出来吧，而且他们很挑的
不过我觉得你这个又冻，又解冻的，是不是不太好？不过我也不懂

【在 C**K 的大作中提到】

: 我知道放室溫12hr是OK的. 不知有沒有人放更久的? 我把Wellness塞在冰盒裡凍成幾個
: ice cubes, about 1 oZ size. 從冷
: 凍庫拿出來後在autofeeder放了24小時, 咪應該在15-24hr之間吃了最後一格, 但早上
: 我發現都吐在地上了. 我聞了聞剩下
: 的和他吐的(excuse me), 好像沒怪味. 他看起來也沒事, 早上依然吃早餐, 舔毛, 睡
: 覺, 沒什麼不一樣.
: feeder附近室溫59-60F.
: 也許他只是吐毛犯了? 心裡還是有些毛毛的..

M*g2015-12-05 08:12

8 楼

Use Q5 from NEB.
or try to purify your genomic DNA and then do PCR again.

S*t2015-12-05 08:12

9 楼

24HR没问题的,其实猫早年被人类收养就是因为食腐,来人类这里找点剩下的食物,

c*y2015-12-05 08:12

10 楼

模版每个体系加40ug，刚开始我确实加太多了，在1kb那里有条带就以为是目的条带，
还一本正经割胶回收连接，后来才意识到可能是基因组dna而已，现在gapdh扩得很好
引物gc含量基本都在50-60之间我觉得可以接受吧，引物blast过，都有15个碱基错配，
可是我的目的片段就那么长，能设计的都设计了，再设计就不是那块区域了

【在 T*****e 的大作中提到】

: 模板有问题吗？模板质量，模板浓度都会影响，可能你要稀释模板试试
: 引物GC含量多少？三对不同引物差别是什么？同一对引物你blast了吗？

C*K2015-12-05 08:12

11 楼

我記得你說罐頭有防腐劑呢....

【在 S********t 的大作中提到】

: 24HR没问题的,其实猫早年被人类收养就是因为食腐,来人类这里找点剩下的食物,

c*y2015-12-05 08:12

12 楼

以前我也用kod，后来觉得taq扩增效率高，先把条件摸出来再换高保真，现在新到的实
验室没有kod也是一个问题。。。关键是taq连目的片段都p不出来我总觉得换酶也不见
得有用。。。
现在模版稀释了，40ng一个体系，引物3‘端也都是g或者c

【在 i**********a 的大作中提到】

: genomic dna pcr的时候浓度不能太高，多稀释一下，引物3'端以g或c结尾。我做一般
: 用kod酶，现在谁还用taq。

C*K2015-12-05 08:12

13 楼

就是怕壞了才凍過. 可又不敢餵乾糧.

【在 o******y 的大作中提到】

: 我家咪 12 小时候的罐头是肯定不吃的
: 得猫猫们应该能闻出来吧，而且他们很挑的
: 不过我觉得你这个又冻，又解冻的，是不是不太好？不过我也不懂

c*y2015-12-05 08:12

14 楼

dna重新提过了，用试剂盒提的，感觉应该还好吧，gapdh扩得挺好的。
我试试，不停重新定酶怕老板批啊。。。

【在 M******g 的大作中提到】

: Use Q5 from NEB.
: or try to purify your genomic DNA and then do PCR again.

S*t2015-12-05 08:12

15 楼

有防腐计的就更不坏了

【在 C**K 的大作中提到】

: 我記得你說罐頭有防腐劑呢....

j*n2015-12-05 08:12

16 楼

不同的酶最优条件是不一样的。。。
我们做pcr优化顺序
1 touch down pcr
2 gradient pcr
3 换buffer 推荐epicenter buffer kit 有12 种不同buffer 适合不同gc含量的
对于特别难P的我们经常发现只有1-2个buffer可行
4 换酶我们实验室全部都是用q5 除了colony pcr 所以一般换酶不会有太好结果以前
也试过不同公司的感觉都不如q5

【在 c********y 的大作中提到】

: 以前我也用kod，后来觉得taq扩增效率高，先把条件摸出来再换高保真，现在新到的实
: 验室没有kod也是一个问题。。。关键是taq连目的片段都p不出来我总觉得换酶也不见
: 得有用。。。
: 现在模版稀释了，40ng一个体系，引物3‘端也都是g或者c

o*y2015-12-05 08:12

17 楼

喂小罐 3 oz 的试试？
我们都是早上喂两罐一直到下午回家
再打开一罐新的
旁边放点干粮，不过咪基本上就不吃干粮了

【在 C**K 的大作中提到】

: 就是怕壞了才凍過. 可又不敢餵乾糧.

T*e2015-12-05 08:12

18 楼

我建议你用q5，如果你有的话。
模板我建议你同时用1倍，10倍稀释，100倍稀释，1000倍稀释同时做。
你说的15个错配是什么情况？一共多长？怎么会这样？如果你引物设计有困难，建议用
巢式PCR
麻烦一点的就是设计个2~3kb好扩增的，然后做成plasmid，再从里面扩增你要的1kb，
应该容易很多
退货温度也可以优化一下，不过如果是Q5，我都用NEB Tm calculator
记得NEB有个high GC的buffer 不过我从来没有遇到过那样的问题

C*K2015-12-05 08:12

19 楼

真的嗎? 不要開玩笑啦, 我是真煩惱... >_<

【在 S********t 的大作中提到】

: 有防腐计的就更不坏了

n*u2015-12-05 08:12

20 楼

1kb 左右？合成吧也就五天就合好了

：要从基因组里扩两段片段，分别也就1kb左右，居然死活p不出来，求助
：引物分别都设计了3对了，taq酶p，刚开始是p不出来，后来调整体系后会在300-500这

C*K2015-12-05 08:12

21 楼

平時沒問題, 現在是因為要找人一天來餵一次才得這麼做滴呀.

【在 o******y 的大作中提到】

: 喂小罐 3 oz 的试试？
: 我们都是早上喂两罐一直到下午回家
: 再打开一罐新的
: 旁边放点干粮，不过咪基本上就不吃干粮了

s*s2015-12-05 08:12

22 楼

debug 的话，我一般都属先gradient pcr, 不行的话nested 基本能搞定。可能要换一
两个酶试试。
不过就一k，还不如合成，或者买clone从plasmid里面p

【在 c********y 的大作中提到】

T*e2015-12-05 08:12

23 楼

12hr 我家大宝宝一般是不吃的。就是吃也很可能会吐出来。

【在 C**K 的大作中提到】

l*e2015-12-05 08:12

24 楼

问得太笼统。直接把你的序列都放出来，别人才有可能帮你。
否则都是扯淡。

【在 c********y 的大作中提到】