w*i
2 楼
【 以下文字转载自 NCAA 讨论区 】
发信人: SinoGator (Grossman's Brother), 信区: NCAA
标 题: Re: 【麻雀征文】千老，文科女，及他们的春天 (转载)
发信站: BBS 未名空间站 (Mon Mar 11 16:24:18 2013, 美东)
坑爹的分段
========================
昨晚到了老K家里，孩子们都不在家，跟单身宿舍没有两样。
大家摆好桌子，打风落座，开始了搬砖工程。当前的热门话题，就是联邦政府削减开支
，NIH 要压缩 Grants 了。大家都忧心忡忡自己的位置会不保或几年后的前途。
老K杠上开花，不紧不慢地说，你们知道么，Clemson， LSU 和 UF 都offer了我
Scientist 或 RP（research professor）等permanent的职位，但我都没接受。我们哈
哈大笑，说，老K，现在离四月一号还有22天，你别开玩笑了。
老K严肃地说，哥们，真的。我小儿子Rob打橄榄球很好，这几个学校都想要，给我工作
是他们开的条件之一。Clemson的教练想包机去尼日利亚去说服你K嫂，被你K嫂拒绝了
。我们想，过三年，等 Rob 能打职业比赛了，年薪至少几百万起，我犯不着为了10万
八万坏了名头。
我们都听呆了，真的shock了。那种感觉，难以言表。
老K接着说，你K嫂马上要回来了，我们一家以后就可以买车买房团聚了。兄弟，说实在
的，刷试管杀老鼠这都是末节，早娶老婆多生娃才是正道。你有Cell三篇，不抵我好儿
一个。
我们都木鸡状，想不到蔫不拉几的老K能说出如此大道理。可是，会有谁看上我们这苦
逼的薄厚呢？
老K看懂了我们的心思，说，我老婆有个妹妹，你们谁考虑一下？
接盘，还是不接？
老K的春天快到了，我的呢？
发信人: SinoGator (Grossman's Brother), 信区: NCAA
标 题: Re: 【麻雀征文】千老，文科女，及他们的春天 (转载)
发信站: BBS 未名空间站 (Mon Mar 11 16:24:18 2013, 美东)
坑爹的分段
========================
昨晚到了老K家里，孩子们都不在家，跟单身宿舍没有两样。
大家摆好桌子，打风落座，开始了搬砖工程。当前的热门话题，就是联邦政府削减开支
，NIH 要压缩 Grants 了。大家都忧心忡忡自己的位置会不保或几年后的前途。
老K杠上开花，不紧不慢地说，你们知道么，Clemson， LSU 和 UF 都offer了我
Scientist 或 RP（research professor）等permanent的职位，但我都没接受。我们哈
哈大笑，说，老K，现在离四月一号还有22天，你别开玩笑了。
老K严肃地说，哥们，真的。我小儿子Rob打橄榄球很好，这几个学校都想要，给我工作
是他们开的条件之一。Clemson的教练想包机去尼日利亚去说服你K嫂，被你K嫂拒绝了
。我们想，过三年，等 Rob 能打职业比赛了，年薪至少几百万起，我犯不着为了10万
八万坏了名头。
我们都听呆了，真的shock了。那种感觉，难以言表。
老K接着说，你K嫂马上要回来了，我们一家以后就可以买车买房团聚了。兄弟，说实在
的，刷试管杀老鼠这都是末节，早娶老婆多生娃才是正道。你有Cell三篇，不抵我好儿
一个。
我们都木鸡状，想不到蔫不拉几的老K能说出如此大道理。可是，会有谁看上我们这苦
逼的薄厚呢？
老K看懂了我们的心思，说，我老婆有个妹妹，你们谁考虑一下？
接盘，还是不接？
老K的春天快到了，我的呢？
c*l
3 楼
谢谢。
d*e
4 楼
b*l
5 楼
Anybody has experience with an RNA purification kit(Phenol and Chloriform
free)? I only found one from Norgen? Anybody knows if it's reliable?
Thanks a lot.
free)? I only found one from Norgen? Anybody knows if it's reliable?
Thanks a lot.
c*2
6 楼
if you have J1 waiver, you can do H1/H4 without need to leave USA.
Otherwise, COS should bot be approved and you need to enter with H visa
stamp.
