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请教一个非常规实验(大载体连接)手段是否可行
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请教一个非常规实验(大载体连接)手段是否可行# Biology - 生物学
b*7
1
可能会于年底去加拿大开会。
但是我的h1b entry visa已经过期了。
在网上查了下,好像我这种情况符合所谓的automatic revalidation.
想问一下,这个provision现在是不是还有效?
谨慎一点。
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u*l
2
是啥道理?
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m*5
3
现在在进行一个大载体(13k)单酶切连接大片段实验
因为遇到种种问题一直不奏效,所以想设计实验把连接步骤改造为双酶切
方法设想为:将大载体单酶切线性化后,用PCR引物把线性化的质粒p出来,期中一端引
物添加一个新酶,之后把pcr产物胶回收后用新酶进行一次酶切,就形成了两个粘性末
端,于是就成为双酶切连接。
请问这样可行么? 另外 ,LA Taq引入突变的几率大么
另外,补充问题,这么大的质粒用pfu做定点突变靠谱么/
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S*I
4
有效

【在 b*********7 的大作中提到】
: 可能会于年底去加拿大开会。
: 但是我的h1b entry visa已经过期了。
: 在网上查了下,好像我这种情况符合所谓的automatic revalidation.
: 想问一下,这个provision现在是不是还有效?
: 谨慎一点。

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t*b
5
这个片子目前没有在电视台放,是通过其他渠道流出的。
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g*1
6
不需要线性化,直接在两头引物加两个位点,PCR以后双酶切,或者末端填平磷酸化自
连转化扩增后再双酶切。LA-taq突变率挺高的,建议phusion。
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b*7
7
Thanks

【在 S**I 的大作中提到】
: 有效
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u*l
8
难怪,个人嚼着很好看

【在 t**b 的大作中提到】
: 这个片子目前没有在电视台放,是通过其他渠道流出的。
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o*r
9
以前有那种定点mutagenesis的protocol,用含mutation的primers和high fidality的
polymerase做linear amplification,然后用只切methylated DNA的RE处理,再
transformation。这样以后想怎么用都行。
现在不用这个protocol了?
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L*d
10
好像只适用于陆路去的
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F*y
11
我看youtube貌似是台湾电视台播的
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g*1
12
他要加至少6个碱基进去,用mutagenesis恐怕不行吧
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f*n
13
nope

【在 L*******d 的大作中提到】
: 好像只适用于陆路去的
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V*8
14
看了两集睡着了。。。
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o*r
15
没必要6个全改吧。。。

【在 g******1 的大作中提到】
: 他要加至少6个碱基进去,用mutagenesis恐怕不行吧
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b*r
16
施公案已经到三十级了

【在 u**********l 的大作中提到】
: 是啥道理?
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m*5
17
这个我做过,但没在这么大的质粒上做过……

【在 o********r 的大作中提到】
: 以前有那种定点mutagenesis的protocol,用含mutation的primers和high fidality的
: polymerase做linear amplification,然后用只切methylated DNA的RE处理,再
: transformation。这样以后想怎么用都行。
: 现在不用这个protocol了?

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a*t
18
啊?那天线宝那里有没更新啊?

【在 b****r 的大作中提到】
: 施公案已经到三十级了
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s*y
19
Not a good idea.
It is better to insert a cassette into the big plasmid to make it a multiple
restriction site.

【在 m******5 的大作中提到】
: 现在在进行一个大载体(13k)单酶切连接大片段实验
: 因为遇到种种问题一直不奏效,所以想设计实验把连接步骤改造为双酶切
: 方法设想为:将大载体单酶切线性化后,用PCR引物把线性化的质粒p出来,期中一端引
: 物添加一个新酶,之后把pcr产物胶回收后用新酶进行一次酶切,就形成了两个粘性末
: 端,于是就成为双酶切连接。
: 请问这样可行么? 另外 ,LA Taq引入突变的几率大么
: 另外,补充问题,这么大的质粒用pfu做定点突变靠谱么/

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S*a
20
我已经等了好几周了,一直告诉自己淡定
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o*r
21
这个和你想P出来原理基本上一样,差别是一个用E coli来扩增,一个用PCR,我还是相
信E coli多些

【在 m******5 的大作中提到】
: 这个我做过,但没在这么大的质粒上做过……
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m*d
22
估计被广大皇汉给灭了吧,像大漠谣一样
不过也是个烂片

【在 u**********l 的大作中提到】
: 是啥道理?
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n*k
23
simply modify the vector first by fusion PCR (about anywhere 200bp-1kb)
introducing the desired cut site at
the desired position...and then do whatever you want...I would't trust any
PCR with a 13KB template without
sequencing...if u are luck, everything might be alright but u could end up
in dark having no clue what's gone
wrong...If you want to do the cloning in a single step which I won't
recommend if not an experienced one, just
go three piece or even four piece ligation... that way, u might just get
around the problem or introducing the
cut site and the insert at a same time...Anyway, the fact is in most if not
all scenarios, one could always find
alternative ways to do clonings.. I have yet run into any cloning I could
not come up with an alternative
strategy...and a last comment: sometimes detour is shortcut

【在 m******5 的大作中提到】
: 现在在进行一个大载体(13k)单酶切连接大片段实验
: 因为遇到种种问题一直不奏效,所以想设计实验把连接步骤改造为双酶切
: 方法设想为:将大载体单酶切线性化后,用PCR引物把线性化的质粒p出来,期中一端引
: 物添加一个新酶,之后把pcr产物胶回收后用新酶进行一次酶切,就形成了两个粘性末
: 端,于是就成为双酶切连接。
: 请问这样可行么? 另外 ,LA Taq引入突变的几率大么
: 另外,补充问题,这么大的质粒用pfu做定点突变靠谱么/

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f*e
25
if he can insert MCS easily, he also can put his gene or some element into t
he single cut backbone.
i think the pcr protocol for such a big plasmid is not a good idea. why not
try enough enzyme digestion and dephosphate the backbone, in principle, 50%
ligation would be correct.

multiple

【在 s******y 的大作中提到】
: Not a good idea.
: It is better to insert a cassette into the big plasmid to make it a multiple
: restriction site.

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i*t
26
30集了
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b*n
27
我用PFU做过接近10k的质粒的点突变
取决于引物的设计和高效率的感受态
13k应该也可以吧

【在 m******5 的大作中提到】
: 现在在进行一个大载体(13k)单酶切连接大片段实验
: 因为遇到种种问题一直不奏效,所以想设计实验把连接步骤改造为双酶切
: 方法设想为:将大载体单酶切线性化后,用PCR引物把线性化的质粒p出来,期中一端引
: 物添加一个新酶,之后把pcr产物胶回收后用新酶进行一次酶切,就形成了两个粘性末
: 端,于是就成为双酶切连接。
: 请问这样可行么? 另外 ,LA Taq引入突变的几率大么
: 另外,补充问题,这么大的质粒用pfu做定点突变靠谱么/

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S*a
28
看到第三个故事,觉得彻底没意思了。施什么轮儿真的挺没劲的。那个什么王爷为了谈
恋爱真的什么都不顾,对这种人实在没什么好感。
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m*5
29
非常感谢各位的建议!
正在继续考虑中……
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