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Ng-Ago 重复进展（集合贴）

Ng-Ago 重复进展（集合贴）# Biology - 生物学

N*g2016-06-27 07:06

1 楼

☆─────────────────────────────────────☆
NiuEgg (NiuEgg) 于 (Mon Mar 30 19:50:55 2009) 提到:
一个sandisk 2GB的sd卡，一向在笔记本自带的读卡口能读不能写
今天拍了两张照片，再插进读卡口，会自动弹出选择窗口，
选定“open the folder..”后窗口一闪就没了 @@
再从computer去找这个盘，双击打开，还是一闪就没了。。这抽的什么风。。。
给出有效解决方案的有包子。。。。。。谢谢。。
☆─────────────────────────────────────☆
Jobman (剑狼) 于 (Mon Mar 30 19:51:41 2009) 提到:
rpwt
恩
搞个读卡器不就得了

☆─────────────────────────────────────☆
NiuEgg (NiuEgg) 于 (Mon Mar 30 19:52:00 2009) 提到:
这个木有包子。。。。
☆─────────────────────────────────

d*t2016-06-27 07:06

2 楼

转行是不是都很难啊？

F*l2016-06-27 07:06

3 楼

谢谢！
还有怎么样才能符合免费早餐？

l*u2016-06-27 07:06

4 楼

140/485 RD 02/19/14，等了三周半PP还是没成功，FP在之前就弄完了
更新一下

c*62016-06-27 07:06

5 楼

Hi all,
Does anyone have some exciting result using NgAgo. I have transfected the
293 cells with NgAgo and phosphorylated ssDNA targeted two genes, however,
there is no Indels at all. Even I did multiple transfections of ssDNA, no
positive result.
- 隐藏引用文字 -
On Tuesday, June 21, 2016 at 1:39:46 PM UTC-7, Aidan wrote:
Hi all,
I am trying out the NgAgo system in hard to transfect cells in which the
CRISPR-Cas9 system never produced any edits. I'm hoping for a non-coding
large deletion mediated by 2 cuts. As I am relatively inexperienced in
transfection I wanted to seek some advice on the amounts of ssDNA to
transfect etc.
I used electroporation (Nucleofector IIB) and pMaxGFP looks very good, >75%
transfected. However, I wasn't sure how much 5' P-ssDNA to transfect. Since
this nucleofector kit indicated 2 microg plasmid DNA, I tried various
amounts and ratios:
2 microg total, 1:1 ratio of plasmid to ssDNA --> 1 microg NgAgo
plasmid + 1 microg 5' P-ssDNA (500 ng each 24 mer)
2 microg total, 2:1 ratio of plasmid to ssDNA --> 1.333 migrog NgAgo
plasmid + 0.667 migrog 5' P-ssDNA (0.333 microg each 24 mer)
2.6 microg total, 1:1 ratio of plasmid to ssDNA --> 1.333 migrog NgAgo
plasmid + 1.333 migrog 5' P-ssDNA (0.667 microg each 24 mer)
Attached is the gel where I expected 579 bp Wt band and ~172 bp deletion
band. As you can see its all Wt.
Lane 1 - 100 bp ladder
Lane 2, 3 - PCR +ve controls
Lane 4, 5, 7 - NgAgo transfected with above DNA
Lane 6 - NgAgo transfected with just 5' P-ssDNA
Lane 8 - PCR -ve control
I will sequence the wt bands I got to see if there are small indels at each
24mer site - it could be that NgAgo won't create large deletions via 2 cut
sites? Also to double check that there are no SNPs overlapping the 24mers
that could affect targeting/cutting.
Any advice on how much 5' P-ssDNA to transfect would be great,
Thanks,
Aidan

l*a2016-06-27 07:06

6 楼

较难
但不是没有可能

【在 d********t 的大作中提到】

: 转行是不是都很难啊？

d*j2016-06-27 07:06

7 楼

points : no
points+cash: yes, you need to pay tax and resorts fee if any

s*z2016-06-27 07:06

8 楼

ｐａｔ　ｐａｔ
你这个不ｐｐ也快了把

【在 l*****u 的大作中提到】

: 140/485 RD 02/19/14，等了三周半PP还是没成功，FP在之前就弄完了
: 更新一下

c*62016-06-27 07:06

9 楼

Me again,
Tried a different region again in my cell type that I had edited
successfully with CRISPR-Cas9 in HEK293 (note that these are not the cells I
'm trying now). The guides are essentially the same except for 2 extra bp on
either side of the sgRNA sequence. Tried a number of different combinations
for nucleofection but no deletions. The first lane is PCR from edited
HEK293 gDNA that I had from before, the rest of the lanes are various
combinations of NgAgo plasmid with two 24mer 5'P guides.
Will do a side by side comparison with the sgRNAS in HEK293 cells but from
the other posts around here I'm seeing it doesn't look like it is going to
work.
So what is it? did they send the wrong plasmid? is there no nls even though
addgene has one annotated on their plasmid map? I've also sequenced the
whole Ago coding region in the plasmid and it matched the sequence from
addgene. double digest diagnostic gave the appropriate sized bands.
so what's the deal, are we missing something in the methods?? has anyone had
success with NgAgo? if so please let us know....
Aidan
附件 (1)
GM12878 - Ago_adG12.png
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发帖舍弃

p*22016-06-27 07:06

10 楼

可以转。很容易。我就从SDE成功转到SDET了。

【在 d********t 的大作中提到】

: 转行是不是都很难啊？

F*l2016-06-27 07:06

11 楼

Thanks!
One more question: How to get free breakfast?

【在 d**j 的大作中提到】

: points : no
: points+cash: yes, you need to pay tax and resorts fee if any

l*u2016-06-27 07:06

12 楼

借您的吉言了
2月份的可能还是要等等，1月份的应该比较快了
----------
发信人: sunspotzsz (Brave new life), 信区: EB23
标题: Re: TSC 140 pp没成功
发信站: BBS 未名空间站 (Mon Mar 24 21:52:45 2014, 美东)
ｐａｔ　ｐａｔ
你这个不ｐｐ也快了把

【在 l*****u 的大作中提到】

: 140/485 RD 02/19/14，等了三周半PP还是没成功，FP在之前就弄完了
: 更新一下

c*62016-06-27 07:06

13 楼

大家好，我分别用了来自韩春雨实验室的版本，自己将NgAgo移到PX330质粒的版本（前
后都加NLS），另外还有根据韩的文章给出的氨基酸序列，经过人源化密码子优化的版
本。三个版本分别与GFP的gDNA（韩paper里设计的gDNA）共染GFP阳性的293T stable
line，在293T细胞里做了韩春雨的G10 gDNA，在Cos7细胞里做了的TYR基因，另外还注
射了一大批卵，均无一个阳性结果。
在 2016年6月26日星期日 UTC+8上午4:28:02，。。。。 Zhou写道：

d*t2016-06-27 07:06

14 楼

转的好啊！

【在 p*****2 的大作中提到】

:
: 可以转。很容易。我就从SDE成功转到SDET了。

a*e2016-06-27 07:06

15 楼

Become gold status, google Hilton gold status

【在 F******l 的大作中提到】

: Thanks!
: One more question: How to get free breakfast?