Otherwise, COS should bot be approved and you need to enter with H visa
stamp.
d*e
7 楼
小姨飞奔跑去接盘了
【在 w***i 的大作中提到】
: 【 以下文字转载自 NCAA 讨论区 】
: 发信人: SinoGator (Grossman's Brother), 信区: NCAA
: 标 题: Re: 【麻雀征文】千老，文科女，及他们的春天 (转载)
: 发信站: BBS 未名空间站 (Mon Mar 11 16:24:18 2013, 美东)
: 坑爹的分段
: ========================
: 昨晚到了老K家里，孩子们都不在家，跟单身宿舍没有两样。
: 大家摆好桌子，打风落座，开始了搬砖工程。当前的热门话题，就是联邦政府削减开支
: ，NIH 要压缩 Grants 了。大家都忧心忡忡自己的位置会不保或几年后的前途。
: 老K杠上开花，不紧不慢地说，你们知道么，Clemson， LSU 和 UF 都offer了我
【在 w***i 的大作中提到】
: 【 以下文字转载自 NCAA 讨论区 】
: 发信人: SinoGator (Grossman's Brother), 信区: NCAA
: 标 题: Re: 【麻雀征文】千老，文科女，及他们的春天 (转载)
: 发信站: BBS 未名空间站 (Mon Mar 11 16:24:18 2013, 美东)
: 坑爹的分段
: ========================
: 昨晚到了老K家里，孩子们都不在家，跟单身宿舍没有两样。
: 大家摆好桌子，打风落座，开始了搬砖工程。当前的热门话题，就是联邦政府削减开支
: ，NIH 要压缩 Grants 了。大家都忧心忡忡自己的位置会不保或几年后的前途。
: 老K杠上开花，不紧不慢地说，你们知道么，Clemson， LSU 和 UF 都offer了我
m*c
8 楼
买ATT的版本就行
【在 c****l 的大作中提到】
: 谢谢。
【在 c****l 的大作中提到】
: 谢谢。
r*o
9 楼
放电影？？
w*a
10 楼
how about qiagen...
L*o
11 楼
现在由相同问题，我也是J1， 只是要激活成O1.
两个问题啊：
1. 你当时收到的是 I797B？ 上面有指定激活的大使馆么？还是随便去境外大使馆都行？
2. 如果可以去加拿大激活的话，需要等到check完成才能回来吧
3. 家属需要一起去么，还是可以留在美国转成O3？
谢谢啦
【在 z*****o 的大作中提到】
: 请问家属J2可以留在美国然后转成H4吗，还是需要和J1一起回去签？非常感谢！
两个问题啊：
1. 你当时收到的是 I797B？ 上面有指定激活的大使馆么？还是随便去境外大使馆都行？
2. 如果可以去加拿大激活的话，需要等到check完成才能回来吧
3. 家属需要一起去么，还是可以留在美国转成O3？
谢谢啦
【在 z*****o 的大作中提到】
: 请问家属J2可以留在美国然后转成H4吗，还是需要和J1一起回去签？非常感谢！
w*n
12 楼
那还来得及？小姨肯定是撬K嫂的盘
【在 d********e 的大作中提到】
: 小姨飞奔跑去接盘了
【在 d********e 的大作中提到】
: 小姨飞奔跑去接盘了
t*t
13 楼
口水ing
【在 d********e 的大作中提到】
【在 d********e 的大作中提到】
C*e
14 楼
这种kit太多了吧
现在几乎每个生产试剂盒的公司都有
被广泛使用的一个是qiagen的RNAeasy
还有就是Ambion的kit了
不过要看你材料是什么
有的东西其实还是phenol chloriform的效果好
【在 b*********l 的大作中提到】
: Anybody has experience with an RNA purification kit(Phenol and Chloriform
: free)? I only found one from Norgen? Anybody knows if it's reliable?
: Thanks a lot.
现在几乎每个生产试剂盒的公司都有
被广泛使用的一个是qiagen的RNAeasy
还有就是Ambion的kit了
不过要看你材料是什么
有的东西其实还是phenol chloriform的效果好
【在 b*********l 的大作中提到】
: Anybody has experience with an RNA purification kit(Phenol and Chloriform
: free)? I only found one from Norgen? Anybody knows if it's reliable?
: Thanks a lot.
d*e
15 楼
太狡猾了
【在 w****n 的大作中提到】
: 那还来得及？小姨肯定是撬K嫂的盘
【在 w****n 的大作中提到】
: 那还来得及？小姨肯定是撬K嫂的盘
f*e
16 楼
大奶二奶齐上阵，屋里高几度是没问题的，不用暖被窝了
h*n
17 楼
I use miRNeasy from qiagen.
