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非完整质粒DNA transfection
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非完整质粒DNA transfection# Biology - 生物学
B*v
1
我打算做个DNA transfection,不同于传统的plasmid,我打算用最小的DNA片段
promoter--kozak--ORF (ATG to TGA)
这个是不是就可以了?有神么问题没?蛋白表达会不会受影响?
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j*u
2
同问

【在 B***v 的大作中提到】
: 我打算做个DNA transfection,不同于传统的plasmid,我打算用最小的DNA片段
: promoter--kozak--ORF (ATG to TGA)
: 这个是不是就可以了?有神么问题没?蛋白表达会不会受影响?

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i*l
3
3' UTR is important for mRNA stability

【在 B***v 的大作中提到】
: 我打算做个DNA transfection,不同于传统的plasmid,我打算用最小的DNA片段
: promoter--kozak--ORF (ATG to TGA)
: 这个是不是就可以了?有神么问题没?蛋白表达会不会受影响?

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B*v
4
你这个想法很好,但是出于把DNA片段做的越小越好的前提,我可能不会加入3' UTR了。
而且日常很多克隆表达都没有3' UTR只有ORF,貌似业没有太大的表达问题。
没有promoter是肯顶不行的我想。

【在 i***l 的大作中提到】
: 3' UTR is important for mRNA stability
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h*y
5
你这思路就是 Minicircle DNA Vector
https://www.systembio.com/minicircle-dna-vectors/overview

【在 B***v 的大作中提到】
: 我打算做个DNA transfection,不同于传统的plasmid,我打算用最小的DNA片段
: promoter--kozak--ORF (ATG to TGA)
: 这个是不是就可以了?有神么问题没?蛋白表达会不会受影响?

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c*i
6
没有polyA, ribosome不能被recruit,无法翻译

★ 发自iPhone App: ChineseWeb 11

【在 B***v 的大作中提到】
: 我打算做个DNA transfection,不同于传统的plasmid,我打算用最小的DNA片段
: promoter--kozak--ORF (ATG to TGA)
: 这个是不是就可以了?有神么问题没?蛋白表达会不会受影响?

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n*e
7
是想解决转染效率不高的问题?看着好像只是表达一个蛋白,整个质粒也没有那么大吧
?有可能做小了效率不见得提高很多,可能和细胞种类的关系更大。

【在 B***v 的大作中提到】
: 我打算做个DNA transfection,不同于传统的plasmid,我打算用最小的DNA片段
: promoter--kozak--ORF (ATG to TGA)
: 这个是不是就可以了?有神么问题没?蛋白表达会不会受影响?

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B*v
8
你提醒的好,多谢。我今天也想到了,polyA是需要的,所以我打算在末端加个hGH
poly(A), 600+ bp, 好大啊。不过没有恐怕不行。
ribosome结合位点在promoter区域吧?polyA的作用是nuclear export和stabilize
mRNA,我记得。

【在 c**i 的大作中提到】
: 没有polyA, ribosome不能被recruit,无法翻译
:
: ★ 发自iPhone App: ChineseWeb 11

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B*v
9
你这个有点意思,我头一次听说,3kb确实很小,比我现在加个polyA之后1.9kb也大不
了台多。我研究一下。Minicircle DNA应该稳定性更好?转录效率更高?

【在 h******y 的大作中提到】
: 你这思路就是 Minicircle DNA Vector
: https://www.systembio.com/minicircle-dna-vectors/overview

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B*v
10
不是解决转染效率不高的问题,否则我可以用病毒载体。

【在 n******e 的大作中提到】
: 是想解决转染效率不高的问题?看着好像只是表达一个蛋白,整个质粒也没有那么大吧
: ?有可能做小了效率不见得提高很多,可能和细胞种类的关系更大。

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h*y
11
minicircle DNA的优势主要有两点。一是size小,转染效率高。二是最主要的,因为去
除了在bacterial中复制和筛选所需要的细菌DNA元件,从而降低了在真核细胞中被识别
成异源而排除的几率。有的minicircle DNA上加了S/MAR元件,从而可以以episome的形
式在细胞中长期存在,实现外源基因的长时表达。

【在 B***v 的大作中提到】
: 你这个有点意思,我头一次听说,3kb确实很小,比我现在加个polyA之后1.9kb也大不
: 了台多。我研究一下。Minicircle DNA应该稳定性更好?转录效率更高?

