求高年级本科生MALDI-TOF实验课的IDEA - 未名空间MITBBS历史存档

国际科技财经博客移民网络热点娱乐民生时事公众号

Redian新闻

>未名空间

>Chemistry - 化学

求高年级本科生MALDI-TOF实验课的IDEA

求高年级本科生MALDI-TOF实验课的IDEA# Chemistry - 化学

q*o2011-04-04 07:04

1 楼

怎么说呢，算是创业的，对于我个人来说我还是比较想回去的，可能是因为在外面待得
时间长了，有点腻了，所以想回家发展。前几天跟父母聊天的时候说我们那现在很多人
都在包地种菜，十亩地每年弄好的话可以赚个七八万，我就想着如果说包五十亩地的话
那一年也能挣个几十万，这已经相当不错了，可是现在有一些问题摆在眼前，首先我们
家就没有种过地，在这方面经验欠缺，另外最重要的问题就是销路，怕就怕菜种了出来
找不到人收购，如果这样的话那肯定是会赔钱的。
看看有没有做过这一行的人，我来取取经，看看现在所面临的一些问题到底该如何解决
。按说这个事儿应该是板上钉钉的了，肯定是要做的，现在能把刚才我说的销路和技术
的问题给解决了那随时就可以开始。

y*l2011-04-04 07:04

2 楼

我现在需要design一节实验课，是给高年级本科生major的，三小时长左右的主要用
MALDI-TOF。我们有ULTRAFLEXIII MALDI-TOF一台，但我其实对MS懂的不多，只是附带
着管一下MS，以前的MS经验也不多。我能想到的也就是给个PROTEIN,让学生用TRYPSIN
DIGEST，然后测PEPTIDES，然后做DATABASE SEARCH。但是觉得这个太普通了，就想知
道大家有没有新颖一点，好玩一点的IDEA，有详细步骤更好了，因为偶比较外行的说。
谢谢！

S*n2011-04-04 07:04

3 楼

第一點要想你要種？菜種子是當地物種或是國內夾帶既然要在美國推銷
就要符合當地法規氣候是否適合未來幾年天氣預報
ˇ當地有中國超市？他們價格與利潤推算他們進價成本
你的成本需要控制到多少運費成本其他你得成本
有機蔬果或一般妳得市場多大？

b*g2011-04-04 07:04

4 楼

protein digestion 3 个小时完成不了
复杂一点的proteomics 实验都要一两天吧。。。
有个建议，你们这个仪器能做TOF/TOF吧，
比较一下proteomics ID 用 PMF 跟 MS/MS search database的区别
一人两个蛋白，一个已知，一个未知，第三个两个蛋白混在一起
已知的看准确度，未知的看ID 对不对

TRYPSIN

【在 y***l 的大作中提到】

: 我现在需要design一节实验课，是给高年级本科生major的，三小时长左右的主要用
: MALDI-TOF。我们有ULTRAFLEXIII MALDI-TOF一台，但我其实对MS懂的不多，只是附带
: 着管一下MS，以前的MS经验也不多。我能想到的也就是给个PROTEIN,让学生用TRYPSIN
: DIGEST，然后测PEPTIDES，然后做DATABASE SEARCH。但是觉得这个太普通了，就想知
: 道大家有没有新颖一点，好玩一点的IDEA，有详细步骤更好了，因为偶比较外行的说。
: 谢谢！

z*82011-04-04 07:04

5 楼

land is pretty cheap, you should just buy land instead of renting it.

y*l2011-04-04 07:04

6 楼

谢谢，我这个外行还需要继续科普。。。请问PMF是什么？
我们是可以作TOF/TOF的，就是用LIFT对吗？
还有，有什么推荐的蛋白吗？
蛋白还是需要学生先DIGEST吗？
如果想找具体的实验步骤，有没有推荐的书或PAPER可以参考？谢谢！！
非常感谢！