Please notice that RNeasy will not yield miRNA or other small RNA.
【在 b*********l 的大作中提到】
: Anybody has experience with an RNA purification kit(Phenol and Chloriform
: free)? I only found one from Norgen? Anybody knows if it's reliable?
: Thanks a lot.
Please notice that RNeasy will not yield miRNA or other small RNA.
【在 b*********l 的大作中提到】
: Anybody has experience with an RNA purification kit(Phenol and Chloriform
: free)? I only found one from Norgen? Anybody knows if it's reliable?
: Thanks a lot.
w*n
18 楼
接盘来不及，谁知道生的是不是儿子？还要养那么久？
【在 d********e 的大作中提到】
: 太狡猾了
【在 d********e 的大作中提到】
: 太狡猾了
t*t
19 楼
游戏吧
【在 r***o 的大作中提到】
: 放电影？？
【在 r***o 的大作中提到】
: 放电影？？
c*r
20 楼
Qiagen的很好用，一直在用。最近看到Fermentas的新kit，在降价做活动，几乎是
Qiagen的一半价格。准备用完了Qiagen的买个fermentas的试一试。
Qiagen的一半价格。准备用完了Qiagen的买个fermentas的试一试。
J*i
21 楼
咋回事
【在 d********e 的大作中提到】
: 小姨飞奔跑去接盘了
【在 d********e 的大作中提到】
: 小姨飞奔跑去接盘了
d*e
22 楼
嗯，不是电影。电影虽然用到投影，但是走WD TV LIVE Player播出，不用劳驾二奶。
二奶的专长其实是。。。其实看图稍仔细点就有答案了。
【在 t**t 的大作中提到】
: 游戏吧
二奶的专长其实是。。。其实看图稍仔细点就有答案了。
【在 t**t 的大作中提到】
: 游戏吧
m*z
23 楼
我们实验室的DNA相关的都换成fermentas的了，work得很好啊，据说便宜不少，里面的
东西其实是一样的，连buffer都可以通用。。。RNA的kit不知道怎么样
【在 c*********r 的大作中提到】
: Qiagen的很好用，一直在用。最近看到Fermentas的新kit，在降价做活动，几乎是
: Qiagen的一半价格。准备用完了Qiagen的买个fermentas的试一试。
东西其实是一样的，连buffer都可以通用。。。RNA的kit不知道怎么样
【在 c*********r 的大作中提到】
: Qiagen的很好用，一直在用。最近看到Fermentas的新kit，在降价做活动，几乎是
: Qiagen的一半价格。准备用完了Qiagen的买个fermentas的试一试。
w*n
24 楼
都知道你想做小三
【在 J********i 的大作中提到】
: 咋回事
【在 J********i 的大作中提到】
: 咋回事
t*t
25 楼
3D
【在 d********e 的大作中提到】
: 嗯，不是电影。电影虽然用到投影，但是走WD TV LIVE Player播出，不用劳驾二奶。
: 二奶的专长其实是。。。其实看图稍仔细点就有答案了。
【在 d********e 的大作中提到】
: 嗯，不是电影。电影虽然用到投影，但是走WD TV LIVE Player播出，不用劳驾二奶。
: 二奶的专长其实是。。。其实看图稍仔细点就有答案了。
C*e
26 楼
要看lz要做什么了
现在差不多每个出RNA kit的公司也都有专提或者enrich mRNA，small RNA的kit
【在 h********n 的大作中提到】
: I use miRNeasy from qiagen.
: Please notice that RNeasy will not yield miRNA or other small RNA.
现在差不多每个出RNA kit的公司也都有专提或者enrich mRNA，small RNA的kit
【在 h********n 的大作中提到】
: I use miRNeasy from qiagen.
: Please notice that RNeasy will not yield miRNA or other small RNA.
d*e
27 楼
还没出发呢？
【在 J********i 的大作中提到】
: 咋回事
【在 J********i 的大作中提到】
: 咋回事
d*e
28 楼
bingo!