L*82016-06-27 07:06

16 楼

时间还太短。我的rd　１／２４，第三次pp　３／１１递出，今天３／２４刚刚收到１
４０批准。

c*62016-06-27 07:06

17 楼

韩春雨的NgAgo进展如何?
我试了2次，没做出来。293里面G10.
第一次是共转质粒和G10，48小时收样品。
第二次是先共转质粒和G10，然后24小时再转了一次个G10.
想知道需要什么样的高超的实验技巧。

p*22016-06-27 07:06

18 楼

嗯。可惜再往回转就难了。

【在 d********t 的大作中提到】

: 转的好啊！

s*z2016-06-27 07:06

19 楼

你们公司真好啊，一次一次都给你做
第二次什么时候寄的啊？

【在 L********8 的大作中提到】

: 时间还太短。我的rd　１／２４，第三次pp　３／１１递出，今天３／２４刚刚收到１
: ４０批准。

c*62016-06-27 07:06

20 楼

Hi,
I tried a couple of transfections with the NgAgo plasmid from Addgene and
the 5'P oligo against GFP from the paper, but I did not see a dramatic
reduction in GFP+ as seen using Cas9 and a GFP sgRNA.
Anybody tried as well and came to the same (dead) end?
Davide

d*t2016-06-27 07:06

21 楼

勇往直前了你

【在 p*****2 的大作中提到】

:
: 嗯。可惜再往回转就难了。

c*i2016-06-27 07:06

22 楼

恭喜恭喜

c*62016-06-27 07:06

23 楼

Hi, Davide,
I tried the same plasmid that you used to target DYRK1A, HBA2, GATA4, which
are tested in Han's paper, but I didn't see any indel as they did. It seems
there is something wrong with this system.
Kyle

l*u2016-06-27 07:06

24 楼

这个。。。脸打得也太狠了吧
=======
发信人: caomei (准备开始新生活), 信区: EB23
标题: Re: TSC 140 pp没成功
发信站: BBS 未名空间站 (Mon Mar 24 22:12:40 2014, 美东)
恭喜恭喜

c*62016-06-27 07:06

25 楼

发信人: samalli (小米), 信区: Biology
标题: Re: 闊╂槬闆ㄧ殑NgAgo鏁堢巼鎬庝箞鏍凤紵鏈変汉璇曡繃涔堬紵
发信站: BBS 未名空间站 (Sat Jun 4 14:56:56 2016, 美东)
我试了两次，没有做出来，完全用韩写的protocol做的，而且试过了分别转质粒和
oligo。正对照是CRISPR-Cas9, target 同一个 exon，所以做的Surveyor assay 没问
题。
质粒的转染效率有80%，因为共转了EGFP质粒并做了FACS。
也许是我手臭吧。有没有共转质粒和ssDNA比较好的protocol？

l*u2016-06-27 07:06

26 楼

看到你弄了三次才成功...我打算再等等看了。也不太好意思让律师马上再弄一份，赶
着H1B旺季，也没收钱还要准备表格付Fedex。
--------
发信人: Lonestar78 (Lonestar), 信区: EB23
标题: Re: TSC 140 pp没成功
发信站: BBS 未名空间站 (Mon Mar 24 21:56:44 2014, 美东)
时间还太短。我的rd　１／２４，第三次pp　３／１１递出，今天３／２４刚刚收到１
４０批准。

c*62016-06-27 07:06

27 楼

发信人: raindallas (Never give up), 信区: Biology
标题: Re: 闊╂槬闆ㄧ殑NgAgo鏁堢巼鎬庝箞鏍凤紵鏈変汉璇曡繃涔堬紵
发信站: BBS 未名空间站 (Sat Jun 4 20:32:20 2016, 美东)
我也试了一次，没做出来。现在准备用他们的gata4来做positive control.
[在 samalli (小米) 的大作中提到：]
:我试了两次，没有做出来，完全用韩写的protocol做的，而且试过了分别转质粒和
:oligo。正对照是CRISPR-Cas9, target 同一个 exon，所以做的Surveyor assay 没问
:题。
:质粒的转染效率有80%，因为共转了EGFP质粒并做了FACS。
:也许是我手臭吧。有没有共转质粒和ssDNA比较好的protocol？
:天下熙熙，皆为利来；天下攘攘，皆为利往。

L*82016-06-27 07:06

28 楼

第二次是刚收到第一封reject的信，律师希望是tsc搞错了，接着pp了。第一次是２／
５递出的。给４５－６０天成功率高些吧。他们也是想挣这个钱的。

【在 s********z 的大作中提到】

: 你们公司真好啊，一次一次都给你做
: 第二次什么时候寄的啊？

c*62016-06-27 07:06

29 楼

发信人: samalli (小米), 信区: Biology
标题: Re: 韩春雨的NgAgo效率怎么样？有人试过么？
发信站: BBS 未名空间站 (Fri Jun 10 21:21:26 2016, 美东)
又做了一次，没有成功。我认识有个公司的人（CRISPR高手）也在试，试了两次没有成
功，我们分别独立设计的质粒
质粒是 pcDNA3.1-Flag-SV40NLS-NgAgo. C端没有tag， N端跟韩paper的primer序列完
全一样
用了IDT的5'phopspho-G10，用了韩的条件，也用了号称可以共转oligo和plasmid DNA非
常牛的mirus x2
转了1/10的GFP plasmid，FACS的转染效率 Lipo 2000 40%~50%， X2 转染效率 90%
拿到了韩放到 addgene的质粒
下周再试一次

C*n2016-06-27 07:06

30 楼

ME NEITHER

j*g2016-06-27 07:06

31 楼

刚开始韩春雨的文章发表，我也是支持者和粉丝，对质疑者很不满。现在觉得韩春雨在
北大和遗传所等的报告中强调必须高超的实验技巧才能做出来，就是为以后别人质疑他
重复不出来提前辩解。又说等他的2.0和smart版，感觉只是为了拖延时间。不然解释不
了，已经发表的文章、效率跟CRISPR差不多，为什么做不出来。连我这种手残党，按着
张锋的protocol、addgene上买来的质粒、做CRISPR一把就做出来了。
韩春雨在报告中反复强调他是初级版、需要高超的实验技巧、等他推出2.0版，实在让
人听了生疑。而且这些表述跟他发表的文章的描述、那么高的效率、以及methods &
materials部分也都是矛盾的，因为他描述的并不是什么复杂的实验，就是转染而已。
T7E1和测序也都是现成的。除非他故意删掉了关键的细节。但是这么说也讲不通，因为
发表文章的目的就是想要公开，何况这是方法学文章、故意隐藏细节不让他人重复，也
讲不通。
感觉韩春雨的泡泡要破灭了。
楼主挺积极的，干嘛不给nature biotechnology的编辑写信提出？editor让他解释的话
，我看韩春雨怎么解释。

C*52016-06-27 07:06

32 楼

支持楼主给nature biotechnology的编辑写信。

t*z2016-06-27 07:06

33 楼

楼主有心了，支持楼主给Nature Biotechnology写信。

I*p2016-06-27 07:06

34 楼

A more appropriate way is to write to the corresponding author first.

