K*e
2 楼
我最近几天遇到一个wb问题。别人做的一个多抗，在他手里，一抗1:500 二抗1: 10000
很干净，几乎没有非特异的带。在
我手里，同样的稀释比例，检测同样的细胞抽提物，无数条带，而且连marker都出来了
。我一抗稀释到1: 1000,1:2000还
是有很多非特异的带，主带区分不出来。二抗稀释到1:20000就没信号了。
我是没办法了。不知道为什么。百思不得其解。有什么建议吗？
怀疑自己手笨。别人用的好好的，到我手里怎么就不work。
incubation时间一样 一抗室温一小时 二抗半小时 洗得也一样啊 每个都是3个8分钟
牛奶封闭也一样 室温一小时百分之5牛
奶
他那个抗体是ChIP级的 人家都用来做ChIP了 效果很好。在我手里这个德性 哭死
很干净，几乎没有非特异的带。在
我手里，同样的稀释比例，检测同样的细胞抽提物，无数条带，而且连marker都出来了
。我一抗稀释到1: 1000,1:2000还
是有很多非特异的带，主带区分不出来。二抗稀释到1:20000就没信号了。
我是没办法了。不知道为什么。百思不得其解。有什么建议吗？
怀疑自己手笨。别人用的好好的，到我手里怎么就不work。
incubation时间一样 一抗室温一小时 二抗半小时 洗得也一样啊 每个都是3个8分钟
牛奶封闭也一样 室温一小时百分之5牛
奶
他那个抗体是ChIP级的 人家都用来做ChIP了 效果很好。在我手里这个德性 哭死
j*u
3 楼
刘备介绍自己的时候居然不说自己是汉室宗亲？
【在 S**********u 的大作中提到】
: 尼玛，三国之最风流终于写到刘皇叔了。不知道荀贞是否会就势把这厮招揽了。
【在 S**********u 的大作中提到】
: 尼玛，三国之最风流终于写到刘皇叔了。不知道荀贞是否会就势把这厮招揽了。
b*2
4 楼
Blocking? BSA? Milk?
10000
【在 K**********e 的大作中提到】
: 我最近几天遇到一个wb问题。别人做的一个多抗，在他手里，一抗1:500 二抗1: 10000
: 很干净，几乎没有非特异的带。在
: 我手里，同样的稀释比例，检测同样的细胞抽提物，无数条带，而且连marker都出来了
: 。我一抗稀释到1: 1000,1:2000还
: 是有很多非特异的带，主带区分不出来。二抗稀释到1:20000就没信号了。
: 我是没办法了。不知道为什么。百思不得其解。有什么建议吗？
: 怀疑自己手笨。别人用的好好的，到我手里怎么就不work。
: incubation时间一样 一抗室温一小时 二抗半小时 洗得也一样啊 每个都是3个8分钟
: 牛奶封闭也一样 室温一小时百分之5牛
: 奶
10000
【在 K**********e 的大作中提到】
: 我最近几天遇到一个wb问题。别人做的一个多抗，在他手里，一抗1:500 二抗1: 10000
: 很干净，几乎没有非特异的带。在
: 我手里，同样的稀释比例，检测同样的细胞抽提物，无数条带，而且连marker都出来了
: 。我一抗稀释到1: 1000,1:2000还
: 是有很多非特异的带，主带区分不出来。二抗稀释到1:20000就没信号了。
: 我是没办法了。不知道为什么。百思不得其解。有什么建议吗？
: 怀疑自己手笨。别人用的好好的，到我手里怎么就不work。
: incubation时间一样 一抗室温一小时 二抗半小时 洗得也一样啊 每个都是3个8分钟
: 牛奶封闭也一样 室温一小时百分之5牛
: 奶
h*k
5 楼
刘备这种人是不会甘于屈居人下的
【在 S**********u 的大作中提到】
: 尼玛，三国之最风流终于写到刘皇叔了。不知道荀贞是否会就势把这厮招揽了。
【在 S**********u 的大作中提到】
: 尼玛，三国之最风流终于写到刘皇叔了。不知道荀贞是否会就势把这厮招揽了。
s*y
6 楼
你应该在同一个胶上放进一个positive control, one negative control.
