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为何我的CRISPRi总是不工作？

为何我的CRISPRi总是不工作？# Biology - 生物学

s*12018-08-31 07:08

1 楼

载体是Add gene: pHR-SFFV-KRAB-dCas9-P2A-mCherry, sgRNA设计按照Lei S Qi的
Nature protocol(2013)在-50至+100区间用Optimized CRISPR Design网站设计sgRNA,
选择评分高的7个sgRNA,连到sgRNA载体上，最后检测puro筛选的稳定细胞株，Q-PCR和
WB显示蛋白表达没有变化....哪位同行用过CRISPRi系统，能否给一些意见...

b*u2018-08-31 07:08

2 楼

碰巧用过这个系统。那个dCas9放到细胞中要flow sort一下，因为其没有抗性基因。所
以这个sorting就比较tricky了，需要user自己决定过表达的量。
然后奇怪的是，跑胶检测 dCas9的表达，在正常大小的带上，还有一条带，而普通的
Cas9作为对照就一条清楚的带。一直没搞清楚为啥
然后再放入Guide 序列，貌似有 knockdown，单效果不咋样
那篇cell文中，knockdown效果也很一般的说。
所以建议不要花功夫用这套系统。当然了，我自己的两分钱。