【在 b*******g 的大作中提到】

: protein digestion 3 个小时完成不了
: 复杂一点的proteomics 实验都要一两天吧。。。
: 有个建议，你们这个仪器能做TOF/TOF吧，
: 比较一下proteomics ID 用 PMF 跟 MS/MS search database的区别
: 一人两个蛋白，一个已知，一个未知，第三个两个蛋白混在一起
: 已知的看准确度，未知的看ID 对不对
:
: TRYPSIN

b*g2011-04-04 07:04

7 楼

PMF (peptide mass fingerprint)
一般PMF 只可以ID 一种蛋白
MS/MS 可以ID 多种蛋白

【在 y***l 的大作中提到】

: 谢谢，我这个外行还需要继续科普。。。请问PMF是什么？
: 我们是可以作TOF/TOF的，就是用LIFT对吗？
: 还有，有什么推荐的蛋白吗？
: 蛋白还是需要学生先DIGEST吗？
: 如果想找具体的实验步骤，有没有推荐的书或PAPER可以参考？谢谢！！
: 非常感谢！

y*l2011-04-04 07:04

8 楼

谢谢，那DIGEST的部分只能TA提前帮学生做了？？如果学生LAB只有三小时的话。。。
除了BSA还有别的蛋白推荐吗？因为你说一个已知，一个未知。。。至少需要两种蛋白
吧。

b*g2011-04-04 07:04

9 楼

找一些其他便宜的蛋白
like Cyt C， Myoglobin 这类呗

【在 y***l 的大作中提到】

: 谢谢，那DIGEST的部分只能TA提前帮学生做了？？如果学生LAB只有三小时的话。。。
: 除了BSA还有别的蛋白推荐吗？因为你说一个已知，一个未知。。。至少需要两种蛋白
: 吧。

y*l2011-04-04 07:04

10 楼

谢谢。我再抓住高手问一下，有些有机组里的人，用MALDI-TOF不出峰，但是如果在样
品SPOT后再加一点CuI就出峰，这是什么原理？

K*A2011-04-04 07:04

11 楼

帮助IONIZATION？MALDI不熟。估计是Cu2+能络合到被测物上增加charge

【在 y***l 的大作中提到】

: 谢谢。我再抓住高手问一下，有些有机组里的人，用MALDI-TOF不出峰，但是如果在样
: 品SPOT后再加一点CuI就出峰，这是什么原理？

b*22011-04-04 07:04

12 楼

Cu(II)+e- -->Cu(I)，
copper salt acts like a "electron sink",thus enhance the positive mode
signal

【在 y***l 的大作中提到】

: 谢谢。我再抓住高手问一下，有些有机组里的人，用MALDI-TOF不出峰，但是如果在样
: 品SPOT后再加一点CuI就出峰，这是什么原理？

b*22011-04-04 07:04

13 楼

Small proteins, <20k without disulfide bonds, can be digested to some extent
(maybe not completely) within 2-3 hours if increase the ration of enzyme/
target protein. However, you may want to prepare some digested sample
beforehand just in case.

y*l2011-04-04 07:04

14 楼

非常感谢。。。
关于那个DIGEST，看来还是不适合当天做啊，如果实验时间总共才三小时的话。。。
要是不用做PROTEIN的，直接有关于PEPTIDE的实验设计就好了。

b*22011-04-04 07:04

15 楼

You may start the session with analyzing simple peptides, or peptide
mixtures. Then follow with the digested protein and database search.
3 hours is pretty short,especially if they have no hands-on experience with
MALDI before.

