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求磷酸钙转染293T细胞的配方和 protocol

求磷酸钙转染293T细胞的配方和 protocol# Biology - 生物学

d*a2010-12-15 08:12

1 楼

【以下文字转载自 ECUST 讨论区】
发信人: dafemrenla (dafemrenla), 信区: ECUST
标题: artichoke怎么做？在线求助
发信站: BBS 未名空间站 (Thu Sep 23 21:19:37 2010, 美东)
打算高汤煮，
然后dip吃。

l*e2010-12-15 08:12

2 楼

【以下文字转载自 K12 俱乐部】
发信人: lazystone (waiting), 信区: K12
标题: Re: 小儿读书
发信站: BBS 未名空间站 (Sat Jun 5 00:58:16 2010, 美东)
FRIDAY, JUNE 5, 2009
小儿读书之艺术世家
如果一个人不善画而有志创作图画书，他写下故事，给出版社投稿。在出版社方面，
据说他们有一些固定合作的画家，倘若作者没有名气，那么他们会搭配一个同样无
名的画家来配插图。其后，作者和画家之间，需要密切的沟通交流，以确保插图能
够传达出作品的韵味。除非运气很好，否则这是一个痛苦的过程。
Audrey Wood没有这样的烦恼。她出生在一个艺术世家，祖上上溯三代，皆为artists。
英文里的artist涉义广泛，给普通人家画壁画的也可归入其列。但是不管如何，她
兼备文字和绘画的才能，在她儿子出生后，很自然地开始创作儿童图画书。她自写
自画的作品包括Little Penguin’s tale, Weird parents, Rude giant, Silly sally
等。这些书，无论从故事还是图画的角度

b*m2010-12-15 08:12

3 楼

去年12月回国面签的h1b的visa stamp，当时已经在现在公司干了一年多。面签的时候
不小心拿了前公司的I797。前公司的I797还没有失效，一直到今年（2016）7月份。现
公司的I797一直到明年（2017年）1月。
结果回美国后在美国机场看护照才发现错了，在机场又困又累，于是就这么进入美国了
，于是I94的有效期也是按照前公司的。
最近要申请绿卡，和公司HR说起这事，公司HR说这是个很严重的事件，搞得不好会被认
为是visa fraud，最严重会要求五年不能入境。
这个纯属就是拿错材料了，没想到会有可能这么严重。求版上各位大神是否知道类似的
经历该如何处理。

s*t2010-12-15 08:12

4 楼

最近一直在为293T细胞的转染发愁，如果那位大虾有磷酸钙的配方和protocol，请发给
我，非常感谢，
10个包子的酬谢！

l*22010-12-15 08:12

5 楼

这个只有中间芯可以吃。
中餐我不知道，我看老美有时候煮熟了沾酱吃
http://blog.sina.com.cn/s/blog_632819dc0100fxtq.html
这个博客介绍的挺清楚
这个东西可吃部分很少，我第一次不认识问美国老太太
告诉我太麻烦，而且可吃的一点点。顿时就失去了兴趣
有次吃到一个这个做的沾chips的酱，非常好吃。

