m*p
2 楼
最近在做利用lentivirus表达sgRNA KO一个基因,转染第一步就出现问题。
针对两个位点病毒是sigma定制的,寄给我的滴度是5*10^6/ml和1*10^6/ml,我用它们
转了两个细胞(12孔板,每个孔10微升病毒),该病毒正常应该有GFP及puro抗性基因
表达的,我在转染24小时和48小时居然没有看到任何荧光。
我原来用过santa cruze的shRNA病毒,转染后用puromycin筛选,转染效果还是可以的
,最后也筛选出了我要的单克隆细胞。
有人遇到过我现在这个情况吗?怎么解决?
谢啦
针对两个位点病毒是sigma定制的,寄给我的滴度是5*10^6/ml和1*10^6/ml,我用它们
转了两个细胞(12孔板,每个孔10微升病毒),该病毒正常应该有GFP及puro抗性基因
表达的,我在转染24小时和48小时居然没有看到任何荧光。
我原来用过santa cruze的shRNA病毒,转染后用puromycin筛选,转染效果还是可以的
,最后也筛选出了我要的单克隆细胞。
有人遇到过我现在这个情况吗?怎么解决?
谢啦
b*s
4 楼
你看看这个promoter是否在该细胞内能有效表达后面的GFP
f*k
5 楼
我有点疑惑,你说你拿到的是病毒,怎么还转染(transfection)?你是说转导(
transduction)吗?
你的细胞是不是感染效率不高呢?可以尝试spin infection外加用polybrene (4ug/ml
)。在我手里用spin infection和polybrene一起的话可以把在B细胞的感染效率提到90%
甚至95%以上。
不过我都是自己克隆sgRNA进lentiviral vector,然后转染293细胞做病毒。如果是
sigma做的病毒有问题,你没办法知道。
transduction)吗?
你的细胞是不是感染效率不高呢?可以尝试spin infection外加用polybrene (4ug/ml
)。在我手里用spin infection和polybrene一起的话可以把在B细胞的感染效率提到90%
甚至95%以上。
不过我都是自己克隆sgRNA进lentiviral vector,然后转染293细胞做病毒。如果是
sigma做的病毒有问题,你没办法知道。
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