【在 y***l 的大作中提到】

: 非常感谢。。。
: 关于那个DIGEST，看来还是不适合当天做啊，如果实验时间总共才三小时的话。。。
: 要是不用做PROTEIN的，直接有关于PEPTIDE的实验设计就好了。

y*l2011-04-04 07:04

16 楼

嗯，是的只一个三小时的SESSION的话，做PROTEIN 不合适，而且我自己也没有经验，
所以不做那个好了。要不就买A, B, C, D, E五种PEPTIDE，告诉他们是哪五种，一人给
一个未知PEPTIDE MIXTURE，大概有两三种PEPTIDE，然后每人做一个MALDI，用M/Z判断
自己有哪两三种PEPTIDE，不知道这样会不会太简单。。。
还是说不告诉他们A,B,C,D,E是什么，每一个再做MS/MS，然后根据MS/MS自己推是什么
PEPTIDE？或者有什么网上的数据库可以用的？

b*22011-04-04 07:04

17 楼

如果我是你，我会这么设计：
买三种peptide（比如angiotensin之类的），三种protein（比如myoglobin,beta-
lactoglobulin等常见的），实验之前你把protein给digest好，作为三个unknown。
前半节，准备matrix，让他们自己混各种peptide点板玩，对谱有个大致的印象。如果
有时间可以做MS/MS，倒推sequence。不过如果他们完全没有接触过，这里还需要一点
时间讲解b，y ion的基础知识。
后半节，把unknown protein digests发给他们，得到谱图，分别用手动计算和
database search来判断哪个是什么protein。
对于de novo sequencing，可以用protein prospector作为依据，MS/MS和digest都可
以计算。

【在 y***l 的大作中提到】

: 嗯，是的只一个三小时的SESSION的话，做PROTEIN 不合适，而且我自己也没有经验，
: 所以不做那个好了。要不就买A, B, C, D, E五种PEPTIDE，告诉他们是哪五种，一人给
: 一个未知PEPTIDE MIXTURE，大概有两三种PEPTIDE，然后每人做一个MALDI，用M/Z判断
: 自己有哪两三种PEPTIDE，不知道这样会不会太简单。。。
: 还是说不告诉他们A,B,C,D,E是什么，每一个再做MS/MS，然后根据MS/MS自己推是什么
: PEPTIDE？或者有什么网上的数据库可以用的？

f*e2011-04-04 07:04

18 楼

sounds quite complicated for undergrads:) espcially the de novo part, I have
a lot of trouble manually interpreting spectra as a postdoc in MS field

【在 b*********2 的大作中提到】

: 如果我是你，我会这么设计：
: 买三种peptide（比如angiotensin之类的），三种protein（比如myoglobin,beta-
: lactoglobulin等常见的），实验之前你把protein给digest好，作为三个unknown。
: 前半节，准备matrix，让他们自己混各种peptide点板玩，对谱有个大致的印象。如果
: 有时间可以做MS/MS，倒推sequence。不过如果他们完全没有接触过，这里还需要一点
: 时间讲解b，y ion的基础知识。
: 后半节，把unknown protein digests发给他们，得到谱图，分别用手动计算和
: database search来判断哪个是什么protein。
: 对于de novo sequencing，可以用protein prospector作为依据，MS/MS和digest都可
: 以计算。

f*e2011-04-04 07:04

19 楼

The software together with Autoflex (FlexAnalysis/Biotools) are not that
easy themselves, you don't want to get yourself trapped if you are not
familiar with them.
Skip MS2, just fire on a couple spots and show them the peaks. Make it like
a PC game. Peptides PMF is enough together with calibration (well,
calibration is kinda tricky too). Don't try intact proteins.
We had 3 days onsite training on Autoflex w/o LIFT and I still keep bugging
bruker.....shame on me...hehehehehe

【在 y***l 的大作中提到】

f*e2011-04-04 07:04

20 楼

rite, additionally, pierce spin column may complete the process in 15min....
reduction and alkylation will help a lot as well. But sample prep itself is
a big deal for maldi. My suggestion is just to simply mix peptide standards
together. Enough for 3 hours undergrad course.

extent

【在 b*********2 的大作中提到】

: Small proteins, <20k without disulfide bonds, can be digested to some extent
: (maybe not completely) within 2-3 hours if increase the ration of enzyme/
: target protein. However, you may want to prepare some digested sample
: beforehand just in case.