v*e2010-12-15 08:12

6 楼

原来是Wood，难怪呢！——哈哈哈～

z*g2010-12-15 08:12

7 楼

完全没事，你不放心就去加拿大或墨西哥转一圈重新入境拿新的I-94。

C*h2010-12-15 08:12

8 楼

1. Seed 1.5x106 293T cells per 10 cm plate in 10 ml growth media (
DMEM + 10% FBS). Usually, one T-175 flask of 293T cells at 90-95% confluency
is split to 12 plates (10-cm).
2. Incubate cells for 24 hours (37 °C, 5% CO2), or until the cells reach 40
-50% confluency (no more than 70%).
3. One hour before transfection, replace old growth media with 9 ml fresh
growth media (DMEM + 10% FBS).
a. Prepare plasmid mixture at 23 °C:
430 ul H2O
20 ul plasmid (1 ug/ul)
50 ul CaCl2 (2.5 M)
Total volume 500 ul
b. Add 500 ul 2x HBS (Sigma/Fluka Cat# 51558, Critical! Do not try to make
it on your own) dropwise to plasmid miture above. Mix quickly but gently. A
slight milky opacity appears. DNA precipitation is completed within 30 sec
to 1 min at 23°C (do not incubate any longer).
c. Add 1 ml DNA-mix dropwise to one 10-cm plate. Swirl plate to mix. If you
want to do multiple plates, it is best to do one plate at a time. Make a
master mix of plasmids using the mix ratio as in step 3a, then repeat steps
3b and 3c to transfect cells for each plate.
4. Incubate cells (37 °C, 5% CO2).

【在 s*****t 的大作中提到】

: 最近一直在为293T细胞的转染发愁，如果那位大虾有磷酸钙的配方和protocol，请发给
: 我，非常感谢，
: 10个包子的酬谢！

b*x2010-12-15 08:12

9 楼

hehe一看那坚硬的外皮就知道可食部有限

a*l2010-12-15 08:12

10 楼

我家小儿一岁半看的 board book 的Little mouse, the big red strawberry, and
the big hungry bear，很喜欢
不过 board book 画面小，跟大本的比画面有删节

f*p2010-12-15 08:12

11 楼

没事。谁找你麻烦，你就说你是Isis的。

【在 b*******m 的大作中提到】

: 去年12月回国面签的h1b的visa stamp，当时已经在现在公司干了一年多。面签的时候
: 不小心拿了前公司的I797。前公司的I797还没有失效，一直到今年（2016）7月份。现
: 公司的I797一直到明年（2017年）1月。
: 结果回美国后在美国机场看护照才发现错了，在机场又困又累，于是就这么进入美国了
: ，于是I94的有效期也是按照前公司的。
: 最近要申请绿卡，和公司HR说起这事，公司HR说这是个很严重的事件，搞得不好会被认
: 为是visa fraud，最严重会要求五年不能入境。
: 这个纯属就是拿错材料了，没想到会有可能这么严重。求版上各位大神是否知道类似的
: 经历该如何处理。

D*a2010-12-15 08:12

12 楼

先问问为什么发愁？293T那么好转。

【在 s*****t 的大作中提到】

: 最近一直在为293T细胞的转染发愁，如果那位大虾有磷酸钙的配方和protocol，请发给
: 我，非常感谢，
: 10个包子的酬谢！

d*a2010-12-15 08:12

13 楼

多谢信息。
我用美奶资酱牛油果酱混合了吃，
味道还不错，就是太麻烦了。

【在 l*******2 的大作中提到】

: 这个只有中间芯可以吃。
: 中餐我不知道，我看老美有时候煮熟了沾酱吃
: http://blog.sina.com.cn/s/blog_632819dc0100fxtq.html
: 这个博客介绍的挺清楚
: 这个东西可吃部分很少，我第一次不认识问美国老太太
: 告诉我太麻烦，而且可吃的一点点。顿时就失去了兴趣
: 有次吃到一个这个做的沾chips的酱，非常好吃。

l*e2010-12-15 08:12

14 楼

我儿子也非常喜欢，这个故事是Don Wood构想的，他具有一种天然去雕饰的能力。

【在 a***l 的大作中提到】

: 我家小儿一岁半看的 board book 的Little mouse, the big red strawberry, and
: the big hungry bear，很喜欢
: 不过 board book 画面小，跟大本的比画面有删节

f*p2010-12-15 08:12

15 楼

没事。谁找你麻烦，你就说你是Isis的。

【在 b*******m 的大作中提到】

s*t2010-12-15 08:12

16 楼

刚开始学养细胞，根据分子克隆上的配方自己配磷酸钙的buffer，发现效率只有10%。
特别着急，而且看不到磷酸钙颗粒.....