【在 t*****z 的大作中提到】

: 楼主有心了，支持楼主给Nature Biotechnology写信。

S*e2016-06-27 07:06

35 楼

重复不出来的结果太多了，质疑本身没有问题，不要太高调太傲气，自身修养先上去再
说别人。
不过楼主的亲身实验经历呢？为啥这么积极，搞个马甲专对付韩？

【在 j*********g 的大作中提到】

: 刚开始韩春雨的文章发表，我也是支持者和粉丝，对质疑者很不满。现在觉得韩春雨在
: 北大和遗传所等的报告中强调必须高超的实验技巧才能做出来，就是为以后别人质疑他
: 重复不出来提前辩解。又说等他的2.0和smart版，感觉只是为了拖延时间。不然解释不
: 了，已经发表的文章、效率跟CRISPR差不多，为什么做不出来。连我这种手残党，按着
: 张锋的protocol、addgene上买来的质粒、做CRISPR一把就做出来了。
: 韩春雨在报告中反复强调他是初级版、需要高超的实验技巧、等他推出2.0版，实在让
: 人听了生疑。而且这些表述跟他发表的文章的描述、那么高的效率、以及methods &
: materials部分也都是矛盾的，因为他描述的并不是什么复杂的实验，就是转染而已。
: T7E1和测序也都是现成的。除非他故意删掉了关键的细节。但是这么说也讲不通，因为
: 发表文章的目的就是想要公开，何况这是方法学文章、故意隐藏细节不让他人重复，也

t*z2016-06-27 07:06

36 楼

说的对，支持楼主亲自做实验。这样才有底气给编辑部写信。

: 重复不出来的结果太多了，质疑本身没有问题，不要太高调太傲气，自身修养先
上去再

: 说别人。

: 不过楼主的亲身实验经历呢？为啥这么积极，搞个马甲专对付韩？

【在 S**********e 的大作中提到】

: 重复不出来的结果太多了，质疑本身没有问题，不要太高调太傲气，自身修养先上去再
: 说别人。
: 不过楼主的亲身实验经历呢？为啥这么积极，搞个马甲专对付韩？

S*e2016-06-27 07:06

37 楼

而且一个人单挑性质疑不够，要找人把武器弹药准备好，然后群殴。
不让撤稿也得让其返修，至少把高超的技巧公开，不要浪费别人的时间和精力

【在 t*****z 的大作中提到】

: 说的对，支持楼主亲自做实验。这样才有底气给编辑部写信。
:
:
: 重复不出来的结果太多了，质疑本身没有问题，不要太高调太傲气，自身修养先
: 上去再
:
: 说别人。
:
: 不过楼主的亲身实验经历呢？为啥这么积极，搞个马甲专对付韩？
:

c*62016-06-27 07:06

38 楼

Myx
上午2:23（8 小时前）
我也刚试了一下。用了优化的密码子。转染的N2A 细胞。跟之前成功的一个px330比较
。发现NgAGo没有一点效果。郁闷。白白浪费了这么多钱和时间。

k*12016-06-27 07:06

39 楼

这个说的在理。
有质疑是好事情，但是像楼主这样，似乎成了职业黑了。是跟韩有什么过节吗？

【在 S**********e 的大作中提到】

c*62016-06-27 07:06

40 楼

W我还真不是职业黑，如果他的文章没有问题，那么真金不怕火炼。

【在 k*****1 的大作中提到】

: 这个说的在理。
: 有质疑是好事情，但是像楼主这样，似乎成了职业黑了。是跟韩有什么过节吗？

j*n2016-06-27 07:06

41 楼

貌似文章一发出来或者某人说如果solid后你就开始质疑了而且是没有任何根据的质疑
被怀疑是某人马甲或者枪手或者职业黑
也很正常

【在 c********6 的大作中提到】

: W我还真不是职业黑，如果他的文章没有问题，那么真金不怕火炼。

z*q2016-06-27 07:06

42 楼

不知道为何会有这么多人认为，一个所有实验室都重复不出来的文章，大家拿出来讨论
会是在黑，当你看到一个认为非常有希望的技术，热血沸腾的开始重复，花了一个月时
间每天熬夜做实验，最后发现根本就无法重复，刚开始你也许会认为是自己什么地方弄
错了，但是最后问了一圈，发现周边无数人在做，但是都重复不出来，你就会自然而然
的怒由心生，不知道浪费了多少人的时间和经费。其实，大家都不希望这篇文章出问题
，因为引起如此高的关注度的一篇文章，最后出了问题，那么中日韩三个国家就筹齐了
（你们懂的）。很多人在这里来讨论无法重复的目的，其实都是希望找到一个能够重复
出来的高人，站出来指点一二。
希望脑残粉们不要再出来说谁黑了谁，大家都是就事论事的讨论实验细节。

b*s2016-06-27 07:06

43 楼

大家不要太早下结论，只有完全重复韩的实验重复不出来才好下结论，楼上大都不是完
全重复，都有改动，比如不同种属的细胞、蛋白表达质粒等。建议已经失败的人再完全
重复一下韩的实验看看。

l*y2016-06-27 07:06

44 楼

重复过的都把怎么做的protocol贴出来吧

【在 b*****s 的大作中提到】

: 大家不要太早下结论，只有完全重复韩的实验重复不出来才好下结论，楼上大都不是完
: 全重复，都有改动，比如不同种属的细胞、蛋白表达质粒等。建议已经失败的人再完全
: 重复一下韩的实验看看。

S*e2016-06-27 07:06

45 楼

这个要支持

【在 z*******q 的大作中提到】

: 不知道为何会有这么多人认为，一个所有实验室都重复不出来的文章，大家拿出来讨论
: 会是在黑，当你看到一个认为非常有希望的技术，热血沸腾的开始重复，花了一个月时
: 间每天熬夜做实验，最后发现根本就无法重复，刚开始你也许会认为是自己什么地方弄
: 错了，但是最后问了一圈，发现周边无数人在做，但是都重复不出来，你就会自然而然
: 的怒由心生，不知道浪费了多少人的时间和经费。其实，大家都不希望这篇文章出问题
: ，因为引起如此高的关注度的一篇文章，最后出了问题，那么中日韩三个国家就筹齐了
: （你们懂的）。很多人在这里来讨论无法重复的目的，其实都是希望找到一个能够重复
: 出来的高人，站出来指点一二。
: 希望脑残粉们不要再出来说谁黑了谁，大家都是就事论事的讨论实验细节。

n*g2016-06-27 07:06

46 楼

这算什么黑，知乎上的讨论类似的负面，尚未有人跳出来说重复出来并测序验证了，清
一色的失败。实在看不出来这种实验需要什么高超的技巧

f*r2016-06-27 07:06

47 楼

I agree with you. This kind of molecule experiment needs no skill even a
high school kid can do very good ones. Only requirements are patient and
carefulness.

c*62016-06-27 07:06

48 楼

Patience and carefulness

【在 f******r 的大作中提到】

: I agree with you. This kind of molecule experiment needs no skill even a
: high school kid can do very good ones. Only requirements are patient and
: carefulness.

