h*r
2 楼
从细菌基因组中，能扩10 kb片段的吗？对保真度有一定的要求。
用Pfx还是Phusion？
希望有经验的给点建议。
多谢！！！
用Pfx还是Phusion？
希望有经验的给点建议。
多谢！！！
i*y
3 楼
【 以下文字转载自 JobHunting 讨论区 】
发信人: ibfly (ibfly), 信区: JobHunting
标 题: Sr. Engineer-CVD 帮递简历
发信站: BBS 未名空间站 (Wed Jan 7 21:15:07 2015, 美东)
可以帮忙递简历，[email protected]
/* */
Sr. Engineer-CVD Looking for a CVD engineer with strong background in
chemistry. Ph.D. with at least five years of work experience in developing
CVD coatings is required. The position will be located at the Corporate
Technology Center of Kennametal ( www.kennametal.com) at Latrobe, PA.
发信人: ibfly (ibfly), 信区: JobHunting
标 题: Sr. Engineer-CVD 帮递简历
发信站: BBS 未名空间站 (Wed Jan 7 21:15:07 2015, 美东)
可以帮忙递简历，[email protected]
/* */
Sr. Engineer-CVD Looking for a CVD engineer with strong background in
chemistry. Ph.D. with at least five years of work experience in developing
CVD coatings is required. The position will be located at the Corporate
Technology Center of Kennametal ( www.kennametal.com) at Latrobe, PA.
A*l
4 楼
正常开会，没有过乱七八糟的事情比如非法拘留什么的，通常都给半年，至少3m
你如果是想顺便玩玩，几乎可以肯定没有问题
【在 s******u 的大作中提到】
: 比如我往返机票间隔10天，I94表上就给10天么？
: 谢谢
你如果是想顺便玩玩，几乎可以肯定没有问题
【在 s******u 的大作中提到】
: 比如我往返机票间隔10天，I94表上就给10天么？
: 谢谢
b*n
5 楼
有难度吧，这一直是俺的梦想啊
【在 h**********r 的大作中提到】
: 从细菌基因组中，能扩10 kb片段的吗？对保真度有一定的要求。
: 用Pfx还是Phusion？
: 希望有经验的给点建议。
: 多谢！！！
【在 h**********r 的大作中提到】
: 从细菌基因组中，能扩10 kb片段的吗？对保真度有一定的要求。
: 用Pfx还是Phusion？
: 希望有经验的给点建议。
: 多谢！！！
h*r
6 楼
Thanks!那我分两把PCR吧。
C*e
7 楼
可以，我扩过，12kb
对细菌基因组的质量要求比较高
我是自己提的
跑胶没有smear，条带>46kb (single cut lambda DNA as marker)
然后用的TAKARA的LA PCR kit （Long&Accurate）
一次成功
就是筛没有error的克隆费了点劲
【在 h**********r 的大作中提到】
: 从细菌基因组中，能扩10 kb片段的吗？对保真度有一定的要求。
: 用Pfx还是Phusion？
: 希望有经验的给点建议。
: 多谢！！！
对细菌基因组的质量要求比较高
我是自己提的
跑胶没有smear，条带>46kb (single cut lambda DNA as marker)
然后用的TAKARA的LA PCR kit （Long&Accurate）
一次成功
就是筛没有error的克隆费了点劲
【在 h**********r 的大作中提到】
: 从细菌基因组中，能扩10 kb片段的吗？对保真度有一定的要求。
: 用Pfx还是Phusion？
: 希望有经验的给点建议。
: 多谢！！！
m*7
8 楼
长见识了,大牛啊
【在 C*******e 的大作中提到】
: 可以，我扩过，12kb
: 对细菌基因组的质量要求比较高
: 我是自己提的
: 跑胶没有smear，条带>46kb (single cut lambda DNA as marker)
: 然后用的TAKARA的LA PCR kit （Long&Accurate）
: 一次成功
: 就是筛没有error的克隆费了点劲
【在 C*******e 的大作中提到】
: 可以，我扩过，12kb
: 对细菌基因组的质量要求比较高
: 我是自己提的
: 跑胶没有smear，条带>46kb (single cut lambda DNA as marker)
: 然后用的TAKARA的LA PCR kit （Long&Accurate）
: 一次成功
: 就是筛没有error的克隆费了点劲
k*o
9 楼
没阔增过这么大的DNA,能说一说提genome DNA的时候有什么具体注意事项,才能让条件
温和,防止nick?纯度也要高吗?