【在 D***a 的大作中提到】

: 先问问为什么发愁？293T那么好转。

c*s2010-12-15 08:12

17 楼

你买的太老了,中间的要去掉,那个叫choke,吃了可能会choke.这个还是吃腌过的好些,
不用自己做,直接买罐头就好了.主要是壮阳的,所以男的要多吃.

【在 d********a 的大作中提到】

: 多谢信息。
: 我用美奶资酱牛油果酱混合了吃，
: 味道还不错，就是太麻烦了。

r*x2010-12-15 08:12

18 楼

没事吧

【在 b*******m 的大作中提到】

C*h2010-12-15 08:12

19 楼

Buffer的pH值，非常关键。pH值相差0.02，转染效率可能相差几倍。
所以，不能自己配buffer，要买现成的。
而且，buffer一买来，就要0.2 um filter，然后每1 ml分装到一个管子，－20度保存。
这样，才能保证每次实验，buffer的pH值都是一样的，连0.02的误差都没有。
plasmid的量，跟CaCl2的比例，要保持好, 每125mM CaCl2，15-25ug plasmid。

【在 s*****t 的大作中提到】

: 刚开始学养细胞，根据分子克隆上的配方自己配磷酸钙的buffer，发现效率只有10%。
: 特别着急，而且看不到磷酸钙颗粒.....

c*e2010-12-15 08:12

20 楼

Processed food's nutrition fact cannot be compared with fresh one. Artichoke
is a great source of antioxidants, minerals, vitamins and fiber. It has
better antioxidant than red wine and chocolate. The minerals provided by
arichoke is amazingly rich. Check out these website：
http://www.oceanmist.com/health/health.aspx
http://nutritiondata.self.com/facts/vegetables-and-vegetable-products/2781/2
http://artichokes.org/health.html

【在 c**s 的大作中提到】

: 你买的太老了,中间的要去掉,那个叫choke,吃了可能会choke.这个还是吃腌过的好些,
: 不用自己做,直接买罐头就好了.主要是壮阳的,所以男的要多吃.

d*w2010-12-15 08:12

21 楼

怎么可能就是属于纯属拿错材料呢。你早就发现I797不对，并且有N次机会可以纠正，
可是你还是没纠正。

【在 b*******m 的大作中提到】

s*t2010-12-15 08:12

22 楼

多谢了~

存。

【在 C*****h 的大作中提到】

: Buffer的pH值，非常关键。pH值相差0.02，转染效率可能相差几倍。
: 所以，不能自己配buffer，要买现成的。
: 而且，buffer一买来，就要0.2 um filter，然后每1 ml分装到一个管子，－20度保存。
: 这样，才能保证每次实验，buffer的pH值都是一样的，连0.02的误差都没有。
: plasmid的量，跟CaCl2的比例，要保持好, 每125mM CaCl2，15-25ug plasmid。

d*a2010-12-15 08:12

23 楼

恩，吃到嘴里是一股金属味，
让我想到云南的牛肝菌。

Artichoke
products/2781/2

【在 c******e 的大作中提到】

: Processed food's nutrition fact cannot be compared with fresh one. Artichoke
: is a great source of antioxidants, minerals, vitamins and fiber. It has
: better antioxidant than red wine and chocolate. The minerals provided by
: arichoke is amazingly rich. Check out these website：
: http://www.oceanmist.com/health/health.aspx
: http://nutritiondata.self.com/facts/vegetables-and-vegetable-products/2781/2
: http://artichokes.org/health.html

b*m2010-12-15 08:12

24 楼

您说得对，之前确实是没把这个太当回事，觉得不就是个纠正么。现在公司HR说可能会
严重，才引起重视。也不知道那五年的说法是不是他bluff。。。

【在 d******w 的大作中提到】

: 怎么可能就是属于纯属拿错材料呢。你早就发现I797不对，并且有N次机会可以纠正，
: 可是你还是没纠正。

Z*52010-12-15 08:12

25 楼

用磷酸钙转有啥好处啊？我一直用罗氏的FuGene HD，效果非常好，而且操作非常简单
。

d*22010-12-15 08:12

26 楼

我自己做了一次，　很不理想。
用蒸锅蒸，　还按照建议加了点白醋，　但是蒸出来还是有些发黑。
其中一个按recipe的建议，　撒了面包屑和onion的那个混合物，　但是蒸出来以后不
能看，　完全失败。
把叶片撕下来以后吃，　有点软甜，　但是总体没什么味道，　也没吃到所谓的鲜甜。
靠近芯的叶片闻起来倒是不错，　不过最后口感还是不行。　最中间的芯不能吃。

