求指导!RP-HPLC分离monoclonal antibody# Chemistry - 化学
c*e
1 楼
只有5个月了，J1 waiver时间不够。
可以在当前学校要求extend J1, 接着申请J1 waiver，然后到下一个学校申请H1B吗？
十分感谢！
可以在当前学校要求extend J1, 接着申请J1 waiver，然后到下一个学校申请H1B吗？
十分感谢！
A*a
2 楼
记得以前加州有，有谁玩过，说说经验
m*1
3 楼
rt 我用的是Phenomenex Aeris widepore C18 column, 是专门用来分离protein的，
mobile phase 用ACN/H2O 0.1%TFA, 一开始只用两种standard antibody试条件，无奈
尝试了很久都没有分离出来，Gradient slope大了solute就全部一起洗出来，小了peak
就宽到不行，昨天试了一个long gradient用0.1%B/min结果peak宽到几十分钟几乎看不
到...
有没有大侠有过类似经验的给点指导，感激不尽。。。。
mobile phase 用ACN/H2O 0.1%TFA, 一开始只用两种standard antibody试条件，无奈
尝试了很久都没有分离出来，Gradient slope大了solute就全部一起洗出来，小了peak
就宽到不行，昨天试了一个long gradient用0.1%B/min结果peak宽到几十分钟几乎看不
到...
有没有大侠有过类似经验的给点指导，感激不尽。。。。
z*t
4 楼
跟学校说没有什么用，关键是要跟你老板说。你老板同意给你延才行。
s*s
5 楼
up
o*e
6 楼
除了C18，还有C8，C4的柱子可以试。。。
另外需要检验的是，reverse phase分离出来的你想要的mAb，
（freeze-dry后）还能不能保持其应有的性质。
peak
【在 m*1 的大作中提到】
: rt 我用的是Phenomenex Aeris widepore C18 column, 是专门用来分离protein的，
: mobile phase 用ACN/H2O 0.1%TFA, 一开始只用两种standard antibody试条件，无奈
: 尝试了很久都没有分离出来，Gradient slope大了solute就全部一起洗出来，小了peak
: 就宽到不行，昨天试了一个long gradient用0.1%B/min结果peak宽到几十分钟几乎看不
: 到...
: 有没有大侠有过类似经验的给点指导，感激不尽。。。。
另外需要检验的是，reverse phase分离出来的你想要的mAb，
（freeze-dry后）还能不能保持其应有的性质。
peak
【在 m*1 的大作中提到】
: rt 我用的是Phenomenex Aeris widepore C18 column, 是专门用来分离protein的，
: mobile phase 用ACN/H2O 0.1%TFA, 一开始只用两种standard antibody试条件，无奈
: 尝试了很久都没有分离出来，Gradient slope大了solute就全部一起洗出来，小了peak
: 就宽到不行，昨天试了一个long gradient用0.1%B/min结果peak宽到几十分钟几乎看不
: 到...
