e*p
2 楼
做3’RACE 快半年了，用了好几种TAQ - strategen pfu, takara, biorad bioline,
invitrogen platium hifi. 3‘引物设计了6个，条件也优化（AT,elonging time, mg+
)，要不什么也没有要不没有P出目的条带（测序后错配了）。。。唉 都要崩溃了..
另外的一个基因到是P出来了，这个基因3'端有很多重复序 GC 50-60%的样子 请教大家
一般用什么办法或强大的酶。。。
非常感谢
invitrogen platium hifi. 3‘引物设计了6个，条件也优化（AT,elonging time, mg+
)，要不什么也没有要不没有P出目的条带（测序后错配了）。。。唉 都要崩溃了..
另外的一个基因到是P出来了，这个基因3'端有很多重复序 GC 50-60%的样子 请教大家
一般用什么办法或强大的酶。。。
非常感谢
c*h
3 楼
国内某大学投某中档杂志的文章，主要是英语写的太别扭了。很多不专业的用法。还有
就是一段话就一个句子，从句套从句。我虽然英语也不咋的，但是这个写的实在是怎么
读起来怎么别扭，这种情况大家怎么办？不会要逐字逐句给他改吧？如果结果过的去，
让他修改文章重写么？
就是一段话就一个句子，从句套从句。我虽然英语也不咋的，但是这个写的实在是怎么
读起来怎么别扭，这种情况大家怎么办？不会要逐字逐句给他改吧？如果结果过的去，
让他修改文章重写么？
m*e
4 楼
看了整串帖子，大家都说得挺好的，不知道怎么的有个人出来骂人了。
【在 G*********e 的大作中提到】
: 理由如下：
: 此ID违反版规， 发帖PA。
【在 G*********e 的大作中提到】
: 理由如下：
: 此ID违反版规， 发帖PA。
a*n
5 楼
首先看你用的cdna来源的细胞组织有没有目的基因的表达
PCR条件可以加点DMSO，槽式PCR试试，酶可以试试clontech的advantage 2 system
mg+
【在 e****p 的大作中提到】
: 做3’RACE 快半年了，用了好几种TAQ - strategen pfu, takara, biorad bioline,
: invitrogen platium hifi. 3‘引物设计了6个，条件也优化（AT,elonging time, mg+
: )，要不什么也没有要不没有P出目的条带（测序后错配了）。。。唉 都要崩溃了..
: 另外的一个基因到是P出来了，这个基因3'端有很多重复序 GC 50-60%的样子 请教大家
: 一般用什么办法或强大的酶。。。
: 非常感谢
PCR条件可以加点DMSO，槽式PCR试试，酶可以试试clontech的advantage 2 system
mg+
【在 e****p 的大作中提到】
: 做3’RACE 快半年了，用了好几种TAQ - strategen pfu, takara, biorad bioline,
: invitrogen platium hifi. 3‘引物设计了6个，条件也优化（AT,elonging time, mg+
: )，要不什么也没有要不没有P出目的条带（测序后错配了）。。。唉 都要崩溃了..
: 另外的一个基因到是P出来了，这个基因3'端有很多重复序 GC 50-60%的样子 请教大家
: 一般用什么办法或强大的酶。。。
: 非常感谢
M*n
6 楼
poor writing style，举几处例子，要求改
【在 c******h 的大作中提到】
: 国内某大学投某中档杂志的文章，主要是英语写的太别扭了。很多不专业的用法。还有
: 就是一段话就一个句子，从句套从句。我虽然英语也不咋的，但是这个写的实在是怎么
: 读起来怎么别扭，这种情况大家怎么办？不会要逐字逐句给他改吧？如果结果过的去，
: 让他修改文章重写么？
【在 c******h 的大作中提到】
: 国内某大学投某中档杂志的文章，主要是英语写的太别扭了。很多不专业的用法。还有
: 就是一段话就一个句子，从句套从句。我虽然英语也不咋的，但是这个写的实在是怎么
: 读起来怎么别扭，这种情况大家怎么办？不会要逐字逐句给他改吧？如果结果过的去，
: 让他修改文章重写么？
a*z
7 楼
赞。
板斧辛苦了
【在 G*********e 的大作中提到】
: 理由如下：
: 此ID违反版规， 发帖PA。
板斧辛苦了
【在 G*********e 的大作中提到】
: 理由如下：
: 此ID违反版规， 发帖PA。
r*l
8 楼
在基因组DNA里试试一端用随机引物pcr
mg+
【在 e****p 的大作中提到】
: 做3’RACE 快半年了，用了好几种TAQ - strategen pfu, takara, biorad bioline,
: invitrogen platium hifi. 3‘引物设计了6个，条件也优化（AT,elonging time, mg+
: )，要不什么也没有要不没有P出目的条带（测序后错配了）。。。唉 都要崩溃了..