b*g2011-04-04 07:04

21 楼

哈哈，我一直在想 bruker MALDI 的3-day training 是给谁准备的。。。
（我们仪器装好之后就training了半个小时）
我training 过很多本科生，基本上一个小时后就可以了（不包括使用biotool）
另外，MALDI 是一个很容易上手的仪器，我们training MALDI imaging 也不过只花了3
个小时

like
bugging

【在 f*********e 的大作中提到】

: The software together with Autoflex (FlexAnalysis/Biotools) are not that
: easy themselves, you don't want to get yourself trapped if you are not
: familiar with them.
: Skip MS2, just fire on a couple spots and show them the peaks. Make it like
: a PC game. Peptides PMF is enough together with calibration (well,
: calibration is kinda tricky too). Don't try intact proteins.
: We had 3 days onsite training on Autoflex w/o LIFT and I still keep bugging
: bruker.....shame on me...hehehehehe

L*r2011-04-04 07:04

22 楼

BB's method is too complicated to undergraduates.
1. Carefully calibrate the instruments using standards.
2. Teach students how to spot samples: sandwich (matrix-sample-matrix); mix
sample and matrix solution, then spot; matrix then sample. Compare the
performance.
3. Analyze two protein samples, remember: if lots of salts in the protein
solution, you need to extract the protein using ZIP tip or NuTip.
I THINK THIS IS ENOUGH FOR UNDERGRADUATES WITHIN 3 HOURS
Good luck!

y*l2011-04-04 07:04

23 楼

谢谢！这个的后半部分好象蛮复杂的样子，我自己熟悉尚需要时日，恐怕现在就写成
实验教程不太现实。。。。看来偶们对本科生的水平估计不同啊。。。偶以前只教过
GENERAL CHEM，对SENIOR学生的水平还不是很清楚呢。

【在 b*********2 的大作中提到】

y*l2011-04-04 07:04

24 楼

你们肯定是MASS大组吧？！
偶六月份要去BRUKER的TRAINING，汗，应该是为偶们这种人准备的，呵呵

了3

【在 b*******g 的大作中提到】

: 哈哈，我一直在想 bruker MALDI 的3-day training 是给谁准备的。。。
: （我们仪器装好之后就training了半个小时）
: 我training 过很多本科生，基本上一个小时后就可以了（不包括使用biotool）
: 另外，MALDI 是一个很容易上手的仪器，我们training MALDI imaging 也不过只花了3
: 个小时
:
: like
: bugging

y*l2011-04-04 07:04

25 楼

谢谢！很喜欢这个设计，我会给peptide unknown和protein unknown，这样他们可以分
别用RP mode和LP mode，考虑到虽然train一个人，一小时是够了，但本科生要排队用
机子吧，三小时应该差不多了。我觉得用三种方法点板挺好的。不过题外问一下你们这
些常做MALDI的人，这三种点板方式，在实际应用中你们觉得哪种好呢？或者说对于不
同的analyte，有各自适合的方法？

mix

【在 L****r 的大作中提到】

: BB's method is too complicated to undergraduates.
: 1. Carefully calibrate the instruments using standards.
: 2. Teach students how to spot samples: sandwich (matrix-sample-matrix); mix
: sample and matrix solution, then spot; matrix then sample. Compare the
: performance.
: 3. Analyze two protein samples, remember: if lots of salts in the protein
: solution, you need to extract the protein using ZIP tip or NuTip.
: I THINK THIS IS ENOUGH FOR UNDERGRADUATES WITHIN 3 HOURS
: Good luck!