b*c2016-06-27 07:06

49 楼

https://groups.google.com/forum/#!topic/crispr/V1FALNbspCo

s*y2016-06-27 07:06

50 楼

我好奇的去看了一眼，刚刚有一个人出来说他做出来了。他的做法是用激酶来磷酸
化那个oligo，而不是从厂家订磷酸化的oligo。因为这个5'-end 磷酸化很关键，没有
磷酸化的Oligo不能被NgAgo识别。从理论上来说，如果oligo 的磷酸化不完全的话，就
有可能出现那些没有磷酸化的oligo和磷酸化的oligo 互相竞争结合基因上的位点而降
低酶的效率。所以弄不好这个磷酸化就是其中的技术要点。
貌似这个是目前第一个跳出来说重复出来了的人。静待更多的跟进报道。
----------------------------------------------------------
Jan Winter
5:34 PM (1 hour ago)
Hi guys,
Just had a couple of tests with ngago from addgene and custom Oligos, so I
did not try to reproduce the paper.
And in my hands I see an effect that is slightly less than using the same
target sequence region using the px459, but it works.
I phosphorylated the oligos using T4PNK and transferred 300 ngago per 24
well to hek293t cells.
Cheers
Jan
---------------------------------------------------------

【在 b******c 的大作中提到】

: https://groups.google.com/forum/#!topic/crispr/V1FALNbspCo

T*e2016-06-27 07:06

51 楼

在贴吧上灌水呢
http://tieba.baidu.com/p/4551838065

d*i2016-06-27 07:06

52 楼

这个做出来了说明韩没有造假！说实在的很高兴！没有重复出来的先别急着下结论。
回头看看韩的原文是怎么磷酸化的就知道是不是技术关键。

【在 s******y 的大作中提到】

: 我好奇的去看了一眼，刚刚有一个人出来说他做出来了。他的做法是用激酶来磷酸
: 化那个oligo，而不是从厂家订磷酸化的oligo。因为这个5'-end 磷酸化很关键，没有
: 磷酸化的Oligo不能被NgAgo识别。从理论上来说，如果oligo 的磷酸化不完全的话，就
: 有可能出现那些没有磷酸化的oligo和磷酸化的oligo 互相竞争结合基因上的位点而降
: 低酶的效率。所以弄不好这个磷酸化就是其中的技术要点。
: 貌似这个是目前第一个跳出来说重复出来了的人。静待更多的跟进报道。
: ----------------------------------------------------------
: Jan Winter
: 5:34 PM (1 hour ago)
: Hi guys,

C*l2016-06-27 07:06

53 楼

槐北路: 回复夜色镇卫兵 :现在的问题是，重复出来的谁满大街喊：我做出来啦--我
做出来啦--我知道的几家做的好的，我又不能替人家喊--人家是要闷着发paper的--而
做不出的反而到处问，加上一些别有用心的人煽风点火---顺便说，我这个新系统比cas
，还有ips刚出来的时候已经算是好很多了--我在改进，让稳定性更好

S*e2016-06-27 07:06

54 楼

这个可能，他们比较穷只能自己磷酸化。
不过难道订的会那么不完全吗？那得多不完全呢？

【在 s******y 的大作中提到】

s*y2016-06-27 07:06

55 楼

这个目前不好下结论。但是如果最后发现原因真的在这里的话，那么有一种可能性是那
些没有磷酸化的oligo 起的是非竞争性的抑制作用，比方说一种可能性就是可能会把催
化位点给卡住让正常的底物无法结合上去。

【在 S**********e 的大作中提到】

: 这个可能，他们比较穷只能自己磷酸化。
: 不过难道订的会那么不完全吗？那得多不完全呢？

S*e2016-06-27 07:06

56 楼

赶紧，那些重复不出来的人们赶紧试试，听起来有些刺激，同时也不可想象，少一个磷
酸基团就能死死卡住？希望能重复出来，DNA的功能就拓宽了许多。难道韩春雨在导演
过山车，逗你们玩，女主角的小心脏会被玩死的。。。

【在 s******y 的大作中提到】

:
: 这个目前不好下结论。但是如果最后发现原因真的在这里的话，那么有一种可能性是那
: 些没有磷酸化的oligo 起的是非竞争性的抑制作用，比方说一种可能性就是可能会把催
: 化位点给卡住让正常的底物无法结合上去。

s*y2016-06-27 07:06

57 楼

是不是这种可能性需要专门做这个事情的人去测试，看看没有５端磷酸化的gDNA到底有
没有抑制作用，以及到底是stoichiometric 还是sub-stoichiometric　inhibition。
如果是后者，那么基本上就是我说的那种情况了。

【在 S**********e 的大作中提到】

: 赶紧，那些重复不出来的人们赶紧试试，听起来有些刺激，同时也不可想象，少一个磷
: 酸基团就能死死卡住？希望能重复出来，DNA的功能就拓宽了许多。难道韩春雨在导演
: 过山车，逗你们玩，女主角的小心脏会被玩死的。。。

l*r2016-06-27 07:06

58 楼

你支得这招不知救了多少苦难千老了。

【在 s******y 的大作中提到】

C*l2016-06-27 07:06

59 楼

女主角。。。您指ningyouyou吧。。

【在 S**********e 的大作中提到】

H*S2016-06-27 07:06

60 楼

Calm down! Guys.
Why don't you write to Dr. Chunyu Han politely to ask for help first? If
there are tricks in the protocol, I am sure he will let you know. Following
his instruction or suggestion to do your experiments, even repeat his
experiments in the published paper, very likely, you will succeed. If you
still can not succeed, you might communicate further with Dr. Han for the
trouble shooting. If Dr. Han does not respond to these negative results, or
refuse to explain, then you might have a complete report letter to Nat.
Biotech. in order to draw the Editor's attention to deal with the concerns.
I hope everything will work out.

T*G2016-06-27 07:06

61 楼

胖老师的眼光很毒阿，好想做出来的group都是用激酶做的，如果是这个原因也是挺奇
葩的。
“Hi guys,
We have used this system and it works. We have followed the same protocol as
mentioned in the paper and were able to confirm knockout both on FACS as
well as western. We purified the oligos on gel after T4 PNK and saw the
phenotype after 48 and 72 h.“
cheers
debo

【在 s******y 的大作中提到】

j*g2016-06-27 07:06

62 楼

所谓做出来了是怎么做出来的？
测序了吗？看到切割了吗？
重复的fig4？
[在 sunnyday (胖头鱼。按斤卖就赚了) 的大作中提到：]
:我好奇的去看了一眼，刚刚有一个人出来说他做出来了。他的做法是用激酶来磷酸
:化那个oligo，而不是从厂家订磷酸化的oligo。因为这个5'-end 磷酸化很关键，
没有
:磷酸化的Oligo不能被NgAgo识别。从理论上来说，如果oligo 的磷酸化不完全的话，
就有可能出现那些没有磷酸化的oligo和磷酸化的oligo 互相竞争结合基因上的位点而降
:低酶的效率。所以弄不好这个磷酸化就是其中的技术要点。
:貌似这个是目前第一个跳出来说重复出来了的人。静待更多的跟进报道。
:Jan Winter
:Hi guys,
:Just had a couple of tests with ngago from addgene and custom Oligos, so I
did not try to reproduce the paper.
:And in my hands I see an effect that is slightly less than using the same
:target sequence region using the px459, but it works.
:..........