: 另外的一个基因到是P出来了，这个基因3'端有很多重复序 GC 50-60%的样子 请教大家
: 一般用什么办法或强大的酶。。。
: 非常感谢
mg+
【在 e****p 的大作中提到】
: 做3’RACE 快半年了，用了好几种TAQ - strategen pfu, takara, biorad bioline,
: invitrogen platium hifi. 3‘引物设计了6个，条件也优化（AT,elonging time, mg+
: )，要不什么也没有要不没有P出目的条带（测序后错配了）。。。唉 都要崩溃了..
: 另外的一个基因到是P出来了，这个基因3'端有很多重复序 GC 50-60%的样子 请教大家
: 一般用什么办法或强大的酶。。。
: 非常感谢
G*e
9 楼
我也碰到这样的情况，就举出十来处例子，要求先improve English writing。提交了
report之后发现另一个审稿人强据。估计Editor会据了……
report之后发现另一个审稿人强据。估计Editor会据了……
e*p
10 楼
请问如何解释啊
谢谢
【在 r*****l 的大作中提到】
: 在基因组DNA里试试一端用随机引物pcr
:
: mg+
谢谢
【在 r*****l 的大作中提到】
: 在基因组DNA里试试一端用随机引物pcr
:
: mg+
M*n
11 楼
十来处，好有耐心...
【在 G********e 的大作中提到】
: 我也碰到这样的情况，就举出十来处例子，要求先improve English writing。提交了
: report之后发现另一个审稿人强据。估计Editor会据了……
【在 G********e 的大作中提到】
: 我也碰到这样的情况，就举出十来处例子，要求先improve English writing。提交了
: report之后发现另一个审稿人强据。估计Editor会据了……
e*p
12 楼
DSMO NESTED试了没有用，试试CLONTECH 吧虽然贵点
【在 a*****n 的大作中提到】
: 首先看你用的cdna来源的细胞组织有没有目的基因的表达
: PCR条件可以加点DMSO，槽式PCR试试，酶可以试试clontech的advantage 2 system
:
: mg+
【在 a*****n 的大作中提到】
: 首先看你用的cdna来源的细胞组织有没有目的基因的表达
: PCR条件可以加点DMSO，槽式PCR试试，酶可以试试clontech的advantage 2 system
:
: mg+
z*l
13 楼
我一般找个3，4处，然后就说英文要改一下。
r*l
14 楼
是克隆未知基因么？
多年以前，我隐约记得通过3race搞不出来，我就一端用特异引物，一端用随机引物，
用tail pcr做出来的
【在 e****p 的大作中提到】
: 请问如何解释啊
: 谢谢
多年以前，我隐约记得通过3race搞不出来，我就一端用特异引物，一端用随机引物，
用tail pcr做出来的
【在 e****p 的大作中提到】
: 请问如何解释啊
: 谢谢
R*w
15 楼
这个是行不通的，一旦引物加到反应体系里了你就没法控制引物binding到那一端？
随机引物可以做正向的也可以做反向的。
但是我有一个方法，是我以前扩增Novel病毒是想到的，而且很有效。
在做反转录时用特殊的随机引物，在随机引物的5'端加一段已知序列例如：5'-
GCTACTAGTCGATCGTnnnnnn-3'。这样你就在所有cDNA的5’端加了一个Tail。
然后做PCR时forward primer用你的5’端Gene specific引物，反向引物用这个tail“5
'-GCTACTAGTCGATCGT-3'”你就肯定能扩到3’端，可以一步一步往3’端扩。
可能ronbell想说的也是这种方法吧？
其实Race最麻烦的还是5’-race。这以前一直用一个酶在cDNA的3’端加A。但不是很有
效，有时可以扩到5’端的序列有时弄很难
【在 r*****l 的大作中提到】
: 在基因组DNA里试试一端用随机引物pcr
:
: mg+
随机引物可以做正向的也可以做反向的。