Nvidia GTX 470 + Nvidia 3D Vision + Optoma HD66
【在 t**t 的大作中提到】
: 3D
Nvidia GTX 470 + Nvidia 3D Vision + Optoma HD66
【在 t**t 的大作中提到】
: 3D
c*r
29 楼
我们的内切酶都换成他家的了，趁着上一波买一赠一的时候换的，用着也不错。和他们
的客服交流说，他们的很多DNA，RNA kit目标是冲着Qiagen去的。希望能做出和Qiagen
一样质量但便宜很多的kit。
估计他们没有两把刷子也不会被Thermo-Fisher收购。
【在 m**z 的大作中提到】
: 我们实验室的DNA相关的都换成fermentas的了，work得很好啊，据说便宜不少，里面的
: 东西其实是一样的，连buffer都可以通用。。。RNA的kit不知道怎么样
的客服交流说，他们的很多DNA，RNA kit目标是冲着Qiagen去的。希望能做出和Qiagen
一样质量但便宜很多的kit。
估计他们没有两把刷子也不会被Thermo-Fisher收购。
【在 m**z 的大作中提到】
: 我们实验室的DNA相关的都换成fermentas的了，work得很好啊，据说便宜不少，里面的
: 东西其实是一样的，连buffer都可以通用。。。RNA的kit不知道怎么样
N*w
30 楼
赞一个，真奢侈阿
【在 d********e 的大作中提到】
: bingo!
: Nvidia GTX 470 + Nvidia 3D Vision + Optoma HD66
【在 d********e 的大作中提到】
: bingo!
: Nvidia GTX 470 + Nvidia 3D Vision + Optoma HD66
b*l
31 楼
其实就是提取斑马鱼组织totalRNA而已，没有花头。我是觉得qiagen应该有这种kit,不
知道怎么没找到，哈哈，真土。那我要不就试试fermenta的，以前也用过他们的酶，效
果不错。谢谢大家啊，节日快乐。
【在 C*******e 的大作中提到】
: 这种kit太多了吧
: 现在几乎每个生产试剂盒的公司都有
: 被广泛使用的一个是qiagen的RNAeasy
: 还有就是Ambion的kit了
: 不过要看你材料是什么
: 有的东西其实还是phenol chloriform的效果好
知道怎么没找到，哈哈，真土。那我要不就试试fermenta的，以前也用过他们的酶，效
果不错。谢谢大家啊，节日快乐。
【在 C*******e 的大作中提到】
: 这种kit太多了吧
: 现在几乎每个生产试剂盒的公司都有
: 被广泛使用的一个是qiagen的RNAeasy
: 还有就是Ambion的kit了
: 不过要看你材料是什么
: 有的东西其实还是phenol chloriform的效果好
m*1
32 楼
直接接到LCD电视上效果是否一样？
【在 d********e 的大作中提到】
: bingo!
: Nvidia GTX 470 + Nvidia 3D Vision + Optoma HD66
【在 d********e 的大作中提到】
: bingo!
: Nvidia GTX 470 + Nvidia 3D Vision + Optoma HD66
C*e
33 楼
记下了～
回头看看
Qiagen
【在 c*********r 的大作中提到】
: 我们的内切酶都换成他家的了，趁着上一波买一赠一的时候换的，用着也不错。和他们
: 的客服交流说，他们的很多DNA，RNA kit目标是冲着Qiagen去的。希望能做出和Qiagen
: 一样质量但便宜很多的kit。
: 估计他们没有两把刷子也不会被Thermo-Fisher收购。
回头看看
Qiagen
【在 c*********r 的大作中提到】
: 我们的内切酶都换成他家的了，趁着上一波买一赠一的时候换的，用着也不错。和他们
: 的客服交流说，他们的很多DNA，RNA kit目标是冲着Qiagen去的。希望能做出和Qiagen
: 一样质量但便宜很多的kit。
: 估计他们没有两把刷子也不会被Thermo-Fisher收购。
s*a
34 楼
银子多就是好啊。
a*k
35 楼
Qiagen RNeasy就很好用，如果是全鱼的话用他的fibrous tissue的kit更好
【在 b*********l 的大作中提到】
: 其实就是提取斑马鱼组织totalRNA而已，没有花头。我是觉得qiagen应该有这种kit,不
: 知道怎么没找到，哈哈，真土。那我要不就试试fermenta的，以前也用过他们的酶，效
: 果不错。谢谢大家啊，节日快乐。
【在 b*********l 的大作中提到】
: 其实就是提取斑马鱼组织totalRNA而已，没有花头。我是觉得qiagen应该有这种kit,不
: 知道怎么没找到，哈哈，真土。那我要不就试试fermenta的，以前也用过他们的酶，效
: 果不错。谢谢大家啊，节日快乐。
a9
36 楼
当然不一样。
【在 m******1 的大作中提到】
: 直接接到LCD电视上效果是否一样？
【在 m******1 的大作中提到】
: 直接接到LCD电视上效果是否一样？
b*l
37 楼
我也记下了，谢谢。
【在 a********k 的大作中提到】
: Qiagen RNeasy就很好用，如果是全鱼的话用他的fibrous tissue的kit更好
【在 a********k 的大作中提到】
: Qiagen RNeasy就很好用，如果是全鱼的话用他的fibrous tissue的kit更好
r*o
38 楼
antec mini p180最好别放在地毯上,太容易吸灰进去了
【在 d********e 的大作中提到】
: bingo!