j*g2016-06-27 07:06

63 楼

这是重复的fig3c 这个国内也有实验室能做出来而且只转gDNA也能看到轻微下调
fig4 测序看到切割是关键
[在 TSG (Now we are one!) 的大作中提到：]
:胖老师的眼光很毒阿，好想做出来的group都是用激酶做的，如果是这个原因也是挺奇
:葩的。
:“Hi guys,
:We have used this system and it works. We have followed the same protocol
as mentioned in the paper and were able to confirm knockout both on FACS as
:well as western. We purified the oligos on gel after T4 PNK and saw the
:phenotype after 48 and 72 h.“
:cheers
:debo

C*52016-06-27 07:06

64 楼

对的，很多人能够重复出figure3.但是，这篇文章的重点是figure4!进行基因编辑！

C*52016-06-27 07:06

65 楼

而且我们没有针对韩老师的意思。只是就文章进行讨论。
假设这篇文章是11g发表的，我们如果也重复不出来。也会有大量的讨论的帖子。
因为这个领域实在是太火了，门槛太低了。大家都跃跃欲试。

c*62016-06-27 07:06

66 楼

我也好奇的看了一下所谓重复出来了的人，没有测序结果，为什么不去测序呢？

j*i2016-06-27 07:06

67 楼

有人重复出来了
Hi guys,
We have used this system and it works. We have followed the same protocol as
mentioned in the paper and were able to confirm knockout both on FACS as
well as western. We purified the oligos on gel after T4 PNK and saw the
phenotype after 48 and 72 h.
cheers
debo

j*g2016-06-27 07:06

68 楼

他就是重复的fig3c啊，FACS和western看GFP
这个能重复（不排除假阳性）
fig4重复不了，切割基因组（需要T7E1和测序）。不能切基因组，这个技术就站不住脚
了。

as

【在 j******i 的大作中提到】

: 有人重复出来了
: Hi guys,
: We have used this system and it works. We have followed the same protocol as
: mentioned in the paper and were able to confirm knockout both on FACS as
: well as western. We purified the oligos on gel after T4 PNK and saw the
: phenotype after 48 and 72 h.
: cheers
: debo

c*62016-06-27 07:06

69 楼

外源基因在细胞的培养过程中是有可能被沉默的，一旦沉默了，你的FACS和Western结
果当然会显示下调。这里所需要的最关键的结果是测序

as

【在 j******i 的大作中提到】

c*62016-06-27 07:06

70 楼

确实并没有排除假阳性。他是用GFP的表达来显示表达GFP的那段基因组序列有没有被破
坏掉，那么就有两种可能性，第一是GFP的基因组片段被破坏，第二表达GFP的mRNA被破
坏，第三种是GFP基因组序列被修饰沉默（这个我在hiPS细胞上发现过，很多时候如果
GFP自带promoter的话，这个promoter有被随机沉默的可能性。另外即使是把GFPknock-
in到某个蛋白的内部，也是有可能被沉默掉，这个我听一个中科院的人讲过，机理不清
楚）。对于第二种可能性，因为他是用磷酸化酶处理oligo，很有可能这个处理不完全
，还含有大量未被磷酸化的oligo，他的对照应该是那种没有通过磷酸化的oligo，确保
不是因为RNA破坏了mRNA。还是等他们的基因组测序结果吧

【在 j*********g 的大作中提到】

: 他就是重复的fig3c啊，FACS和western看GFP
: 这个能重复（不排除假阳性）
: fig4重复不了，切割基因组（需要T7E1和测序）。不能切基因组，这个技术就站不住脚
: 了。
:
: as

c*62016-06-27 07:06

71 楼

确保不是因为未被磷酸化的Oligo引起的RNAi,更正笔误

GFPknock-

【在 c********6 的大作中提到】

: 确实并没有排除假阳性。他是用GFP的表达来显示表达GFP的那段基因组序列有没有被破
: 坏掉，那么就有两种可能性，第一是GFP的基因组片段被破坏，第二表达GFP的mRNA被破
: 坏，第三种是GFP基因组序列被修饰沉默（这个我在hiPS细胞上发现过，很多时候如果
: GFP自带promoter的话，这个promoter有被随机沉默的可能性。另外即使是把GFPknock-
: in到某个蛋白的内部，也是有可能被沉默掉，这个我听一个中科院的人讲过，机理不清
: 楚）。对于第二种可能性，因为他是用磷酸化酶处理oligo，很有可能这个处理不完全
: ，还含有大量未被磷酸化的oligo，他的对照应该是那种没有通过磷酸化的oligo，确保
: 不是因为RNA破坏了mRNA。还是等他们的基因组测序结果吧

s*y2016-06-27 07:06

72 楼

你说得对，要确认成功的话必须用测序。用WB, FACS之类的技术来测量效果是有可能是
假阳性。

GFPknock-

【在 c********6 的大作中提到】

b*12016-06-27 07:06

73 楼

说实话，看得人胆战心惊的，韩自己也不出来解释一下，知道一下到底咋回事。想把这
个试剂卖到全世界跟张峰他们一样，服务意识要加强啊。看看人家张峰他们怎么干的。

【在 s******y 的大作中提到】

: 你说得对，要确认成功的话必须用测序。用WB, FACS之类的技术来测量效果是有可能是
: 假阳性。
:
: GFPknock-

s*y2016-06-27 07:06

74 楼

这个也不能拿张峰来做标准吧，张的组里有几十个博士后和学生呢，韩就一个学生。而
且韩的那个学生都已经毕业了，只不过是暂时留在那里做完那篇文章而已。他肯定是不
会有这个能力来解答那么多疑问的。

【在 b*********1 的大作中提到】

: 说实话，看得人胆战心惊的，韩自己也不出来解释一下，知道一下到底咋回事。想把这
: 个试剂卖到全世界跟张峰他们一样，服务意识要加强啊。看看人家张峰他们怎么干的。

l*r2016-06-27 07:06

75 楼

你这些都是技术问题。你什么时候见过ceo给客户回答技术问题？

【在 b*********1 的大作中提到】

S*e2016-06-27 07:06

76 楼

当CEO只卖一个新技术的时候，当技术被人质疑的时候

【在 l******r 的大作中提到】

: 你这些都是技术问题。你什么时候见过ceo给客户回答技术问题？

S*e2016-06-27 07:06

77 楼

fig3c是什么道理？DNA也会knockdown？

【在 j*********g 的大作中提到】

s*y2016-06-27 07:06

78 楼

他说的只是在一个理论上的可能性。
其实如果能够做到非常显著的降低GFP 信号而对照组却没有这么明显的降低的话，那么
有七八成把握可以认为是切除了，但是还是有一些其他因素需要排除，所以需要最后一
步用测序来做确定。但是要做侧序的话需要把细胞单克隆分离出来，需要花不少时间，
有些人就会偷懒不做这最后一步。