b*g2011-04-04 07:04

26 楼

有点区别。但是应该看不出来多大，还是不要用的
关键是不用的analyte 要用不同的matrix，还不如比较matrix 的区别

【在 y***l 的大作中提到】

: 谢谢！很喜欢这个设计，我会给peptide unknown和protein unknown，这样他们可以分
: 别用RP mode和LP mode，考虑到虽然train一个人，一小时是够了，但本科生要排队用
: 机子吧，三小时应该差不多了。我觉得用三种方法点板挺好的。不过题外问一下你们这
: 些常做MALDI的人，这三种点板方式，在实际应用中你们觉得哪种好呢？或者说对于不
: 同的analyte，有各自适合的方法？
:
: mix

b*22011-04-04 07:04

27 楼

点板的方法我个人觉得看不出来太大的区别，我有时间就mix样品和matrix点，没时间
就逮着哪个先点哪个
同意上面的，可以比较不同matrix，比如CHCA,DHB之类的差别

y*l2011-04-04 07:04

28 楼

嗯，谢谢再次点拨。。。那就每个样品用两到三种MATRIX来做。那写实验报告的时候要
分析为什么不同MATRIX效果不同，这个答案要点是什么？

b*g2011-04-04 07:04

29 楼

me too，同意
从来都是乱点，能出信号的，怎么着都有信号，哈哈..

【在 b*********2 的大作中提到】

: 点板的方法我个人觉得看不出来太大的区别，我有时间就mix样品和matrix点，没时间
: 就逮着哪个先点哪个
: 同意上面的，可以比较不同matrix，比如CHCA,DHB之类的差别

b*22011-04-04 07:04

30 楼

我觉得这个还挺不好答的，要有一定的理论基础，作为美国小本的题目挺好，让他们自
己去google吧。。如果嫌太难，你也可以让他们打一个加matrix，一个只有sample没有
matrix的，看信号怎样，然后实验报告就是分析matrix的作用，而不是比较各种matrix
的chemical property了
这个网页里面有表格，写了不同的matrix的适用范围：
http://sr.burnham.org/sr/homepage/proteomics/matrixprep.html

【在 y***l 的大作中提到】

: 嗯，谢谢再次点拨。。。那就每个样品用两到三种MATRIX来做。那写实验报告的时候要
: 分析为什么不同MATRIX效果不同，这个答案要点是什么？

y*l2011-04-04 07:04

31 楼

非常感谢，确实一个加MATRIX一个不加，这样更适合实验报告的讨论。不然我自己都不
知道答案就窘了。。。

y*l2011-04-04 07:04

32 楼

还有，你们的MATRIX一般都可以用多久啊？我这里有一些CCA的MATRIX，好象不管用，
每次我都要借人家的UNVIERSAL MATRIX才出峰，其实就是简单的一些单白DIGEST之后的
PEPTIDES。不知道这些MATRIX前人放多久了，但是放在冰箱里的，甁装的粉末，会有失
效的MATRIX吗？

b*22011-04-04 07:04

33 楼

一般都会强调用fresh solution的，不过我经常偷懒，配一次用一个月吧，冻冰箱里。
。。
建议order新的matrix,那种一小管一小管称好质量的，往里加solvent就好了

【在 y***l 的大作中提到】

: 还有，你们的MATRIX一般都可以用多久啊？我这里有一些CCA的MATRIX，好象不管用，
: 每次我都要借人家的UNVIERSAL MATRIX才出峰，其实就是简单的一些单白DIGEST之后的
: PEPTIDES。不知道这些MATRIX前人放多久了，但是放在冰箱里的，甁装的粉末，会有失
: 效的MATRIX吗？

y*l2011-04-04 07:04

34 楼

y*l2011-04-04 07:04

35 楼

我每次都配FRESH SOLUTION的。。。只是很难相信粉末状的东西放冰箱也会坏呢。。。
看来还是要买新的了。。。

【在 b*********2 的大作中提到】

: 一般都会强调用fresh solution的，不过我经常偷懒，配一次用一个月吧，冻冰箱里。
: 。。
: 建议order新的matrix,那种一小管一小管称好质量的，往里加solvent就好了

w*n2011-04-04 07:04

36 楼

如果是MALDI，是不是教一点imaging的东西，MALDI的特别之处在此。现在也很热。不久的将来，应该是会有很实在的运用。实验设计也不是很难。

y*l2011-04-04 07:04

37 楼

IMAGING的东西偶一点都没有接触过，估计偶是办不到了。。。

e*e2011-04-04 07:04

38 楼

难怪美国本科教育差, 这种实验都是不懂的人去准备.