然后再试一次。别人用的情况不能直接搬到你那里。
10000
【在 K**********e 的大作中提到】
: 我最近几天遇到一个wb问题。别人做的一个多抗，在他手里，一抗1:500 二抗1: 10000
: 很干净，几乎没有非特异的带。在
: 我手里，同样的稀释比例，检测同样的细胞抽提物，无数条带，而且连marker都出来了
: 。我一抗稀释到1: 1000,1:2000还
: 是有很多非特异的带，主带区分不出来。二抗稀释到1:20000就没信号了。
: 我是没办法了。不知道为什么。百思不得其解。有什么建议吗？
: 怀疑自己手笨。别人用的好好的，到我手里怎么就不work。
: incubation时间一样 一抗室温一小时 二抗半小时 洗得也一样啊 每个都是3个8分钟
: 牛奶封闭也一样 室温一小时百分之5牛
: 奶
然后再试一次。别人用的情况不能直接搬到你那里。
10000
【在 K**********e 的大作中提到】
: 我最近几天遇到一个wb问题。别人做的一个多抗，在他手里，一抗1:500 二抗1: 10000
: 很干净，几乎没有非特异的带。在
: 我手里，同样的稀释比例，检测同样的细胞抽提物，无数条带，而且连marker都出来了
: 。我一抗稀释到1: 1000,1:2000还
: 是有很多非特异的带，主带区分不出来。二抗稀释到1:20000就没信号了。
: 我是没办法了。不知道为什么。百思不得其解。有什么建议吗？
: 怀疑自己手笨。别人用的好好的，到我手里怎么就不work。
: incubation时间一样 一抗室温一小时 二抗半小时 洗得也一样啊 每个都是3个8分钟
: 牛奶封闭也一样 室温一小时百分之5牛
: 奶
T*c
7 楼
我叫山鸡，鸡巴的鸡
o*4
8 楼
block时间长一点，1小时吧，
然后就是二抗之后使劲洗，背景会好很多，我都是至少3次1小时的洗的
10000
【在 K**********e 的大作中提到】
: 我最近几天遇到一个wb问题。别人做的一个多抗，在他手里，一抗1:500 二抗1: 10000
: 很干净，几乎没有非特异的带。在
: 我手里，同样的稀释比例，检测同样的细胞抽提物，无数条带，而且连marker都出来了
: 。我一抗稀释到1: 1000,1:2000还
: 是有很多非特异的带，主带区分不出来。二抗稀释到1:20000就没信号了。
: 我是没办法了。不知道为什么。百思不得其解。有什么建议吗？
: 怀疑自己手笨。别人用的好好的，到我手里怎么就不work。
: incubation时间一样 一抗室温一小时 二抗半小时 洗得也一样啊 每个都是3个8分钟
: 牛奶封闭也一样 室温一小时百分之5牛
: 奶
然后就是二抗之后使劲洗，背景会好很多，我都是至少3次1小时的洗的
10000
【在 K**********e 的大作中提到】
: 我最近几天遇到一个wb问题。别人做的一个多抗，在他手里，一抗1:500 二抗1: 10000
: 很干净，几乎没有非特异的带。在
: 我手里，同样的稀释比例，检测同样的细胞抽提物，无数条带，而且连marker都出来了
: 。我一抗稀释到1: 1000,1:2000还
: 是有很多非特异的带，主带区分不出来。二抗稀释到1:20000就没信号了。
: 我是没办法了。不知道为什么。百思不得其解。有什么建议吗？
: 怀疑自己手笨。别人用的好好的，到我手里怎么就不work。
: incubation时间一样 一抗室温一小时 二抗半小时 洗得也一样啊 每个都是3个8分钟
: 牛奶封闭也一样 室温一小时百分之5牛
: 奶
W*C
9 楼
你蛋白上样没加多了吧？你的抗体没变性吧？ 用前高速离心一下
你可以自己trouble shooting 啊 比如不加1抗 只加2抗看是不是很多带
你可以自己trouble shooting 啊 比如不加1抗 只加2抗看是不是很多带
o*4
10 楼
最好在4度冷室做western，室温抗体失活比较快（如果反复使用抗体的话）
10000
【在 K**********e 的大作中提到】
: 我最近几天遇到一个wb问题。别人做的一个多抗，在他手里，一抗1:500 二抗1: 10000
: 很干净，几乎没有非特异的带。在
: 我手里，同样的稀释比例，检测同样的细胞抽提物，无数条带，而且连marker都出来了
: 。我一抗稀释到1: 1000,1:2000还