【在 S**********e 的大作中提到】

: fig3c是什么道理？DNA也会knockdown？

l*r2016-06-27 07:06

79 楼

那也是ceo派手下技术部门人员去解答。ceo本人不会出面解答的。

【在 S**********e 的大作中提到】

: 当CEO只卖一个新技术的时候，当技术被人质疑的时候

j*i2016-06-27 07:06

80 楼

现在不用这么麻烦了做个pcr 然后sanger测序就可以了用tide分析

【在 s******y 的大作中提到】

: 他说的只是在一个理论上的可能性。
: 其实如果能够做到非常显著的降低GFP 信号而对照组却没有这么明显的降低的话，那么
: 有七八成把握可以认为是切除了，但是还是有一些其他因素需要排除，所以需要最后一
: 步用测序来做确定。但是要做侧序的话需要把细胞单克隆分离出来，需要花不少时间，
: 有些人就会偷懒不做这最后一步。

s*y2016-06-27 07:06

81 楼

如果被切掉了PCR是不能覆盖过去的吧？除非我猜错你了打算怎么做。

【在 j******i 的大作中提到】

: 现在不用这么麻烦了做个pcr 然后sanger测序就可以了用tide分析

z*q2016-06-27 07:06

82 楼

如果这篇文章只是做出来Fig3c的话，根本没有人会去关注他，关键data是Fig4，他能
够引起所有人注意的一个点在于，设计的几十个基因位点无一例外，全部都能够惊人的
高效切割内源DNA，所谓重复出来的同志们，关键是要重复Fig4切割内源基因，并且有
测序的结果。韩也在电话里说了（第三军医大的一小伙给韩打了电话，并录音），
review重复出来了他的Fig3c，我并不怀疑Fig3c的结果，并且也不在意Fig3c的结果，
我们关注的还是内源基因！电话录音里韩一个劲叫人做Fig3c，但是明明Fig4才是关键
，如果用Cas9的话，一个没有基础的实习生，只需要两个星期的训练，便能够做出一个
漂亮的T7E1和测序的data。转染和T7E1都不是需要多么高超技巧的技术，令人纳闷的是
，为何如此多熟练操作基因编辑的实验室，都无法重复出内源基因的knock-out。

j*i2016-06-27 07:06

83 楼

肉眼看是乱七八糟的peaks 但是可以用算法区分开参加这篇NAR:http://nar.oxfordjournals.org/content/early/2014/10/08/nar.gku936.full

【在 s******y 的大作中提到】

: 如果被切掉了PCR是不能覆盖过去的吧？除非我猜错你了打算怎么做。

s*y2016-06-27 07:06

84 楼

我总觉得还是直接的测量更可靠，用算法来区分的话其实还是间接数据。

【在 j******i 的大作中提到】

: 肉眼看是乱七八糟的peaks 但是可以用算法区分开参加这篇NAR:http://nar.oxfordjournals.org/content/early/2014/10/08/nar.gku936.full

j*i2016-06-27 07:06

85 楼

我也是纳闷呢 fig3c和fig4技术上没有差别但是fig4才是关键的实验可能他自己也清
楚1.0版本敲除内源基因效率比较低需要特别优化
他说2.0版一两个月就能出来但是这么多人重复不出来他的第二篇文章应该没那么容
易过review的吧

【在 z*******q 的大作中提到】

: 如果这篇文章只是做出来Fig3c的话，根本没有人会去关注他，关键data是Fig4，他能
: 够引起所有人注意的一个点在于，设计的几十个基因位点无一例外，全部都能够惊人的
: 高效切割内源DNA，所谓重复出来的同志们，关键是要重复Fig4切割内源基因，并且有
: 测序的结果。韩也在电话里说了（第三军医大的一小伙给韩打了电话，并录音），
: review重复出来了他的Fig3c，我并不怀疑Fig3c的结果，并且也不在意Fig3c的结果，
: 我们关注的还是内源基因！电话录音里韩一个劲叫人做Fig3c，但是明明Fig4才是关键
: ，如果用Cas9的话，一个没有基础的实习生，只需要两个星期的训练，便能够做出一个
: 漂亮的T7E1和测序的data。转染和T7E1都不是需要多么高超技巧的技术，令人纳闷的是
: ，为何如此多熟练操作基因编辑的实验室，都无法重复出内源基因的knock-out。

j*i2016-06-27 07:06

86 楼

有做过比较的这个方法靠谱的当然有的人还是倾向老方法像你说的挑克隆和T7EI等

【在 s******y 的大作中提到】

: 我总觉得还是直接的测量更可靠，用算法来区分的话其实还是间接数据。

l*y2016-06-27 07:06

87 楼

这年头直接ngs算了，过两天还没人重复出来我有空也做一个

F*M2016-06-27 07:06

88 楼

NATURE METHODS | RESEARCH HIGHLIGHTS
Arrival of the Argonautes
Richard Pattison
Nature Methods 13, 546 (2016) doi:10.1038/nmeth.3917
Published online 29 June 2016
http://www.nature.com.proxy2.cl.msu.edu/nmeth/journal/v13/n7/full/nmeth.3917.html

j*g2016-06-27 07:06

89 楼

一篇研究论文配发的评论而已，能说明什么呢？
如果这篇文章本身重复不出来，有什么用？
[在 FNBM (FNBM) 的大作中提到：]
:NATURE METHODS | RESEARCH HIGHLIGHTS
:Arrival of the Argonautes
:Richard Pattison
:Nature Methods 13, 546 (2016) doi:10.1038/nmeth.3917
:Published online 29 June 2016
:http://www.nature.com.proxy2.cl.msu.edu/nmeth/journal/v13/n7/full/nmeth.3917.html

S*e2016-06-27 07:06

90 楼

那么韩现在数据的真实性有七八成，那很高啊！如果切了之后有的人还能检测到，有的
人却检测不到有没有这种可能性？
DNA确实切开了，但是强大的repair功能给修回DNA组裏去了，到了一个随机的位点躲起
来偷着乐？

【在 s******y 的大作中提到】

l*i2016-06-27 07:06

91 楼

我知道国内有一部分科研人员（有几个还是在国内外很有名气的那种），为了抢某个发
现的优先权，会人为的“操作”某些实验过程及其结果，以使自己的文章最快发出来。
因为这些人知道，这个发现是很有可能正确的，只是囿于某些条件限制，领域内一直进
展不大，但是通过人为的“操作”数据，自己就可以把这个成果最先发表出来；过不了
多久，自己或其他实验室做了进一步的完善和重复，就没有人会去追究第一篇文章是否
有“夸大其词”甚至造假的问题了。
我现在担心的是韩可能也采取了这种策略：基于2014年的文章，可以明确存在合适的
DNA-guide 的Ago, 但一时找不到确实有效的蛋白，于是采取“夸大其词”的手段，过
度解读自己的结果（这里我不愿猜测其造假），目的就是为了尽早把这个概念性的文章
发表出来，取得时间差上的优势，然后再慢慢优化系统，寻找真有有效的蛋白。这样一
来，首发权就拿到了。
前段时间闹得沸沸扬扬的张生家事件，就是这种行为的典型注解。