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B*v
12
谢谢。学习了。

【在 h******y 的大作中提到】
: minicircle DNA的优势主要有两点。一是size小,转染效率高。二是最主要的,因为去
: 除了在bacterial中复制和筛选所需要的细菌DNA元件,从而降低了在真核细胞中被识别
: 成异源而排除的几率。有的minicircle DNA上加了S/MAR元件,从而可以以episome的形
: 式在细胞中长期存在,实现外源基因的长时表达。

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B*v
13
我现在想我可能不需要minicircle DNA, 我只需要把我的construct (promoter-insert
-polyA)两端加上黏性末端连成circle DNA就行了。我给这个公司打电话了,
minicircle DNA backbone有1.2 kb, 如果我直接连起来连这个1.2 kb都没有,更小。
就是不知道这两种format哪个表达更好
linear promoter-insert-polyA vs. circular promoter-insert-polyA

【在 h******y 的大作中提到】
: minicircle DNA的优势主要有两点。一是size小,转染效率高。二是最主要的,因为去
: 除了在bacterial中复制和筛选所需要的细菌DNA元件,从而降低了在真核细胞中被识别
: 成异源而排除的几率。有的minicircle DNA上加了S/MAR元件,从而可以以episome的形
: 式在细胞中长期存在,实现外源基因的长时表达。

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j*x
14
minicircle DNA的“backbone”只有几十bp,就只是两个重组臂的残留序列而已,你说
的1.2kb指的是parental plasmid,在最终的mcDNA里面是没有的。
线性片段不是不可以,但有几个问题:
1. 线性DNA的转染效率会显著低于超螺旋结构的DNA。
2. 细胞内的稳定性显著低于超螺旋闭环DNA,因为对DNase更敏感,更容易被降解。
3. 缺少稳定的大量制备方法(PCR?)

insert

【在 B***v 的大作中提到】
: 我现在想我可能不需要minicircle DNA, 我只需要把我的construct (promoter-insert
: -polyA)两端加上黏性末端连成circle DNA就行了。我给这个公司打电话了,
: minicircle DNA backbone有1.2 kb, 如果我直接连起来连这个1.2 kb都没有,更小。
: 就是不知道这两种format哪个表达更好
: linear promoter-insert-polyA vs. circular promoter-insert-polyA

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B*v
15
关于minicircle DNA的“backbone”我打电话问这个公司了,https://www.systembio.
com/,他们说1.2 kbp的backbone,不是parental,我觉得是可以更小的,但他们就这
么说的,我的insert 1.7的话,整个就2.9
你说的这个1,2,3都是对的。
我之所以想自己搞是因为如果我直接把insert连起来连这个1.2 kb都没有,更小,最精
简的表达单元。而且
minicircle DNA的制备很tricky,条件稍微不合适效率很低。我没有一手经验,这个公
司的人如是说。

【在 j****x 的大作中提到】
: minicircle DNA的“backbone”只有几十bp,就只是两个重组臂的残留序列而已,你说
: 的1.2kb指的是parental plasmid,在最终的mcDNA里面是没有的。
: 线性片段不是不可以,但有几个问题:
: 1. 线性DNA的转染效率会显著低于超螺旋结构的DNA。
: 2. 细胞内的稳定性显著低于超螺旋闭环DNA,因为对DNase更敏感,更容易被降解。
: 3. 缺少稳定的大量制备方法(PCR?)
:
: insert

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j*x
16
这个1.2是包含了全部的表达元件的,包括promoter和polyA,你自己做的话,这些也元
件少不了。当然理论上有可能做到比1.2更小,比如采用更短的promoter/polyA,但是
表达效果就未必能保证了。
mcDNA的制备很tricky没错,但你的线性DNA制备我个人觉得更不稳定。当然,你可以尝
试。我曾经用线性片段建稳转细胞株,效果比质粒强。

systembio.

【在 B***v 的大作中提到】
: 关于minicircle DNA的“backbone”我打电话问这个公司了,https://www.systembio.
: com/,他们说1.2 kbp的backbone,不是parental,我觉得是可以更小的,但他们就这
: 么说的,我的insert 1.7的话,整个就2.9
: 你说的这个1,2,3都是对的。
: 我之所以想自己搞是因为如果我直接把insert连起来连这个1.2 kb都没有,更小,最精
: 简的表达单元。而且
: minicircle DNA的制备很tricky,条件稍微不合适效率很低。我没有一手经验,这个公
: 司的人如是说。

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B*v
17
电话里告诉我的:
minicircle without insert 1.2k bp
CMV 350 bp (这个很小,一般600-700bp)
SV40polyA 131 bp(这个也很小)
总觉得这个1.2还包括其他东西。

【在 j****x 的大作中提到】
: 这个1.2是包含了全部的表达元件的,包括promoter和polyA,你自己做的话,这些也元
: 件少不了。当然理论上有可能做到比1.2更小,比如采用更短的promoter/polyA,但是
: 表达效果就未必能保证了。
: mcDNA的制备很tricky没错,但你的线性DNA制备我个人觉得更不稳定。当然,你可以尝
: 试。我曾经用线性片段建稳转细胞株,效果比质粒强。
:
: systembio.

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j*x
18
我自己构建的mcDNA,最终序列除了目的序列表达框,外源的只有不到50bp的重组臂序
列。
至于怎么设计最小化的表达框,就是你自己的事了。

【在 B***v 的大作中提到】
: 电话里告诉我的:
: minicircle without insert 1.2k bp
: CMV 350 bp (这个很小,一般600-700bp)
: SV40polyA 131 bp(这个也很小)
: 总觉得这个1.2还包括其他东西。

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