但是我有一个方法，是我以前扩增Novel病毒是想到的，而且很有效。
在做反转录时用特殊的随机引物，在随机引物的5'端加一段已知序列例如：5'-
GCTACTAGTCGATCGTnnnnnn-3'。这样你就在所有cDNA的5’端加了一个Tail。
然后做PCR时forward primer用你的5’端Gene specific引物，反向引物用这个tail“5
'-GCTACTAGTCGATCGT-3'”你就肯定能扩到3’端，可以一步一步往3’端扩。
可能ronbell想说的也是这种方法吧？
其实Race最麻烦的还是5’-race。这以前一直用一个酶在cDNA的3’端加A。但不是很有
效，有时可以扩到5’端的序列有时弄很难
【在 r*****l 的大作中提到】
: 在基因组DNA里试试一端用随机引物pcr
:
: mg+
e*p
16 楼
请问这个随机引物是自己合成的还是可以直接买到的啊？
这样的话RT后 PCR会有很多条带吧，
谢谢！
“5
【在 R*****w 的大作中提到】
: 这个是行不通的，一旦引物加到反应体系里了你就没法控制引物binding到那一端？
: 随机引物可以做正向的也可以做反向的。
: 但是我有一个方法，是我以前扩增Novel病毒是想到的，而且很有效。
: 在做反转录时用特殊的随机引物，在随机引物的5'端加一段已知序列例如：5'-
: GCTACTAGTCGATCGTnnnnnn-3'。这样你就在所有cDNA的5’端加了一个Tail。
: 然后做PCR时forward primer用你的5’端Gene specific引物，反向引物用这个tail“5
: '-GCTACTAGTCGATCGT-3'”你就肯定能扩到3’端，可以一步一步往3’端扩。
: 可能ronbell想说的也是这种方法吧？
: 其实Race最麻烦的还是5’-race。这以前一直用一个酶在cDNA的3’端加A。但不是很有
: 效，有时可以扩到5’端的序列有时弄很难
这样的话RT后 PCR会有很多条带吧，
谢谢！
“5
【在 R*****w 的大作中提到】
: 这个是行不通的，一旦引物加到反应体系里了你就没法控制引物binding到那一端？
: 随机引物可以做正向的也可以做反向的。
: 但是我有一个方法，是我以前扩增Novel病毒是想到的，而且很有效。
: 在做反转录时用特殊的随机引物，在随机引物的5'端加一段已知序列例如：5'-
: GCTACTAGTCGATCGTnnnnnn-3'。这样你就在所有cDNA的5’端加了一个Tail。
: 然后做PCR时forward primer用你的5’端Gene specific引物，反向引物用这个tail“5
: '-GCTACTAGTCGATCGT-3'”你就肯定能扩到3’端，可以一步一步往3’端扩。
: 可能ronbell想说的也是这种方法吧？
: 其实Race最麻烦的还是5’-race。这以前一直用一个酶在cDNA的3’端加A。但不是很有
: 效，有时可以扩到5’端的序列有时弄很难
R*w
17 楼
需要你自己设计序列，让公司合成的。这段tail序列可以是任意序列，但你需要先
blast一下，不要找个与human或mouse的genome相似性很高的，否则你会有麻烦。
理论上会有很多条带，甚至smear，但实际上只会有1－3条带，你可以只挑最大的那条
带做克隆测序就可以了。
good luck
blast一下，不要找个与human或mouse的genome相似性很高的，否则你会有麻烦。
理论上会有很多条带，甚至smear，但实际上只会有1－3条带，你可以只挑最大的那条
带做克隆测序就可以了。
good luck
C*e
18 楼
你想到的这个有个类似的方法几年前就有人发表了
用RNA Ligase加一个自己设计的adaptor（DNA)到RNA的3'端，
然后用gene specific forward primer和adaptor specific reverse primer扩增
5'RACE也可以用这个方法做
我试过这个方法的3' RACE，还蛮方便的
因为我做的原核，没有poly-A tail，没有kit可以用
这个方法帮了我大忙
“5
【在 R*****w 的大作中提到】