j*i2016-06-27 07:06

92 楼

有可能颜宁一开始突兀的质疑可能是她身处那样的环境多少耳闻了国内一些PI的作为
是真是假估计一个月以内就水落石出了

【在 l*******i 的大作中提到】

: 我知道国内有一部分科研人员（有几个还是在国内外很有名气的那种），为了抢某个发
: 现的优先权，会人为的“操作”某些实验过程及其结果，以使自己的文章最快发出来。
: 因为这些人知道，这个发现是很有可能正确的，只是囿于某些条件限制，领域内一直进
: 展不大，但是通过人为的“操作”数据，自己就可以把这个成果最先发表出来；过不了
: 多久，自己或其他实验室做了进一步的完善和重复，就没有人会去追究第一篇文章是否
: 有“夸大其词”甚至造假的问题了。
: 我现在担心的是韩可能也采取了这种策略：基于2014年的文章，可以明确存在合适的
: DNA-guide 的Ago, 但一时找不到确实有效的蛋白，于是采取“夸大其词”的手段，过
: 度解读自己的结果（这里我不愿猜测其造假），目的就是为了尽早把这个概念性的文章
: 发表出来，取得时间差上的优势，然后再慢慢优化系统，寻找真有有效的蛋白。这样一

S*e2016-06-27 07:06

93 楼

美国很多都是，炒作概念，理论走在实践前面。但是经常做让别人精力和财力都无法重
复的课题，不了了之。比如临床样本，搞个统计学意义，谁知道是真是假。或者拉帮结
派，合伙炒作。

【在 l*******i 的大作中提到】

m*c2016-06-27 07:06

94 楼

典型反例:Theranos...

【在 S**********e 的大作中提到】

: 当CEO只卖一个新技术的时候，当技术被人质疑的时候

l*r2016-06-27 07:06

95 楼

反例！=普世

【在 m****c 的大作中提到】

: 典型反例:Theranos...

c*62016-06-27 07:06

96 楼

看韩春雨在国内贴吧上的回复，觉得此人有点问题啊，老是不愿意给那些无法重复出来
的人提供帮助，老是转移话题说需要高超的技巧，你系统不成熟的话，那你的文章中那
么多基因的editing是怎么做到的？不知道是mental还是psychological的问题

p*l2016-06-27 07:06

97 楼

之前还比较反对你的看法，现在看来好像还确实有那么点。
不过韩说的也有道理，如果他是刻意造假了，为啥还第一时间把质粒分发和送给
addgene？这不是等着拆穿吗？更符合的情况应该是拖着不给啊.. 我没有投过NBT，这
是不是NBT的要求？
我觉得如果最后重复不出来，最有可能的情况是假阳性，不会是蓄意造假。

【在 c********6 的大作中提到】

: 看韩春雨在国内贴吧上的回复，觉得此人有点问题啊，老是不愿意给那些无法重复出来
: 的人提供帮助，老是转移话题说需要高超的技巧，你系统不成熟的话，那你的文章中那
: 么多基因的editing是怎么做到的？不知道是mental还是psychological的问题

c*62016-06-27 07:06

98 楼

如果是假阳性，那他的测序结果是怎么得来的

【在 p**********l 的大作中提到】

: 之前还比较反对你的看法，现在看来好像还确实有那么点。
: 不过韩说的也有道理，如果他是刻意造假了，为啥还第一时间把质粒分发和送给
: addgene？这不是等着拆穿吗？更符合的情况应该是拖着不给啊.. 我没有投过NBT，这
: 是不是NBT的要求？
: 我觉得如果最后重复不出来，最有可能的情况是假阳性，不会是蓄意造假。

l*C2016-06-27 07:06

99 楼

老板不做实验不知道每一步细节很正常

【在 c********6 的大作中提到】

c*62016-06-27 07:06

100 楼

那他不做实验不知道细节，为什么他又知道高超的技巧呢？这个很明显逻辑不通啊。当
他说出高超技巧这四个字的时候就已经表明他是了解哪些地方的细节是需要特别注意的

【在 l***C 的大作中提到】

: 老板不做实验不知道每一步细节很正常

j*n2016-06-27 07:06

101 楼

他实验室现在就一个硕士后？
觉得大部分试验应该是他自己做的

【在 l***C 的大作中提到】

: 老板不做实验不知道每一步细节很正常

n*k2016-06-27 07:06

102 楼

主要这个实验都是分子生物学基本的操作，Cas9的随便都能做出来，他的我们这重复不
出来。曾经看人做高压冷冻固定后制样，之后切片电镜下做3D结构，那个没有几个月的
训练确实做不好。

【在 c********6 的大作中提到】

: 那他不做实验不知道细节，为什么他又知道高超的技巧呢？这个很明显逻辑不通啊。当
: 他说出高超技巧这四个字的时候就已经表明他是了解哪些地方的细节是需要特别注意的

v*e2016-06-27 07:06

103 楼

就怕学生受不了压力，操作了一下数据。

d*m2016-06-27 07:06

104 楼

测序这锅学生可背不动啊

【在 v*******e 的大作中提到】

: 就怕学生受不了压力，操作了一下数据。

F*n2016-06-27 07:06

105 楼

那个google group里不是有个烙印做出来了，用的国内一家卖的ngago

【在 c********6 的大作中提到】

j*g2016-06-27 07:06

106 楼

测序，测序，测序！
你是学生物的吗？
[在 Fulton (富二代) 的大作中提到：]
:那个google group里不是有个烙印做出来了，用的国内一家卖的ngago