: 是有很多非特异的带，主带区分不出来。二抗稀释到1:20000就没信号了。
: 我是没办法了。不知道为什么。百思不得其解。有什么建议吗？
: 怀疑自己手笨。别人用的好好的，到我手里怎么就不work。
: incubation时间一样 一抗室温一小时 二抗半小时 洗得也一样啊 每个都是3个8分钟
: 牛奶封闭也一样 室温一小时百分之5牛
: 奶
10000
【在 K**********e 的大作中提到】
: 我最近几天遇到一个wb问题。别人做的一个多抗，在他手里，一抗1:500 二抗1: 10000
: 很干净，几乎没有非特异的带。在
: 我手里，同样的稀释比例，检测同样的细胞抽提物，无数条带，而且连marker都出来了
: 。我一抗稀释到1: 1000,1:2000还
: 是有很多非特异的带，主带区分不出来。二抗稀释到1:20000就没信号了。
: 我是没办法了。不知道为什么。百思不得其解。有什么建议吗？
: 怀疑自己手笨。别人用的好好的，到我手里怎么就不work。
: incubation时间一样 一抗室温一小时 二抗半小时 洗得也一样啊 每个都是3个8分钟
: 牛奶封闭也一样 室温一小时百分之5牛
: 奶
n*w
11 楼
让我想起来那个印度阿三sabotage的故事。。。
p*i
12 楼
有没有可能你 转膜 的某些细节和别人不同？
【在 K**********e 的大作中提到】
: 我最近几天遇到一个wb问题。别人做的一个多抗，在他手里，一抗1:500 二抗1: 10000
: 很干净，几乎没有非特异的带。在
: 我手里，同样的稀释比例，检测同样的细胞抽提物，无数条带，而且连marker都出来了
: 。我一抗稀释到1: 1000,1:2000还
: 是有很多非特异的带，主带区分不出来。二抗稀释到1:20000就没信号了。
: 我是没办法了。不知道为什么。百思不得其解。有什么建议吗？
: 怀疑自己手笨。别人用的好好的，到我手里怎么就不work。
: incubation时间一样 一抗室温一小时 二抗半小时 洗得也一样啊 每个都是3个8分钟
: 牛奶封闭也一样 室温一小时百分之5牛
: 奶
【在 K**********e 的大作中提到】
: 我最近几天遇到一个wb问题。别人做的一个多抗，在他手里，一抗1:500 二抗1: 10000
: 很干净，几乎没有非特异的带。在
: 我手里，同样的稀释比例，检测同样的细胞抽提物，无数条带，而且连marker都出来了
: 。我一抗稀释到1: 1000,1:2000还
: 是有很多非特异的带，主带区分不出来。二抗稀释到1:20000就没信号了。
: 我是没办法了。不知道为什么。百思不得其解。有什么建议吗？
: 怀疑自己手笨。别人用的好好的，到我手里怎么就不work。
: incubation时间一样 一抗室温一小时 二抗半小时 洗得也一样啊 每个都是3个8分钟
: 牛奶封闭也一样 室温一小时百分之5牛
: 奶
s*g
13 楼
洗的时间和TBST溶液的体积都有关。
多用TBST溶液，每次洗10分钟
显影时间长，背景就多。
10000
【在 K**********e 的大作中提到】
: 我最近几天遇到一个wb问题。别人做的一个多抗，在他手里，一抗1:500 二抗1: 10000
: 很干净，几乎没有非特异的带。在
: 我手里，同样的稀释比例，检测同样的细胞抽提物，无数条带，而且连marker都出来了
: 。我一抗稀释到1: 1000,1:2000还
: 是有很多非特异的带，主带区分不出来。二抗稀释到1:20000就没信号了。
: 我是没办法了。不知道为什么。百思不得其解。有什么建议吗？
: 怀疑自己手笨。别人用的好好的，到我手里怎么就不work。
: incubation时间一样 一抗室温一小时 二抗半小时 洗得也一样啊 每个都是3个8分钟
: 牛奶封闭也一样 室温一小时百分之5牛
: 奶
多用TBST溶液，每次洗10分钟
显影时间长，背景就多。
10000
【在 K**********e 的大作中提到】
: 我最近几天遇到一个wb问题。别人做的一个多抗，在他手里，一抗1:500 二抗1: 10000
: 很干净，几乎没有非特异的带。在
: 我手里，同样的稀释比例，检测同样的细胞抽提物，无数条带，而且连marker都出来了
: 。我一抗稀释到1: 1000,1:2000还
: 是有很多非特异的带，主带区分不出来。二抗稀释到1:20000就没信号了。