: 这个是行不通的，一旦引物加到反应体系里了你就没法控制引物binding到那一端？
: 随机引物可以做正向的也可以做反向的。
: 但是我有一个方法，是我以前扩增Novel病毒是想到的，而且很有效。
: 在做反转录时用特殊的随机引物，在随机引物的5'端加一段已知序列例如：5'-
: GCTACTAGTCGATCGTnnnnnn-3'。这样你就在所有cDNA的5’端加了一个Tail。
: 然后做PCR时forward primer用你的5’端Gene specific引物，反向引物用这个tail“5
: '-GCTACTAGTCGATCGT-3'”你就肯定能扩到3’端，可以一步一步往3’端扩。
: 可能ronbell想说的也是这种方法吧？
: 其实Race最麻烦的还是5’-race。这以前一直用一个酶在cDNA的3’端加A。但不是很有
: 效，有时可以扩到5’端的序列有时弄很难
用RNA Ligase加一个自己设计的adaptor（DNA)到RNA的3'端，
然后用gene specific forward primer和adaptor specific reverse primer扩增
5'RACE也可以用这个方法做
我试过这个方法的3' RACE，还蛮方便的
因为我做的原核，没有poly-A tail，没有kit可以用
这个方法帮了我大忙
“5
【在 R*****w 的大作中提到】
: 这个是行不通的，一旦引物加到反应体系里了你就没法控制引物binding到那一端？
: 随机引物可以做正向的也可以做反向的。
: 但是我有一个方法，是我以前扩增Novel病毒是想到的，而且很有效。
: 在做反转录时用特殊的随机引物，在随机引物的5'端加一段已知序列例如：5'-
: GCTACTAGTCGATCGTnnnnnn-3'。这样你就在所有cDNA的5’端加了一个Tail。
: 然后做PCR时forward primer用你的5’端Gene specific引物，反向引物用这个tail“5
: '-GCTACTAGTCGATCGT-3'”你就肯定能扩到3’端，可以一步一步往3’端扩。
: 可能ronbell想说的也是这种方法吧？
: 其实Race最麻烦的还是5’-race。这以前一直用一个酶在cDNA的3’端加A。但不是很有
: 效，有时可以扩到5’端的序列有时弄很难
R*w
19 楼
你说的用RNA ligase我后来也见过。但直接在RT的时候加一个tail比那种合成cDNA后再加tail更方便、更有效。毕竟合成cDNA后，再加tail不是100％cDNA都会有tail。
我这个方法是我当时自己想到的，但我一直没发表，后来博士毕业了不做测序工作了，也没想过去发表。好多年了不知是否其他有人发表类似的方法，估计也会有其他人想到。
【在 C*******e 的大作中提到】
: 你想到的这个有个类似的方法几年前就有人发表了
: 用RNA Ligase加一个自己设计的adaptor（DNA)到RNA的3'端，
: 然后用gene specific forward primer和adaptor specific reverse primer扩增
: 5'RACE也可以用这个方法做
: 我试过这个方法的3' RACE，还蛮方便的
: 因为我做的原核，没有poly-A tail，没有kit可以用
: 这个方法帮了我大忙
:
: “5
我这个方法是我当时自己想到的，但我一直没发表，后来博士毕业了不做测序工作了，也没想过去发表。好多年了不知是否其他有人发表类似的方法，估计也会有其他人想到。
【在 C*******e 的大作中提到】
: 你想到的这个有个类似的方法几年前就有人发表了
: 用RNA Ligase加一个自己设计的adaptor（DNA)到RNA的3'端，
: 然后用gene specific forward primer和adaptor specific reverse primer扩增
: 5'RACE也可以用这个方法做
: 我试过这个方法的3' RACE，还蛮方便的
: 因为我做的原核，没有poly-A tail，没有kit可以用
: 这个方法帮了我大忙
:
: “5
R*w
20 楼
其实要做5'or3'race还有一种方法：用ligase把cNDA连成环状，然后用背对背的PCR引