d*m2016-06-27 07:06

107 楼

烙印目前在测序。话说烙印怎么会去国内的小公司买这个质粒而不是去addgene，好精
彩的篇章啊感觉。

【在 F****n 的大作中提到】

: 那个google group里不是有个烙印做出来了，用的国内一家卖的ngago

v*g2016-06-27 07:06

108 楼

我在国内，发过好几次邮件过去联系都没有回音。

d*m2016-06-27 07:06

109 楼

中文发的？试试英文。
一UPENN的朋友一开始也是用中文发求建议，没有会回。后来隔了一个星期用英文再发
了一封，隔夜就回了。

【在 v*********g 的大作中提到】

: 我在国内，发过好几次邮件过去联系都没有回音。

S*e2016-06-27 07:06

110 楼

这还不容易吗？把crisp和gRNA加到实验组不就可以了，反正ngago和crisp的味道闻起
来可能没有区别，韩老师也不知道。怎么重复怎么有！

【在 d********m 的大作中提到】

: 测序这锅学生可背不动啊

j*g2016-06-27 07:06

111 楼

怎么证明就是学生加的？为什么不能是韩老师加的呢？

【在 S**********e 的大作中提到】

: 这还不容易吗？把crisp和gRNA加到实验组不就可以了，反正ngago和crisp的味道闻起
: 来可能没有区别，韩老师也不知道。怎么重复怎么有！

c*62016-06-27 07:06

112 楼

这样看起来韩春雨还有点瞧不起中国人啊。这个不知道怎么评价。
关键是他是给人家怎么回复的呢？他给的建议对人家的实验有帮助吗

【在 d********m 的大作中提到】

: 中文发的？试试英文。
: 一UPENN的朋友一开始也是用中文发求建议，没有会回。后来隔了一个星期用英文再发
: 了一封，隔夜就回了。

d*t2016-06-27 07:06

113 楼

韩自己回复搬运如下，他自己也承认图四有难度：槐北路 1
12楼今天 16:22
操作
我目前仍只有一个做实验的小团队，无法做好服务性工作，一天十几个个电话我都是重
复的以下内容：----所谓
高超的技巧，其实也很简单，细胞做好检测，不要有寄生菌污染，不要有支原体污染（
Ago系统对污染特别敏
感---特别是单转guide假阳性---我非常确定在没有污染的情况下，单转guid不会影响
GFP表达，假阴性也大多因为细胞污染，假阳性和假阴性我都遇到过，国内买的细胞我
就不吐槽了），转染用的质粒质量要好（可用30ngGFP转细胞，若是均一且效率高表明
质量好，强弱不均一则表明质量差，越不均一表明质量越差），guide磷酸化完全（没
有磷酸化不能load和切割---谢谢印证我的Fig2结果，至于怎么检测，自己跑个PAGE看
看---），特别的，对于Fig4，也是几乎惟一算是有难度的，就是控制转染时的细胞密
度和用血清控制细胞生长，时间稍长，毕竟NgAgo未经过系统的密码子优化---照着
online method上protocol for genome editing and T7E1做（小经验，PCR最好不要有
引物二聚体，如果引物二聚体多请重设引物；PCR产物直接回收最好不跑胶回收，可能
跟ago切24bp有关，设好对照！）---银染分辨率高，可以排除T7E1假阳性，能做出预期
条带后请用PCR产物去测序--------欢迎大家广泛使用此系统，并分享成功经验和失败
教训。附，addgen上的质粒，可
以直接用作基因组编辑。再次强调，不加NgAgo，就能抑制GFP，是假阳性，是细胞出问
题了（谢天谢地不但
我自己而且审稿人也有这个对照）出现假阳性的细胞切基因组就没戏了。对于Fig4，若
是不习惯做银染，也可
以直接做KI：doner 用GFPcoden+polyA signal，前后加几个保护性的碱基---从GFP-N1
扩出来连到T-vector上，再从此doner-Tvector上扩（防止GFP-N1污染的假阳性）出来
纯化，500-800ng共转（for each well of 24 well plate）。

d*t2016-06-27 07:06

114 楼

http://www.zhihu.com/question/46 ... mp;isappinstalled=0
请大家从实验角度评述一下

z*q2016-06-27 07:06

115 楼

knock-in我倒还一直没尝试过，回头空了我再试一次knock-in，转染后养一两星期，把
GFP的细胞拿去sorting出来，然后PCR鉴定一下。这个比T7E1检测容易一点。

【在 d******t 的大作中提到】

: 韩自己回复搬运如下，他自己也承认图四有难度：槐北路 1
: 12楼今天 16:22
: 操作
: 我目前仍只有一个做实验的小团队，无法做好服务性工作，一天十几个个电话我都是重
: 复的以下内容：----所谓
: 高超的技巧，其实也很简单，细胞做好检测，不要有寄生菌污染，不要有支原体污染（
: Ago系统对污染特别敏
: 感---特别是单转guide假阳性---我非常确定在没有污染的情况下，单转guid不会影响
: GFP表达，假阴性也大多因为细胞污染，假阳性和假阴性我都遇到过，国内买的细胞我
: 就不吐槽了），转染用的质粒质量要好（可用30ngGFP转细胞，若是均一且效率高表明

z*q2016-06-27 07:06

116 楼

knock-in倒还真没做过，回头做一个knock-in,转染之后把细胞养一两个星期，拿去
sorting一下GFP阳性的细胞，再PCR鉴定和测序。

【在 d******t 的大作中提到】

c*62016-06-27 07:06

117 楼

说到底还是没有人重复出来
韩春雨老师就是在自己打自己的嘴巴，什么Fig4有难度，不好重复，都是鬼话，真那么
有难度，请问他是怎么做到的能够精准的切割50个位点？

n*s2016-06-27 07:06

118 楼

你自己打电话去问他呗。你明显不懂这一块，还整天上蹿下跳，挺有意思的。
大家做生物的都有压力，心情都不好，这很正常。但是因此而彻底扭曲了自己的性格，
可就不好咯。韩春雨的东西真也好假也好跟你真的有关系么？

【在 c********6 的大作中提到】

: 说到底还是没有人重复出来
: 韩春雨老师就是在自己打自己的嘴巴，什么Fig4有难度，不好重复，都是鬼话，真那么
: 有难度，请问他是怎么做到的能够精准的切割50个位点？

c*62016-06-27 07:06

119 楼

你还真想得开啊，作为一个中国人，他这样明目张胆的造假，损坏的不仅仅是他个人的
形象，损坏的是所有中国人和华裔的形象。你去看看还有哪一篇中国人发表的文章有这
么大嫌疑的？唯一能够媲美的是日本的小保方晴子和韩国的黄钰锡。

【在 n****s 的大作中提到】

: 你自己打电话去问他呗。你明显不懂这一块，还整天上蹿下跳，挺有意思的。
: 大家做生物的都有压力，心情都不好，这很正常。但是因此而彻底扭曲了自己的性格，
: 可就不好咯。韩春雨的东西真也好假也好跟你真的有关系么？

P*R2016-06-27 07:06

120 楼

拿人种来说事不妥。
就事论事。
韩至今无法圆其说，基本上已经出局了。
反正他也不准备在世界一流里面混的，在三流大学里做个教授就心安理得了。

【在 c********6 的大作中提到】

: 你还真想得开啊，作为一个中国人，他这样明目张胆的造假，损坏的不仅仅是他个人的
: 形象，损坏的是所有中国人和华裔的形象。你去看看还有哪一篇中国人发表的文章有这
: 么大嫌疑的？唯一能够媲美的是日本的小保方晴子和韩国的黄钰锡。

c*62016-06-27 07:06

121 楼

没有拿人种来说事，主要是这几位有点出格了。

【在 P****R 的大作中提到】

: 拿人种来说事不妥。
: 就事论事。
: 韩至今无法圆其说，基本上已经出局了。
: 反正他也不准备在世界一流里面混的，在三流大学里做个教授就心安理得了。

c*62016-06-27 07:06

122 楼

7月16日mfp
I took a brief look at the original paper.
I'll just say this: when a scientist does an anti-GFP western blot to show
that there experimental system works to cut GFP, you have to seriously
question their scientific process....

【在 c********6 的大作中提到】

: Hi all,
: Does anyone have some exciting result using NgAgo. I have transfected the
: 293 cells with NgAgo and phosphorylated ssDNA targeted two genes, however,
: there is no Indels at all. Even I did multiple transfections of ssDNA, no
: positive result.
: - 隐藏引用文字 -
: On Tuesday, June 21, 2016 at 1:39:46 PM UTC-7, Aidan wrote:
: Hi all,
: I am trying out the NgAgo system in hard to transfect cells in which the
: CRISPR-Cas9 system never produced any edits. I'm hoping for a non-coding