r*e
2 楼
用qPCR研究一段intron的表达以及功能。intron有两个区域，region1和region2；针对
这两个region分别设计了对应了primer进行扩增，primer长度都是100-200bp左右
提取了同一种cell line的genomic DNA和total RNA
我用genomic DNA作为对照。对于gDNA，region1和region2的Ct值差不多，都是25
我也用了plasmid做对照，也是差不多的Ct值
而对于cDNA，region1和region2的Ct值分别是28和30
两对引物都做了standard curve，在25-30这个范围内efficiency都是100%左右。对于
genomic DNA／plasmid，两个region都是同样的量，引物效率都是100%，所以最后相同
的Ct值。而cDNA有两个cycle的差别，是不是意味着region1产生的RNA的量更多呢？
如果是的话，我能想到的可能性时有：
1.region1除了pre－mRNA之外还存在着其他的RNA比如lncRNA
2.region1在被splice形成RNA lariat之后相比于region2更佳stable
PCR的假阳性很多，所以请教大家我以上的做法是否足够严谨到给出region1有更多RNA
的结论？
另外我也查过一些网上公共RNA－seq数据。问题是一般这些数据的depth都很低；而对
于Ct 28左右的RNA，或许丰度比较低，属于rare transcript所以压根没法被RNA－seq
显示出来？
非常感谢！
这两个region分别设计了对应了primer进行扩增，primer长度都是100-200bp左右
提取了同一种cell line的genomic DNA和total RNA
我用genomic DNA作为对照。对于gDNA，region1和region2的Ct值差不多，都是25
我也用了plasmid做对照，也是差不多的Ct值
而对于cDNA，region1和region2的Ct值分别是28和30
两对引物都做了standard curve，在25-30这个范围内efficiency都是100%左右。对于
genomic DNA／plasmid，两个region都是同样的量，引物效率都是100%，所以最后相同
的Ct值。而cDNA有两个cycle的差别，是不是意味着region1产生的RNA的量更多呢？
如果是的话，我能想到的可能性时有：
1.region1除了pre－mRNA之外还存在着其他的RNA比如lncRNA
2.region1在被splice形成RNA lariat之后相比于region2更佳stable
PCR的假阳性很多，所以请教大家我以上的做法是否足够严谨到给出region1有更多RNA
的结论？
另外我也查过一些网上公共RNA－seq数据。问题是一般这些数据的depth都很低；而对
于Ct 28左右的RNA，或许丰度比较低，属于rare transcript所以压根没法被RNA－seq
显示出来？
非常感谢！
p*t
3 楼
擦玻璃貌似不是cleaning lady能做的吧
l*y
4 楼
就当都是真的，then what？你的big picture是啥？做功能的话knockdown有表型吗？
纠结在一个实验上没意义，得综合其他方面看
【在 r**********e 的大作中提到】
: 用qPCR研究一段intron的表达以及功能。intron有两个区域，region1和region2；针对
: 这两个region分别设计了对应了primer进行扩增，primer长度都是100-200bp左右
: 提取了同一种cell line的genomic DNA和total RNA
: 我用genomic DNA作为对照。对于gDNA，region1和region2的Ct值差不多，都是25
: 我也用了plasmid做对照，也是差不多的Ct值
: 而对于cDNA，region1和region2的Ct值分别是28和30
: 两对引物都做了standard curve，在25-30这个范围内efficiency都是100%左右。对于
: genomic DNA／plasmid，两个region都是同样的量，引物效率都是100%，所以最后相同
: 的Ct值。而cDNA有两个cycle的差别，是不是意味着region1产生的RNA的量更多呢？
: 如果是的话，我能想到的可能性时有：
纠结在一个实验上没意义，得综合其他方面看
【在 r**********e 的大作中提到】
: 用qPCR研究一段intron的表达以及功能。intron有两个区域，region1和region2；针对
: 这两个region分别设计了对应了primer进行扩增，primer长度都是100-200bp左右
: 提取了同一种cell line的genomic DNA和total RNA
: 我用genomic DNA作为对照。对于gDNA，region1和region2的Ct值差不多，都是25
: 我也用了plasmid做对照，也是差不多的Ct值
: 而对于cDNA，region1和region2的Ct值分别是28和30
: 两对引物都做了standard curve，在25-30这个范围内efficiency都是100%左右。对于