物做PCR。可以同时把5'or3'序列都得到，这种方法理论上很perfect，但实际上还是不
太有效
物做PCR。可以同时把5'or3'序列都得到，这种方法理论上很perfect，但实际上还是不
太有效
p*p
21 楼
有意思。不过cDNA应该是RNA－DNA hybrid双链或者cDNA单链，应该用什么ligase？
【在 R*****w 的大作中提到】
: 其实要做5'or3'race还有一种方法：用ligase把cNDA连成环状，然后用背对背的PCR引
: 物做PCR。可以同时把5'or3'序列都得到，这种方法理论上很perfect，但实际上还是不
: 太有效
【在 R*****w 的大作中提到】
: 其实要做5'or3'race还有一种方法：用ligase把cNDA连成环状，然后用背对背的PCR引
: 物做PCR。可以同时把5'or3'序列都得到，这种方法理论上很perfect，但实际上还是不
: 太有效
p*p
22 楼
有意思。不过cDNA应该是RNA－DNA hybrid双链或者cDNA单链，应该用什么ligase？
【在 R*****w 的大作中提到】
: 其实要做5'or3'race还有一种方法：用ligase把cNDA连成环状，然后用背对背的PCR引
: 物做PCR。可以同时把5'or3'序列都得到，这种方法理论上很perfect，但实际上还是不
: 太有效
【在 R*****w 的大作中提到】
: 其实要做5'or3'race还有一种方法：用ligase把cNDA连成环状，然后用背对背的PCR引
: 物做PCR。可以同时把5'or3'序列都得到，这种方法理论上很perfect，但实际上还是不
: 太有效
C*e
23 楼
用RNA ligase的那个不是在合成cDNA以后加tail
是mRNA直接加tail
然后再RT-PCR
再加tail
更方便、更有效。毕竟合成cDNA后，再加tail不是100％cDNA都会有tail。
，也没想过去发
表。好多年了不知是否其他有人发表类似的方法，估计也会有其他人想到。
【在 R*****w 的大作中提到】
: 你说的用RNA ligase我后来也见过。但直接在RT的时候加一个tail比那种合成cDNA后再加tail更方便、更有效。毕竟合成cDNA后，再加tail不是100％cDNA都会有tail。
: 我这个方法是我当时自己想到的，但我一直没发表，后来博士毕业了不做测序工作了，也没想过去发表。好多年了不知是否其他有人发表类似的方法，估计也会有其他人想到。
是mRNA直接加tail
然后再RT-PCR
再加tail
更方便、更有效。毕竟合成cDNA后，再加tail不是100％cDNA都会有tail。
，也没想过去发
表。好多年了不知是否其他有人发表类似的方法，估计也会有其他人想到。
【在 R*****w 的大作中提到】
: 你说的用RNA ligase我后来也见过。但直接在RT的时候加一个tail比那种合成cDNA后再加tail更方便、更有效。毕竟合成cDNA后，再加tail不是100％cDNA都会有tail。
: 我这个方法是我当时自己想到的，但我一直没发表，后来博士毕业了不做测序工作了，也没想过去发表。好多年了不知是否其他有人发表类似的方法，估计也会有其他人想到。
C*e
24 楼
RNA ligase
RNA ligase可以催化RNA-RNA，RNA-DNA的ligation
而且其催化效率比DNA ligase高多了
可以说DNA ligase真是一个很烂的酶啊
【在 p****p 的大作中提到】
: 有意思。不过cDNA应该是RNA－DNA hybrid双链或者cDNA单链，应该用什么ligase？
RNA ligase可以催化RNA-RNA，RNA-DNA的ligation
而且其催化效率比DNA ligase高多了
可以说DNA ligase真是一个很烂的酶啊
【在 p****p 的大作中提到】
: 有意思。不过cDNA应该是RNA－DNA hybrid双链或者cDNA单链，应该用什么ligase？
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