: Nvidia GTX 470 + Nvidia 3D Vision + Optoma HD66
【在 d********e 的大作中提到】
: bingo!
: Nvidia GTX 470 + Nvidia 3D Vision + Optoma HD66
c*r
39 楼
忘了说了，我说他家kit便宜是指年底之前用那个promo code之后的价格，链接在这里。
http://order.fermentas.com/USA/WebMedia/US_NPS_Supplement_2010.pdf
在这里说一下免得有人多花了钱。。。
【在 C*******e 的大作中提到】
: 记下了～
: 回头看看
:
: Qiagen
http://order.fermentas.com/USA/WebMedia/US_NPS_Supplement_2010.pdf
在这里说一下免得有人多花了钱。。。
【在 C*******e 的大作中提到】
: 记下了～
: 回头看看
:
: Qiagen
f*e
40 楼
那个project不错啊
w*a
41 楼
谢谢分享啊~~~~
里。
【在 c*********r 的大作中提到】
: 忘了说了，我说他家kit便宜是指年底之前用那个promo code之后的价格，链接在这里。
: http://order.fermentas.com/USA/WebMedia/US_NPS_Supplement_2010.pdf
: 在这里说一下免得有人多花了钱。。。
里。
【在 c*********r 的大作中提到】
: 忘了说了，我说他家kit便宜是指年底之前用那个promo code之后的价格，链接在这里。
: http://order.fermentas.com/USA/WebMedia/US_NPS_Supplement_2010.pdf
: 在这里说一下免得有人多花了钱。。。
x*s
42 楼
唉。。。。太羡慕了，可是现在显卡是ati的，电视不支持，显示器是60hz的。。。。
【在 d********e 的大作中提到】
: bingo!
: Nvidia GTX 470 + Nvidia 3D Vision + Optoma HD66
【在 d********e 的大作中提到】
: bingo!
: Nvidia GTX 470 + Nvidia 3D Vision + Optoma HD66
w*a
43 楼
借人气问一下，大家用RNA purification kit的话，还用invitrogen 的TRIZOL吗？
d*e
44 楼
LCD 要120 Hz能支持3D的才行：
http://www.3dmovielist.com/3dhdtvs.html
【在 m******1 的大作中提到】
: 直接接到LCD电视上效果是否一样？
http://www.3dmovielist.com/3dhdtvs.html
【在 m******1 的大作中提到】
: 直接接到LCD电视上效果是否一样？
M*n
45 楼
Qiagen
trizol is a cheap substitute
trizol is a cheap substitute
d*e
46 楼
偶的120Hz显示器Samsung 2233RZ正好要出，有兴趣冇？
【在 x*****s 的大作中提到】
: 唉。。。。太羡慕了，可是现在显卡是ati的，电视不支持，显示器是60hz的。。。。
【在 x*****s 的大作中提到】
: 唉。。。。太羡慕了，可是现在显卡是ati的，电视不支持，显示器是60hz的。。。。
k*n
47 楼
qiagen miRNeasy带Qiazol（就是Trizol）
【在 w******a 的大作中提到】
: 借人气问一下，大家用RNA purification kit的话，还用invitrogen 的TRIZOL吗？
【在 w******a 的大作中提到】
: 借人气问一下，大家用RNA purification kit的话，还用invitrogen 的TRIZOL吗？
x*s
48 楼
唉，这个是TN的吧，而且我要上3d的话，改动太大了，目前没有这么多米啊
【在 d********e 的大作中提到】
: 偶的120Hz显示器Samsung 2233RZ正好要出，有兴趣冇？
【在 d********e 的大作中提到】
: 偶的120Hz显示器Samsung 2233RZ正好要出，有兴趣冇？
s*l
49 楼
we use Ambion kit on a constant base, pretty reliable.