: 我是没办法了。不知道为什么。百思不得其解。有什么建议吗？
: 怀疑自己手笨。别人用的好好的，到我手里怎么就不work。
: incubation时间一样 一抗室温一小时 二抗半小时 洗得也一样啊 每个都是3个8分钟
: 牛奶封闭也一样 室温一小时百分之5牛
: 奶
v*a
14 楼
如果你们的抗体是同一lot的，并且是作为一抗重复使用的（假设其它条件都完全一致
），那你把你的用多了几次以后看看是否杂band会少点。
我曾遇到过有的抗体越用越干净的情况。刚用的几次会很脏。
10000
【在 K**********e 的大作中提到】
: 我最近几天遇到一个wb问题。别人做的一个多抗，在他手里，一抗1:500 二抗1: 10000
: 很干净，几乎没有非特异的带。在
: 我手里，同样的稀释比例，检测同样的细胞抽提物，无数条带，而且连marker都出来了
: 。我一抗稀释到1: 1000,1:2000还
: 是有很多非特异的带，主带区分不出来。二抗稀释到1:20000就没信号了。
: 我是没办法了。不知道为什么。百思不得其解。有什么建议吗？
: 怀疑自己手笨。别人用的好好的，到我手里怎么就不work。
: incubation时间一样 一抗室温一小时 二抗半小时 洗得也一样啊 每个都是3个8分钟
: 牛奶封闭也一样 室温一小时百分之5牛
: 奶
），那你把你的用多了几次以后看看是否杂band会少点。
我曾遇到过有的抗体越用越干净的情况。刚用的几次会很脏。
10000
【在 K**********e 的大作中提到】
: 我最近几天遇到一个wb问题。别人做的一个多抗，在他手里，一抗1:500 二抗1: 10000
: 很干净，几乎没有非特异的带。在
: 我手里，同样的稀释比例，检测同样的细胞抽提物，无数条带，而且连marker都出来了
: 。我一抗稀释到1: 1000,1:2000还
: 是有很多非特异的带，主带区分不出来。二抗稀释到1:20000就没信号了。
: 我是没办法了。不知道为什么。百思不得其解。有什么建议吗？
: 怀疑自己手笨。别人用的好好的，到我手里怎么就不work。
: incubation时间一样 一抗室温一小时 二抗半小时 洗得也一样啊 每个都是3个8分钟
: 牛奶封闭也一样 室温一小时百分之5牛
: 奶
c*r
15 楼
不知道你是新手还是老手？
大侠咱们不熟哈，这个问题要是冒犯请原谅哈。
我问这个的原因是如果是新手，那原因可能是很简单的，比如二抗之后是用PBS还是
milk洗的？二抗多用1：10000，不用自己调整。一般都调整一抗就可以了。。。可能是
些非常简单的原因哈
如果是千佬，跑的胶比别人吃的糕还多，那多半不是技术原因。。。比如，你的抗体值
钱不？能不能自己单独弄一份，或者偷偷跟别的实验室借一点？这个别人其他实验结果
怎么样？给出的结果是原片还是powerpoint？
10000
【在 K**********e 的大作中提到】
: 我最近几天遇到一个wb问题。别人做的一个多抗，在他手里，一抗1:500 二抗1: 10000
: 很干净，几乎没有非特异的带。在
: 我手里，同样的稀释比例，检测同样的细胞抽提物，无数条带，而且连marker都出来了
: 。我一抗稀释到1: 1000,1:2000还
: 是有很多非特异的带，主带区分不出来。二抗稀释到1:20000就没信号了。
: 我是没办法了。不知道为什么。百思不得其解。有什么建议吗？
: 怀疑自己手笨。别人用的好好的，到我手里怎么就不work。
: incubation时间一样 一抗室温一小时 二抗半小时 洗得也一样啊 每个都是3个8分钟
: 牛奶封闭也一样 室温一小时百分之5牛
: 奶
大侠咱们不熟哈，这个问题要是冒犯请原谅哈。
我问这个的原因是如果是新手，那原因可能是很简单的，比如二抗之后是用PBS还是
milk洗的？二抗多用1：10000，不用自己调整。一般都调整一抗就可以了。。。可能是
些非常简单的原因哈
如果是千佬，跑的胶比别人吃的糕还多，那多半不是技术原因。。。比如，你的抗体值
钱不？能不能自己单独弄一份，或者偷偷跟别的实验室借一点？这个别人其他实验结果
怎么样？给出的结果是原片还是powerpoint？
10000
【在 K**********e 的大作中提到】
: 我最近几天遇到一个wb问题。别人做的一个多抗，在他手里，一抗1:500 二抗1: 10000