: genomic DNA／plasmid，两个region都是同样的量，引物效率都是100%，所以最后相同
: 的Ct值。而cDNA有两个cycle的差别，是不是意味着region1产生的RNA的量更多呢？
: 如果是的话，我能想到的可能性时有：
c*o
5 楼
修理LG
f*9
6 楼
你可以涉及跨junction 的primer，就是pirmer 一半在exon 1上一半在exon 2上面，这
样就可以忽略掉gDNA 的污染
样就可以忽略掉gDNA 的污染
j*e
7 楼
那有些啥比较适合呢？
【在 p******t 的大作中提到】
: 擦玻璃貌似不是cleaning lady能做的吧
【在 p******t 的大作中提到】
: 擦玻璃貌似不是cleaning lady能做的吧
r*e
8 楼
我的目的就是研究intron序列的功能，因为是疾病相关。而且尤其那个region1是
TGTGTGTGTG这种重复序列
如果能证明确实有noncoding RNA转录出来，也是功能发现啊；对于疾病来说就是gain-
of-function
你说的knockdown是loss-of-function我也在做
【在 l***y 的大作中提到】
: 就当都是真的，then what？你的big picture是啥？做功能的话knockdown有表型吗？
: 纠结在一个实验上没意义，得综合其他方面看
TGTGTGTGTG这种重复序列
如果能证明确实有noncoding RNA转录出来，也是功能发现啊；对于疾病来说就是gain-
of-function
你说的knockdown是loss-of-function我也在做
【在 l***y 的大作中提到】
: 就当都是真的，then what？你的big picture是啥？做功能的话knockdown有表型吗？
: 纠结在一个实验上没意义，得综合其他方面看
p*t
9 楼
cleaning lady就负责打扫房间，比如扫地擦桌子收拾床铺
你要让她洗衣服的话时间又加长，得另外算钱
简而言之，她能做的你都能做，看谁懒了
【在 j*******e 的大作中提到】
: 那有些啥比较适合呢？
你要让她洗衣服的话时间又加长，得另外算钱
简而言之，她能做的你都能做，看谁懒了
【在 j*******e 的大作中提到】
: 那有些啥比较适合呢？
r*e
10 楼
这个我懂，我平常也是这么设计的。
但这里的问题是我要研究intron区域，并不是coding区域啊
【在 f*********9 的大作中提到】
: 你可以涉及跨junction 的primer，就是pirmer 一半在exon 1上一半在exon 2上面，这
: 样就可以忽略掉gDNA 的污染
但这里的问题是我要研究intron区域，并不是coding区域啊
【在 f*********9 的大作中提到】
: 你可以涉及跨junction 的primer，就是pirmer 一半在exon 1上一半在exon 2上面，这
: 样就可以忽略掉gDNA 的污染
l*e
11 楼
转录本身不说明任何问题 所有intron都是转录的
: 我的目的就是研究intron序列的功能，因为是疾病相关。而且尤其那个region1是
: TGTGTGTGTG这种重复序列
: 如果能证明确实有noncoding RNA转录出来，也是功能发现啊；对于疾病来说就
是gain-
: of-function
: 你说的knockdown是loss-of-function我也在做
【在 r**********e 的大作中提到】
: 这个我懂，我平常也是这么设计的。
: 但这里的问题是我要研究intron区域，并不是coding区域啊
: 我的目的就是研究intron序列的功能，因为是疾病相关。而且尤其那个region1是
: TGTGTGTGTG这种重复序列
: 如果能证明确实有noncoding RNA转录出来，也是功能发现啊；对于疾病来说就
是gain-
: of-function
: 你说的knockdown是loss-of-function我也在做
【在 r**********e 的大作中提到】
: 这个我懂，我平常也是这么设计的。
: 但这里的问题是我要研究intron区域，并不是coding区域啊
r*e
12 楼
Yes, introns mostly transcribed into pre-mRNA
But if specific regions transcribed way more than surrounding region, then
that may indicate function.
region1是
【在 l********e 的大作中提到】
: 转录本身不说明任何问题 所有intron都是转录的
:
:
: 我的目的就是研究intron序列的功能，因为是疾病相关。而且尤其那个region1是
:
: TGTGTGTGTG这种重复序列
:
: 如果能证明确实有noncoding RNA转录出来，也是功能发现啊；对于疾病来说就
: 是gain-
:
: of-function
:
: 你说的knockdown是loss-of-function我也在做
:
But if specific regions transcribed way more than surrounding region, then
that may indicate function.