TRYPSIN

【在 y***l 的大作中提到】

b*g2011-04-04 07:04

39 楼

靠，我们俩怎么这么像
我更懒，直接放室温，用一个月。。。

【在 b*********2 的大作中提到】

b*22011-04-04 07:04

40 楼

呃...只要你跟我不是一个实验室就行...
要不然就糗了

【在 b*******g 的大作中提到】

: 靠，我们俩怎么这么像
: 我更懒，直接放室温，用一个月。。。

b*g2011-04-04 07:04

41 楼

haha，应该不是，我一般都做matrix free 实验，不常用matrix

【在 b*********2 的大作中提到】

: 呃...只要你跟我不是一个实验室就行...
: 要不然就糗了

f*e2011-04-04 07:04

42 楼

我咋怎么也觉得ESI更好用。。。。
这么笨的人，你不是想碰就碰上的，呵呵，运气不错!

了3

【在 b*******g 的大作中提到】

y*l2011-04-04 07:04

43 楼

不好意思，我巴不得别让我去弄呢，可是系里一个稍懂MS的教授猝死了，临时还没招到
人呢，没办法。。。

【在 e*****e 的大作中提到】

: 难怪美国本科教育差, 这种实验都是不懂的人去准备.
:
: TRYPSIN

p*82011-04-04 07:04

44 楼

Instrument vendor often needs that much time to earn money up to $2000.
However, our university is charged for large price for MALDI training (it
estimated to be $5000, which made me and my boss go crazy ) . What a fuck
greedy, taking us as idiots ! If instrument did not work after your sample,
additional charge will be $1000. Also, they require you take chemistry Mass
spectrometry course before training. Anyway,it's impossible to do it by
yourself even if MALDI is available, nobody using it. For such nonsense,
it's good to buy a second-hand one at about 60k. Well, ask and pay them
do it, they also have your sample tested by MALDI during 3-4 weeks. Then
you'll be fucked up if your sample can not last that long, and be blamed for
slow progress by boss. Good, is it only way to let boss to do me favor to
call them do it??? It works at first time, but everything is going to
starting point then.
All these are ridiculous since MALDI is very simple to operate. I had
experience on LCMS and GCMS, just several hours on-site training is enough,
while I think they are much more complicated than MALDI.
I'm jealous you guys have a MALDI to use.
LZ can try some polymer powder for MALDI by using sampling technique like IR
. If you got microscope, it's interesting to put single cell on MALDI
sample plate with matrix, to see what you are going to fingerprint (protein,
lipid et.al).

了3

【在 b*******g 的大作中提到】

w*n2011-04-04 07:04

45 楼

这个是非常奇怪的学校，不是research oriented的地方吗？
这个是管理层次的问题了。只能是老板之间协商来解决。别无他法。

,
Mass
for

【在 p*******8 的大作中提到】

: Instrument vendor often needs that much time to earn money up to $2000.
: However, our university is charged for large price for MALDI training (it
: estimated to be $5000, which made me and my boss go crazy ) . What a fuck
: greedy, taking us as idiots ! If instrument did not work after your sample,
: additional charge will be $1000. Also, they require you take chemistry Mass
: spectrometry course before training. Anyway,it's impossible to do it by
: yourself even if MALDI is available, nobody using it. For such nonsense,
: it's good to buy a second-hand one at about 60k. Well, ask and pay them
: do it, they also have your sample tested by MALDI during 3-4 weeks. Then
: you'll be fucked up if your sample can not last that long, and be blamed for