: 很干净，几乎没有非特异的带。在
: 我手里，同样的稀释比例，检测同样的细胞抽提物，无数条带，而且连marker都出来了
: 。我一抗稀释到1: 1000,1:2000还
: 是有很多非特异的带，主带区分不出来。二抗稀释到1:20000就没信号了。
: 我是没办法了。不知道为什么。百思不得其解。有什么建议吗？
: 怀疑自己手笨。别人用的好好的，到我手里怎么就不work。
: incubation时间一样 一抗室温一小时 二抗半小时 洗得也一样啊 每个都是3个8分钟
: 牛奶封闭也一样 室温一小时百分之5牛
: 奶
C*r
16 楼
我也是约来越不会做western了
在以前实验室，从没做过的三四个内源蛋白CoIP，一次就能做出来
现在实验室，这次有的信号（doublet磷酸化band）下次就没有了（只有脏背景，没有
条带），搞得我每次去显影都提心吊胆
即使cell line相同，抗体相同，稀释倍数相同，一个人western跟另一个人western不
一样的可能原因太多了，试着列举一下：
1、cell lysis buffer的离子强度和去污剂强度不同，裂解时间长短不同，导致你们
lysate里的蛋白种量有差异；至于要看磷酸化band的话，裂解液是否加phosphotate
inhibitor, 加的种类，也超级影响结果。我不加phosphotase inhibitor的话，有时候
可以看到band shift，但更多时候看不到。
2、SDS胶的浓度，Tris的浓度和pH；这个有人说有影响，我还没有比较过。
3、转膜的电流、时间、温度，以及转膜液里的离子强度（Tris和Glycine的量）,以及
是否加有SDS，都会影响转膜效果。个别抗体对转膜有没有SDS会很敏感，没有哪个配方
是绝对的好。
4、一抗和二抗的稀释倍率、时间长短、和温度条件。在你的case里，温度时间和稀释
都跟另外那个人相同，应该不是这一步的原因。eg.有些弱的信号，RT短时看不到，RT
长时就被背景盖住，只有4C长时才可以看到。
5、洗膜的时间和温度。
6、ECL等的品牌，曝光时间等。
在以前实验室，从没做过的三四个内源蛋白CoIP，一次就能做出来
现在实验室，这次有的信号（doublet磷酸化band）下次就没有了（只有脏背景，没有
条带），搞得我每次去显影都提心吊胆
即使cell line相同，抗体相同，稀释倍数相同，一个人western跟另一个人western不
一样的可能原因太多了，试着列举一下：
1、cell lysis buffer的离子强度和去污剂强度不同，裂解时间长短不同，导致你们
lysate里的蛋白种量有差异；至于要看磷酸化band的话，裂解液是否加phosphotate
inhibitor, 加的种类，也超级影响结果。我不加phosphotase inhibitor的话，有时候
可以看到band shift，但更多时候看不到。
2、SDS胶的浓度，Tris的浓度和pH；这个有人说有影响，我还没有比较过。
3、转膜的电流、时间、温度，以及转膜液里的离子强度（Tris和Glycine的量）,以及
是否加有SDS，都会影响转膜效果。个别抗体对转膜有没有SDS会很敏感，没有哪个配方
是绝对的好。
4、一抗和二抗的稀释倍率、时间长短、和温度条件。在你的case里，温度时间和稀释
都跟另外那个人相同，应该不是这一步的原因。eg.有些弱的信号，RT短时看不到，RT
长时就被背景盖住，只有4C长时才可以看到。
5、洗膜的时间和温度。
6、ECL等的品牌，曝光时间等。
y*1
17 楼
protein degradation
solution: add more PI, lyse as quick as possible, as cold as possible
solution: add more PI, lyse as quick as possible, as cold as possible
k*6
18 楼
我不是很懂哈，原理上来说block是不是应该block膜上未结合蛋白的位点啊？所以
block不好是不是应该背景很脏，而不是出现非特异条带啊？
block不好是不是应该背景很脏，而不是出现非特异条带啊？
c*r
19 楼
8888
c*r
20 楼
8888
c*r
21 楼
8888
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