region1是
【在 l********e 的大作中提到】
: 转录本身不说明任何问题 所有intron都是转录的
:
:
: 我的目的就是研究intron序列的功能，因为是疾病相关。而且尤其那个region1是
:
: TGTGTGTGTG这种重复序列
:
: 如果能证明确实有noncoding RNA转录出来，也是功能发现啊；对于疾病来说就
: 是gain-
:
: of-function
:
: 你说的knockdown是loss-of-function我也在做
:
N*e
13 楼
这么专业的问题身边找不到人问？
region1和region2可能分别剪掉了
【在 r**********e 的大作中提到】
: 用qPCR研究一段intron的表达以及功能。intron有两个区域，region1和region2；针对
: 这两个region分别设计了对应了primer进行扩增，primer长度都是100-200bp左右
: 提取了同一种cell line的genomic DNA和total RNA
: 我用genomic DNA作为对照。对于gDNA，region1和region2的Ct值差不多，都是25
: 我也用了plasmid做对照，也是差不多的Ct值
: 而对于cDNA，region1和region2的Ct值分别是28和30
: 两对引物都做了standard curve，在25-30这个范围内efficiency都是100%左右。对于
: genomic DNA／plasmid，两个region都是同样的量，引物效率都是100%，所以最后相同
: 的Ct值。而cDNA有两个cycle的差别，是不是意味着region1产生的RNA的量更多呢？
: 如果是的话，我能想到的可能性时有：
region1和region2可能分别剪掉了
【在 r**********e 的大作中提到】
: 用qPCR研究一段intron的表达以及功能。intron有两个区域，region1和region2；针对
: 这两个region分别设计了对应了primer进行扩增，primer长度都是100-200bp左右
: 提取了同一种cell line的genomic DNA和total RNA
: 我用genomic DNA作为对照。对于gDNA，region1和region2的Ct值差不多，都是25
: 我也用了plasmid做对照，也是差不多的Ct值
: 而对于cDNA，region1和region2的Ct值分别是28和30
: 两对引物都做了standard curve，在25-30这个范围内efficiency都是100%左右。对于
: genomic DNA／plasmid，两个region都是同样的量，引物效率都是100%，所以最后相同
: 的Ct值。而cDNA有两个cycle的差别，是不是意味着region1产生的RNA的量更多呢？
: 如果是的话，我能想到的可能性时有：
f*9
14 楼
你说的这种是intronic lncrna吧，做下race或者northern确定下，根据ranseq设计跨
exon primer， 这里的exon是你的lncrna的exon
【在 r**********e 的大作中提到】
: 用qPCR研究一段intron的表达以及功能。intron有两个区域，region1和region2；针对
: 这两个region分别设计了对应了primer进行扩增，primer长度都是100-200bp左右
: 提取了同一种cell line的genomic DNA和total RNA
: 我用genomic DNA作为对照。对于gDNA，region1和region2的Ct值差不多，都是25
: 我也用了plasmid做对照，也是差不多的Ct值
: 而对于cDNA，region1和region2的Ct值分别是28和30
: 两对引物都做了standard curve，在25-30这个范围内efficiency都是100%左右。对于
: genomic DNA／plasmid，两个region都是同样的量，引物效率都是100%，所以最后相同
: 的Ct值。而cDNA有两个cycle的差别，是不是意味着region1产生的RNA的量更多呢？
: 如果是的话，我能想到的可能性时有：
exon primer， 这里的exon是你的lncrna的exon
【在 r**********e 的大作中提到】
: 用qPCR研究一段intron的表达以及功能。intron有两个区域，region1和region2；针对
: 这两个region分别设计了对应了primer进行扩增，primer长度都是100-200bp左右
: 提取了同一种cell line的genomic DNA和total RNA
: 我用genomic DNA作为对照。对于gDNA，region1和region2的Ct值差不多，都是25
: 我也用了plasmid做对照，也是差不多的Ct值
: 而对于cDNA，region1和region2的Ct值分别是28和30
: 两对引物都做了standard curve，在25-30这个范围内efficiency都是100%左右。对于
: genomic DNA／plasmid，两个region都是同样的量，引物效率都是100%，所以最后相同
: 的Ct值。而cDNA有两个cycle的差别，是不是意味着region1产生的RNA的量更多呢？
: 如果是的话，我能想到的可能性时有：
y*u
15 楼
研究这种问题靠qpcr而不是rnaseq简直就是行为艺术
还有楼上也说了，奇奇怪怪的transcription events多海了去了，没phenotyoe 支持没
什么好做的
还有楼上也说了，奇奇怪怪的transcription events多海了去了，没phenotyoe 支持没
什么好做的
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