【在 b*********l 的大作中提到】
: Anybody has experience with an RNA purification kit(Phenol and Chloriform
: free)? I only found one from Norgen? Anybody knows if it's reliable?
: Thanks a lot.
【在 b*********l 的大作中提到】
: Anybody has experience with an RNA purification kit(Phenol and Chloriform
: free)? I only found one from Norgen? Anybody knows if it's reliable?
: Thanks a lot.
n*7
50 楼
图片质量很差阿，挺模糊的
C*e
51 楼
有的东西用kit做效果不好
结果还是要用trizol
trizol其实也就是加了别的东西的phenol
【在 w******a 的大作中提到】
: 借人气问一下，大家用RNA purification kit的话，还用invitrogen 的TRIZOL吗？
结果还是要用trizol
trizol其实也就是加了别的东西的phenol
【在 w******a 的大作中提到】
: 借人气问一下，大家用RNA purification kit的话，还用invitrogen 的TRIZOL吗？
t*t
52 楼
ft
3D画面
【在 n******7 的大作中提到】
: 图片质量很差阿，挺模糊的
3D画面
【在 n******7 的大作中提到】
: 图片质量很差阿，挺模糊的
w*a
53 楼
I don't know... our lab has the protocol that we should use TRIZOL first and
then use Qiagen kit... I think this is weird but nobody tells me why... but
the output is very good.
【在 C*******e 的大作中提到】
: 有的东西用kit做效果不好
: 结果还是要用trizol
: trizol其实也就是加了别的东西的phenol
then use Qiagen kit... I think this is weird but nobody tells me why... but
the output is very good.
【在 C*******e 的大作中提到】
: 有的东西用kit做效果不好
: 结果还是要用trizol
: trizol其实也就是加了别的东西的phenol
d*e
54 楼
看完了老弟的签名档，还真得回一个 :(
嗯，其实是都看着挺模糊的。画面要戴上第二幅图中的眼镜看才不模糊。
【在 n******7 的大作中提到】
: 图片质量很差阿，挺模糊的
嗯，其实是都看着挺模糊的。画面要戴上第二幅图中的眼镜看才不模糊。
【在 n******7 的大作中提到】
: 图片质量很差阿，挺模糊的
C*e
55 楼
能不能分享一下你们实验室的protocol？
and
but
【在 w******a 的大作中提到】
: I don't know... our lab has the protocol that we should use TRIZOL first and
: then use Qiagen kit... I think this is weird but nobody tells me why... but
: the output is very good.
and
but
【在 w******a 的大作中提到】
: I don't know... our lab has the protocol that we should use TRIZOL first and
: then use Qiagen kit... I think this is weird but nobody tells me why... but
: the output is very good.
w*a
56 楼
I don't think it is good, coz it takes me 2 hours to get the RNA...
【在 C*******e 的大作中提到】
: 能不能分享一下你们实验室的protocol？
:
: and
: but
【在 C*******e 的大作中提到】
: 能不能分享一下你们实验室的protocol？
:
: and
: but
w*a
57 楼
Check this one:
Reagents
* TRIzol from Invitrogen #15596-108.
* Mini RNeasy plus kit from Qiagen #74134.
* Phase lock gel from Eppendorf #2302830.
* Keep TRIzol at 4C.
* Use RNase-free tubes and tips for all steps.
* Prepare 70% ethanol using DEPC-H2O and keep it at -20C.
RNeasy plus kit contains a genomic DNA elimination column. It can replace
the DNase I digestion step of regular RNeasy kit.
1. Add 1.2 ml TRIzol reagent to cells/tissues (5~10X 106 cells/ml or 50~100
mg tissue).
2. Homogenize till no debris present. For cells, lyse by pipetting. Then
keep on ice.
3. Pre-centrifuge the Phase Lock Gel at 14K RPM for 3 min at RT.
4. Use sterile RNase-free tips and transfer 1 ml solution to each phase lock
gel tube. add 0.2 ml chloroform. Shake it by hand to make sure the organic
solution mixes well with RNA. Rotate at 4C for 20 min.
Note: Alternatively, you can transfer 1 ml solution into a RNase-free tube,
add 200 ul chloroform and then proceed for following steps.