【在 C*******e 的大作中提到】
: 可以，我扩过，12kb
: 对细菌基因组的质量要求比较高
: 我是自己提的
: 跑胶没有smear，条带>46kb (single cut lambda DNA as marker)
: 然后用的TAKARA的LA PCR kit （Long&Accurate）
: 一次成功
: 就是筛没有error的克隆费了点劲
温和,防止nick?纯度也要高吗?
【在 C*******e 的大作中提到】
: 可以，我扩过，12kb
: 对细菌基因组的质量要求比较高
: 我是自己提的
: 跑胶没有smear，条带>46kb (single cut lambda DNA as marker)
: 然后用的TAKARA的LA PCR kit （Long&Accurate）
: 一次成功
: 就是筛没有error的克隆费了点劲
h*r
10 楼
筛没有error的克隆，这个有啥技巧？
LA PCR kit （Long&Accurate）的保真度有多高？
多谢！
LA PCR kit （Long&Accurate）的保真度有多高？
多谢！
C*e
11 楼
没什么特别要注意的
无非是不要vortex
混匀的步骤要温柔
不要用枪反复吹吸
之类的
反正要扩大的片段的话最好手工提
CTAB（optional，取决于你的实验对象），酚氯仿，isopropanol沉淀
最后RNase A处理
不要用kit
kit提出来的对于小片段复制还行
大了就可能不行了
【在 k*****o 的大作中提到】
: 没阔增过这么大的DNA,能说一说提genome DNA的时候有什么具体注意事项,才能让条件
: 温和,防止nick?纯度也要高吗?
无非是不要vortex
混匀的步骤要温柔
不要用枪反复吹吸
之类的
反正要扩大的片段的话最好手工提
CTAB（optional，取决于你的实验对象），酚氯仿，isopropanol沉淀
最后RNase A处理
不要用kit
kit提出来的对于小片段复制还行
大了就可能不行了
【在 k*****o 的大作中提到】
: 没阔增过这么大的DNA,能说一说提genome DNA的时候有什么具体注意事项,才能让条件
: 温和,防止nick?纯度也要高吗?
C*e
12 楼
筛选没有技巧
就是不停地送出去测序呗
然后片段比较大你肯定要设计不少sequencing primer才能保证都覆盖到
就是先送出去一批只从两端测
正确的克隆再送出去进行下一批测序
这是省钱费时间的做法
要是你老板不care
你就一股脑儿都送出去咯，所有的sequencing primer一起测
呵呵
我记得TAKARA的LA里面是Taq和另外某个带proof reading的DNA polymerase的混合
Taq保证扩增速度，另外一个减少出错率
但是混合的比例好像有讲究
以前看过原始的文献
但是一时半会儿找不到了
也记不清楚了，不想误导你
【在 h**********r 的大作中提到】
: 筛没有error的克隆，这个有啥技巧？
: LA PCR kit （Long&Accurate）的保真度有多高？
: 多谢！
就是不停地送出去测序呗
然后片段比较大你肯定要设计不少sequencing primer才能保证都覆盖到
就是先送出去一批只从两端测
正确的克隆再送出去进行下一批测序
这是省钱费时间的做法
要是你老板不care
你就一股脑儿都送出去咯，所有的sequencing primer一起测
呵呵
我记得TAKARA的LA里面是Taq和另外某个带proof reading的DNA polymerase的混合
Taq保证扩增速度，另外一个减少出错率
但是混合的比例好像有讲究
以前看过原始的文献
但是一时半会儿找不到了
也记不清楚了，不想误导你
【在 h**********r 的大作中提到】
: 筛没有error的克隆，这个有啥技巧？
: LA PCR kit （Long&Accurate）的保真度有多高？
: 多谢！
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