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同一个蛋白用两种抗体为什么WB条带不重叠

同一个蛋白用两种抗体为什么WB条带不重叠# Biology - 生物学

t*o2016-02-04 08:02

1 楼

我前阵子做了485体检，很多疫苗以前出国的时候都打过了，这次只打了另外两针，具
体名字我也忘了，好像是什么hepatitis A和 hepatitis B，然后也做了TB test，结果
是 positive。收到TB test结果以后，那个移民局指定的医生（Dr. L）让我做两件事
情：
（1）做 chest X-ray，并且把报告发给Dr. L; X-ray的结果是negative，说明不具有
传染性。Dr. L也说了，其实绝大多数中国人都是这样的结果。现在Dr. L已经有了我TB
test和 chest X-ray的结果。
(2) Dr. L同时又给了我另外一个order，约见 Pulmonary and Sleep Consultant里面
的一个医生 Dr. F. 我上个星期二去见了Dr. L，她就简单对我做了一些咨询，建议我
吃6个月的药。我看了P Jiang的博客，说我们中国人不要去吃那个药，我当时也就没有
答应。直到今天，我询问Dr. L那边，有没有收到Dr. F的report，那边还是说没收到。
我想不通的是，为什么这么一个简单的report，一个星期都提交不了？
请问这里做过485体检，并且TB test positive，chest X-ray做过以后，是不是也像我
一样，必须要去见一个consultant的医生，而且也要等很久才能收到报告？只有等这个
consultant的报告提交给移民局指定的医生，我的I-693表才能complete？

t*n2016-02-04 08:02

2 楼

嗯。。
土问，银行可以么。。。
轻拍。。

g*n2016-02-04 08:02

3 楼

我FLAG IP了一个蛋白，然后跑western，用anti FLAG得到blot之后strip membrane，
然后用抗蛋白本身的抗体再probe一遍，结果发现两次得到的条带不重叠（相差不远，
但很明显不重叠）。FLAG抗体出现两条带，高的带明显，低的带比较浅。但抗蛋白本身
的抗体得到一条带，和低的那条带差不多重叠。
本来是想用两个抗体各检测一遍更严谨点，没想到出了这样的结果反而麻烦了。请问大
家这是怎么回事。
谢谢

t*o2016-02-04 08:02

4 楼

刚才又看了一下PJIANG的博客，里面又说TB test和X-ray做完以后就是等693表格了，
怎么我的这个医生还安排见什么consultant医生呢？是不是想要多赚我一些钱？

h*n2016-02-04 08:02

5 楼

银行可以。一般要提前打电话预约。银行应该有个人专门是负责换外币的。

C*42016-02-04 08:02

6 楼

首先排除抗体本身的中轻链（～50和25kD), 其次Flag在～35kDa左右能拉和反应对一条
非特异带。很常见。要甄别一下。
[在 geosmin (Little+Monkey) 的大作中提到：]
：我FLAG IP了一个蛋白，然后跑western，用anti FLAG得到blot之后strip membrane，
：然后用抗蛋白本身的抗体再probe一遍，结果发现两次得到的条带不重叠（相差不远
，但很明显不重叠）。FLAG抗体出现两条带，高的带明显，低的带比较浅。但抗蛋白本
身的抗体得到一条带，和低的那条带差不多重叠。
：...........

H*72016-02-04 08:02

7 楼

patpat, Bless!

t*n2016-02-04 08:02

8 楼

看了BOA的rate，太可怕了

【在 h******n 的大作中提到】

: 银行可以。一般要提前打电话预约。银行应该有个人专门是负责换外币的。

t*y2016-02-04 08:02

9 楼

应该是蛋白形成二聚体，外源蛋白和内源蛋白一起ip下来，flag的外源蛋白分子量大在
上面，内源蛋白本身在下面。蛋白的抗体可能识别的位点是和flag相连的末端，因为连
上flag反而不能识别外源蛋白了，所以只看到低一点的条带。

v*b2016-02-04 08:02

10 楼

bless

h*n2016-02-04 08:02

11 楼

恩，他们的rate应该是按当日的市场行情。

【在 t******n 的大作中提到】

: 看了BOA的rate，太可怕了

w*e2016-02-04 08:02

12 楼

能仔细解释一下“其次Flag在～35kDa左右能拉和反应对一条非特异带”，我最近碰到
了这个问题，不知道怎么解释？谢谢

membrane，

【在 C*******4 的大作中提到】

: 首先排除抗体本身的中轻链（～50和25kD), 其次Flag在～35kDa左右能拉和反应对一条
: 非特异带。很常见。要甄别一下。
: [在 geosmin (Little+Monkey) 的大作中提到：]
: ：我FLAG IP了一个蛋白，然后跑western，用anti FLAG得到blot之后strip membrane，
: ：然后用抗蛋白本身的抗体再probe一遍，结果发现两次得到的条带不重叠（相差不远
: ，但很明显不重叠）。FLAG抗体出现两条带，高的带明显，低的带比较浅。但抗蛋白本
: 身的抗体得到一条带，和低的那条带差不多重叠。
: ：...........