5. Spin down at 14K RPM for 15 min at 4C.
6. Transfer the aqueous phase (60% of initial TRIzol), ~600 ul to a gDNA
elimination column.
Note: This step should be very easy since the lower and upper phases are
separated by PLG.
7. Spin down at 14K RPM for 1 min at RT.
8. Remove the column and keep the flowthrough in the collection tube.
9. Add 600 ul cold 70% ethanol (always store at -20C) to the collection tube.
10. Pipette up and down several times to mix the solution.
11. Apply up to 700 ul of the sample to RNeasy mini column, spin down, 14K
RPM for 1 min, discard the flowthrough, and apply again to load all the
samples.
12. Add 700 ul buffer RW1 to the column, centrifuge for 1 min at 14K RPM and
discard the flowthrough.
13. Wash the column with 500 ul RPE，2 times. Spin down to remove
flowthrough at 14K RPM for 1 min. Discard the flowthrough.
14. Spin down to remove any carryover of RPE by centrifugation with empty
collection tubes at 14K RPM for 1 min at RT.
15. Transfer the column to a new RNase-free tube, and add 30 - 50 ul RNase-
free water (provided in the kit) to the center of the column. Leave on bench
for 1 min, and then spin down at 14K RPM for 1 min at RT.
16. Measure RNA OD260, OD280 and concentration by nanodrop or regular
spectrophotometer.
17. I usually store the RNA at -20C or immediately proceed for RT-PCR.
【在 C*******e 的大作中提到】
: 能不能分享一下你们实验室的protocol？
:
: and
: but
Reagents
* TRIzol from Invitrogen #15596-108.
* Mini RNeasy plus kit from Qiagen #74134.
* Phase lock gel from Eppendorf #2302830.
* Keep TRIzol at 4C.
* Use RNase-free tubes and tips for all steps.
* Prepare 70% ethanol using DEPC-H2O and keep it at -20C.
RNeasy plus kit contains a genomic DNA elimination column. It can replace
the DNase I digestion step of regular RNeasy kit.
1. Add 1.2 ml TRIzol reagent to cells/tissues (5~10X 106 cells/ml or 50~100
mg tissue).
2. Homogenize till no debris present. For cells, lyse by pipetting. Then
keep on ice.
3. Pre-centrifuge the Phase Lock Gel at 14K RPM for 3 min at RT.
4. Use sterile RNase-free tips and transfer 1 ml solution to each phase lock
gel tube. add 0.2 ml chloroform. Shake it by hand to make sure the organic
solution mixes well with RNA. Rotate at 4C for 20 min.
Note: Alternatively, you can transfer 1 ml solution into a RNase-free tube,
add 200 ul chloroform and then proceed for following steps.
5. Spin down at 14K RPM for 15 min at 4C.
6. Transfer the aqueous phase (60% of initial TRIzol), ~600 ul to a gDNA
elimination column.
Note: This step should be very easy since the lower and upper phases are
separated by PLG.
7. Spin down at 14K RPM for 1 min at RT.
8. Remove the column and keep the flowthrough in the collection tube.
9. Add 600 ul cold 70% ethanol (always store at -20C) to the collection tube.
10. Pipette up and down several times to mix the solution.
11. Apply up to 700 ul of the sample to RNeasy mini column, spin down, 14K
RPM for 1 min, discard the flowthrough, and apply again to load all the
samples.
12. Add 700 ul buffer RW1 to the column, centrifuge for 1 min at 14K RPM and
discard the flowthrough.
13. Wash the column with 500 ul RPE，2 times. Spin down to remove
flowthrough at 14K RPM for 1 min. Discard the flowthrough.
14. Spin down to remove any carryover of RPE by centrifugation with empty
collection tubes at 14K RPM for 1 min at RT.
15. Transfer the column to a new RNase-free tube, and add 30 - 50 ul RNase-
free water (provided in the kit) to the center of the column. Leave on bench
for 1 min, and then spin down at 14K RPM for 1 min at RT.
16. Measure RNA OD260, OD280 and concentration by nanodrop or regular
spectrophotometer.
17. I usually store the RNA at -20C or immediately proceed for RT-PCR.
【在 C*******e 的大作中提到】
: 能不能分享一下你们实验室的protocol？
:
: and
: but
C*e
58 楼
谢谢！
记下了
我现在用的方法就是kit也要两小时
光用trizol应该产量大一些
我的实验对产量要求比较高
【在 w******a 的大作中提到】
: Check this one:
: Reagents
: * TRIzol from Invitrogen #15596-108.