: 有没有大侠有过类似经验的给点指导，感激不尽。。。。
a*y
7 楼
不太明白你这个plan，你是说使用延长了的J1来保持身份申请waiver么？那你申H1的时
候用什么身份呢？还是你准备在现在的学校就让新的学校开始帮你申请H1？
候用什么身份呢？还是你准备在现在的学校就让新的学校开始帮你申请H1？
l*j
8 楼
c4对hydrophobic的更好使吧 mAb大多是水溶性的 c18应该差不多了
另外如果考虑换柱子的话 以前用过diphenyl column分mAb
【在 o****e 的大作中提到】
: 除了C18，还有C8，C4的柱子可以试。。。
: 另外需要检验的是，reverse phase分离出来的你想要的mAb，
: （freeze-dry后）还能不能保持其应有的性质。
:
: peak
另外如果考虑换柱子的话 以前用过diphenyl column分mAb
【在 o****e 的大作中提到】
: 除了C18，还有C8，C4的柱子可以试。。。
: 另外需要检验的是，reverse phase分离出来的你想要的mAb，
: （freeze-dry后）还能不能保持其应有的性质。
:
: peak
S*a
9 楼
现在老板不给办H1B 但是下家已经找好了而且给办？
可以先延期，然后transfer到下家，再开始办，收到豁免立即H1B
否则要断档
【在 c******e 的大作中提到】
: 只有5个月了，J1 waiver时间不够。
: 可以在当前学校要求extend J1, 接着申请J1 waiver，然后到下一个学校申请H1B吗？
: 十分感谢！
可以先延期，然后transfer到下家，再开始办，收到豁免立即H1B
否则要断档
【在 c******e 的大作中提到】
: 只有5个月了，J1 waiver时间不够。
: 可以在当前学校要求extend J1, 接着申请J1 waiver，然后到下一个学校申请H1B吗？
: 十分感谢！
s*h
10 楼
女神出现了。。。。
【在 l**j 的大作中提到】
: c4对hydrophobic的更好使吧 mAb大多是水溶性的 c18应该差不多了
: 另外如果考虑换柱子的话 以前用过diphenyl column分mAb
【在 l**j 的大作中提到】
: c4对hydrophobic的更好使吧 mAb大多是水溶性的 c18应该差不多了
: 另外如果考虑换柱子的话 以前用过diphenyl column分mAb
c*e
11 楼
我的理解是必须拿到J1 waiver, 才能开始办H1B. 所以很担心中间衔接不上。
【在 a****y 的大作中提到】
: 不太明白你这个plan，你是说使用延长了的J1来保持身份申请waiver么？那你申H1的时
: 候用什么身份呢？还是你准备在现在的学校就让新的学校开始帮你申请H1？
【在 a****y 的大作中提到】
: 不太明白你这个plan，你是说使用延长了的J1来保持身份申请waiver么？那你申H1的时
: 候用什么身份呢？还是你准备在现在的学校就让新的学校开始帮你申请H1？
m*1
12 楼
能不能保持性质都是后话了 好像是准备跟MS联用 需要先能够分出来再说....
【在 o****e 的大作中提到】
: 除了C18，还有C8，C4的柱子可以试。。。
: 另外需要检验的是，reverse phase分离出来的你想要的mAb，
: （freeze-dry后）还能不能保持其应有的性质。
:
: peak
【在 o****e 的大作中提到】
: 除了C18，还有C8，C4的柱子可以试。。。
: 另外需要检验的是，reverse phase分离出来的你想要的mAb，
: （freeze-dry后）还能不能保持其应有的性质。
:
: peak
a*y
13 楼
所以我觉得你不用延啊，直接transfer到新的地方，然后waiver，然后h1b
【在 c******e 的大作中提到】
: 我的理解是必须拿到J1 waiver, 才能开始办H1B. 所以很担心中间衔接不上。
【在 c******e 的大作中提到】
: 我的理解是必须拿到J1 waiver, 才能开始办H1B. 所以很担心中间衔接不上。
m*1
14 楼
谢谢！我分离的rhuMAb 是水溶性的 问题是Phenomenex自己用这个wideporeC18分离lgG
的效果很好... 我不知道是不是我的分离条件有问题....
【在 l**j 的大作中提到】
: c4对hydrophobic的更好使吧 mAb大多是水溶性的 c18应该差不多了
: 另外如果考虑换柱子的话 以前用过diphenyl column分mAb
的效果很好... 我不知道是不是我的分离条件有问题....