I*t2016-02-04 08:02

13 楼

bless, 祝早拿到693

g*n2016-02-04 08:02

14 楼

谢谢回复。我的蛋白分子量175KDa，所以可以排除轻重链。另外我的蛋白是在null
mutant的背景里在另一条染色体上插入一个FLAG tagged gene，所以应该不是和内源蛋
白行程二聚体。
请问还有其他什么可能吗？谢谢

b*r2016-02-04 08:02

15 楼

我也是TB POSITIVE，有小黄本记录，周五直接做的胸透，周一就拿到报告了。

e*s2016-02-04 08:02

16 楼

这个蛋白有PTM? 如果这个Modification 正好在抗体的识别Epitope 上或者附近，会影
响抗体的识别吧？
把蛋白本身抗体曝光长点，说不定也能看见两条带？这个我倒遇见过，就是抗体对同一
蛋白不同状态有不同的敏感性。

【在 g*****n 的大作中提到】

: 我FLAG IP了一个蛋白，然后跑western，用anti FLAG得到blot之后strip membrane，
: 然后用抗蛋白本身的抗体再probe一遍，结果发现两次得到的条带不重叠（相差不远，
: 但很明显不重叠）。FLAG抗体出现两条带，高的带明显，低的带比较浅。但抗蛋白本身
: 的抗体得到一条带，和低的那条带差不多重叠。
: 本来是想用两个抗体各检测一遍更严谨点，没想到出了这样的结果反而麻烦了。请问大
: 家这是怎么回事。
: 谢谢

p*h2016-02-04 08:02

17 楼

bless!你最好找中国医生，了解中国国情的，大凡中国人小时候都打了疫苗的，TB的结
果都是positive的。我找了个中国医生，skip TB (save 3 days)直接上胸透，结果当
然是negative的，医生直接签字，封上信封就给我了。

g*n2016-02-04 08:02

18 楼

这个是正解。

【在 e****s 的大作中提到】

: 这个蛋白有PTM? 如果这个Modification 正好在抗体的识别Epitope 上或者附近，会影
: 响抗体的识别吧？
: 把蛋白本身抗体曝光长点，说不定也能看见两条带？这个我倒遇见过，就是抗体对同一
: 蛋白不同状态有不同的敏感性。

l*d2016-02-04 08:02

19 楼

对，找中国医生，皮式，过后两天再去看医生，positive,当时直接上X-ray, X-ray之
后10分钟拿到信封。从开始预约去体检，到拿到信封，共三天。

m*22016-02-04 08:02

20 楼

还有个终极办法就是把两条带都切了mass spec

t*o2016-02-04 08:02

21 楼

谢谢楼上的祝福。
请问我这种情况下，应该怎么办呢？难道就是等吗？已经打过两次电话催结果了，都快
把自己气哭了。

C*42016-02-04 08:02

22 楼

可能这个蛋白不稳定，一部分有降解，但FLAG还都在。抗其自己的抗体因为要检测的那
一段缺失了，就不能检测到。试一试抗另一边的抗体。如原来的是抗N端序列，换一个C
端的试一试。
[在 geosmin (Little+Monkey) 的大作中提到：]
：我FLAG IP了一个蛋白，然后跑western，用anti FLAG得到blot之后strip membrane，
：然后用抗蛋白本身的抗体再probe一遍，结果发现两次得到的条带不重叠（相差不远
，但很明显不重叠）。FLAG抗体出现两条带，高的带明显，低的带比较浅。但抗蛋白本
身的抗体得到一条带，和低的那条带差不多重叠。
：...........

y*o2016-02-04 08:02

23 楼

像楼上的各位，你看能不能换医生从新来一次啊。

g*n2016-02-04 08:02

24 楼

谢谢大家的回复，我试试把曝光时间弄长点看能不能看到两条带。有可能是PTM导致了
其中一条带不容易被我的抗体识别。
可惜我们只有一个自己的抗体，否则可以按照culater94的建议试试两端不同的。

s*n2016-02-04 08:02

25 楼

做blood test，我儿子刚做，直接pass。