: * Mini RNeasy plus kit from Qiagen #74134.
: * Phase lock gel from Eppendorf #2302830.
: * Keep TRIzol at 4C.
: * Use RNase-free tubes and tips for all steps.
: * Prepare 70% ethanol using DEPC-H2O and keep it at -20C.
: RNeasy plus kit contains a genomic DNA elimination column. It can replace
: the DNase I digestion step of regular RNeasy kit.
记下了
我现在用的方法就是kit也要两小时
光用trizol应该产量大一些
我的实验对产量要求比较高
【在 w******a 的大作中提到】
: Check this one:
: Reagents
: * TRIzol from Invitrogen #15596-108.
: * Mini RNeasy plus kit from Qiagen #74134.
: * Phase lock gel from Eppendorf #2302830.
: * Keep TRIzol at 4C.
: * Use RNase-free tubes and tips for all steps.
: * Prepare 70% ethanol using DEPC-H2O and keep it at -20C.
: RNeasy plus kit contains a genomic DNA elimination column. It can replace
: the DNase I digestion step of regular RNeasy kit.
w*a
59 楼
我觉得Transfer the aqueous phase最重要，要尽可能多的把aqueous phase全都吸出
来。
【在 C*******e 的大作中提到】
: 谢谢！
: 记下了
: 我现在用的方法就是kit也要两小时
: 光用trizol应该产量大一些
: 我的实验对产量要求比较高
来。
【在 C*******e 的大作中提到】
: 谢谢！
: 记下了
: 我现在用的方法就是kit也要两小时
: 光用trizol应该产量大一些
: 我的实验对产量要求比较高
C*e
60 楼
呵呵
我觉得比较重要的是第一步trizol
（或者别的phenol based reagent不管每个公司起的什么名字）
和起始材料之间的比例比较重要
另外我自己做过对比
phenol based方法不走colum比走column产量多出来至少5倍以上
对于起始材料足够多，或者下游实验对于产量没有太大要求的实验来说自然column方便
省事
不过有时候还是需要用old fashioned method啊
【在 w******a 的大作中提到】
: 我觉得Transfer the aqueous phase最重要，要尽可能多的把aqueous phase全都吸出
: 来。
我觉得比较重要的是第一步trizol
（或者别的phenol based reagent不管每个公司起的什么名字）
和起始材料之间的比例比较重要
另外我自己做过对比
phenol based方法不走colum比走column产量多出来至少5倍以上
对于起始材料足够多，或者下游实验对于产量没有太大要求的实验来说自然column方便
省事
不过有时候还是需要用old fashioned method啊
【在 w******a 的大作中提到】
: 我觉得Transfer the aqueous phase最重要，要尽可能多的把aqueous phase全都吸出
: 来。
w*a
61 楼
哦，我加多少trizol都是严格按照说明书来的，倒是没有比较过。。。
不走column我就怕有污染。。。
我有时候担心吸到aqueous phase下面的白白的东西，所以就宁愿浪费一点aqueous
phase,但是如果换个小号的tips，就会吸得干净些，产量也会高些。
I'm not sure if I'm being clear enough :)
【在 C*******e 的大作中提到】
: 呵呵
: 我觉得比较重要的是第一步trizol
: （或者别的phenol based reagent不管每个公司起的什么名字）
: 和起始材料之间的比例比较重要
: 另外我自己做过对比
: phenol based方法不走colum比走column产量多出来至少5倍以上
: 对于起始材料足够多，或者下游实验对于产量没有太大要求的实验来说自然column方便
: 省事
: 不过有时候还是需要用old fashioned method啊
不走column我就怕有污染。。。
我有时候担心吸到aqueous phase下面的白白的东西，所以就宁愿浪费一点aqueous
phase,但是如果换个小号的tips，就会吸得干净些，产量也会高些。
I'm not sure if I'm being clear enough :)
【在 C*******e 的大作中提到】
: 呵呵
: 我觉得比较重要的是第一步trizol
: （或者别的phenol based reagent不管每个公司起的什么名字）
: 和起始材料之间的比例比较重要
: 另外我自己做过对比
: phenol based方法不走colum比走column产量多出来至少5倍以上
: 对于起始材料足够多，或者下游实验对于产量没有太大要求的实验来说自然column方便
: 省事
: 不过有时候还是需要用old fashioned method啊
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