【在 l**j 的大作中提到】
: c4对hydrophobic的更好使吧 mAb大多是水溶性的 c18应该差不多了
: 另外如果考虑换柱子的话 以前用过diphenyl column分mAb
S*a
15 楼
不waive成功 根本就不给办H1B
时间要尽量留出1年来
【在 c******e 的大作中提到】
: 我的理解是必须拿到J1 waiver, 才能开始办H1B. 所以很担心中间衔接不上。
时间要尽量留出1年来
【在 c******e 的大作中提到】
: 我的理解是必须拿到J1 waiver, 才能开始办H1B. 所以很担心中间衔接不上。
b*2
16 楼
上Varian的diphenyl，对mAb,ligh chain/heavy chain, fragments都效果比较好
s*8
17 楼
先延期J-1，然后再办理豁免。时间上5个月很危险，估计办不下来
k*o
18 楼
看看Phenomenex Aeris widepore C18 column 公司自己提供的分离的例子是什么条件
？不过多半只会给HPLC-UV的图，那样的话多半会加添加剂比如PEG啥的得到resolution
很高的分离图。但你如果是MS分析的话就别想添加剂了。另外TFA严重降低MS
sensitivity。换FA会好很多，不过resolution不如TFA。
另外，你load IgG到C18上用的buffer条件是什么，这个也会有影响。还有load
多少量，要考虑column的loading capacity。
peak
【在 m*1 的大作中提到】
: rt 我用的是Phenomenex Aeris widepore C18 column, 是专门用来分离protein的，
: mobile phase 用ACN/H2O 0.1%TFA, 一开始只用两种standard antibody试条件，无奈
: 尝试了很久都没有分离出来，Gradient slope大了solute就全部一起洗出来，小了peak
: 就宽到不行，昨天试了一个long gradient用0.1%B/min结果peak宽到几十分钟几乎看不
: 到...
: 有没有大侠有过类似经验的给点指导，感激不尽。。。。
？不过多半只会给HPLC-UV的图，那样的话多半会加添加剂比如PEG啥的得到resolution
很高的分离图。但你如果是MS分析的话就别想添加剂了。另外TFA严重降低MS
sensitivity。换FA会好很多，不过resolution不如TFA。
另外，你load IgG到C18上用的buffer条件是什么，这个也会有影响。还有load
多少量，要考虑column的loading capacity。
peak
【在 m*1 的大作中提到】
: rt 我用的是Phenomenex Aeris widepore C18 column, 是专门用来分离protein的，
: mobile phase 用ACN/H2O 0.1%TFA, 一开始只用两种standard antibody试条件，无奈
: 尝试了很久都没有分离出来，Gradient slope大了solute就全部一起洗出来，小了peak
: 就宽到不行，昨天试了一个long gradient用0.1%B/min结果peak宽到几十分钟几乎看不
: 到...
: 有没有大侠有过类似经验的给点指导，感激不尽。。。。
x*o
19 楼
Not sure your purpose of separation and RP-HPLC was chosen. If it's for
quantitation, other techniques may work, IEF, CIEF iCIEF
I assume SEC-HPLC can not separate these two mAbs
quantitation, other techniques may work, IEF, CIEF iCIEF
I assume SEC-HPLC can not separate these two mAbs
d*e
20 楼
my suggestion:
CN or C4 column
column temperature >60C
Reduce mAb if possible
or
Collect peaks from HIC column
or
SEC, if just need desalt mAb for MS
CN or C4 column
column temperature >60C
Reduce mAb if possible
or
Collect peaks from HIC column
or
SEC, if just need desalt mAb for MS
d*e
21 楼
general rule: bigger protein need short stationary phase chain to reduce
interaction and improve peak shape/recovery.The problem here is too much
absorbance on stationary phase
【在 l**j 的大作中提到】
: c4对hydrophobic的更好使吧 mAb大多是水溶性的 c18应该差不多了
: 另外如果考虑换柱子的话 以前用过diphenyl column分mAb
interaction and improve peak shape/recovery.The problem here is too much
absorbance on stationary phase
【在 l**j 的大作中提到】
: c4对hydrophobic的更好使吧 mAb大多是水溶性的 c18应该差不多了
: 另外如果考虑换柱子的话 以前用过diphenyl column分mAb
x*o
22 楼
Adsorption on the stationary phase might be a very good reason. Used to work
with Non-porous silica reversed phase HPLC (Beckman ProteomeLab PF2D). This
reverse phase column gives very good peak shapes for proteins.And fractions
can be collected for downstream analysis
with Non-porous silica reversed phase HPLC (Beckman ProteomeLab PF2D). This
reverse phase column gives very good peak shapes for proteins.And fractions
can be collected for downstream analysis
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