【在 d********a 的大作中提到】

: 恩，吃到嘴里是一股金属味，
: 让我想到云南的牛肝菌。
:
: Artichoke
: products/2781/2

f*a2010-12-15 08:12

27 楼

我几年前有过一模一样的情况，PM你了。

s*n2010-12-15 08:12

28 楼

磷酸钙便宜啊。。。。

p*y2010-12-15 08:12

29 楼

特别喜欢吃这个。地中海那边的人爱吃，就是和roast tomatoes差不多的做法。用橄榄
油，balsamic 醋，盐，糖，rosemary,basil烤，放凉了当小菜，好吃的不得了。很像
咱们的凉拌笋

b*m2010-12-15 08:12

30 楼

谢谢好心人！这样我就放心多了！

【在 f**a 的大作中提到】

: 我几年前有过一模一样的情况，PM你了。

s*t2010-12-15 08:12

31 楼

好处是操作简单，配好磷酸钙的沉淀直接投入细胞，不用等15-20min

【在 Z******5 的大作中提到】

: 用磷酸钙转有啥好处啊？我一直用罗氏的FuGene HD，效果非常好，而且操作非常简单
: 。

S*m2010-12-15 08:12

32 楼

You can save some time by adding plasmid mixture (immediately after
preparation) to trypsinized and resuspended 293T cells. Worked pretty
well for me.
To save some money, you can also prepare a batch of HBS with different
pH and test which one works best for you.

confluency
reach 40
fresh

【在 C*****h 的大作中提到】

: 1. Seed 1.5x106 293T cells per 10 cm plate in 10 ml growth media (
: DMEM + 10% FBS). Usually, one T-175 flask of 293T cells at 90-95% confluency
: is split to 12 plates (10-cm).
: 2. Incubate cells for 24 hours (37 °C, 5% CO2), or until the cells reach 40
: -50% confluency (no more than 70%).
: 3. One hour before transfection, replace old growth media with 9 ml fresh
: growth media (DMEM + 10% FBS).
: a. Prepare plasmid mixture at 23 °C:
: 430 ul H2O
: 20 ul plasmid (1 ug/ul)

s*t2010-12-15 08:12

33 楼

准备过2个batch的HBS，PH分别为7.05和7.10，但是加到细胞上后第二天几乎看不到磷
酸钙颗粒。

【在 S*******m 的大作中提到】

: You can save some time by adding plasmid mixture (immediately after
: preparation) to trypsinized and resuspended 293T cells. Worked pretty
: well for me.
: To save some money, you can also prepare a batch of HBS with different
: pH and test which one works best for you.
:
: confluency
: reach 40
: fresh

w*r2010-12-15 08:12

34 楼

293就不要用磷酸钙转了吧，配起来用起来都麻烦的要命。
有钱的话就用lipo转，想省钱就用PEI。
两三百刀买点PEI，可以配两升，用量用法和lipo2000一样，转293效率高达90%。两升
可以用到地老天荒了。

w*n2010-12-15 08:12

35 楼

PEI这个听起来很棒，赶紧试一下。
有protocol吗？发到版上大家分享吧

【在 w********r 的大作中提到】

: 293就不要用磷酸钙转了吧，配起来用起来都麻烦的要命。
: 有钱的话就用lipo转，想省钱就用PEI。
: 两三百刀买点PEI，可以配两升，用量用法和lipo2000一样，转293效率高达90%。两升
: 可以用到地老天荒了。

S*s2010-12-15 08:12

36 楼

我们也一直用 Fugene。不过听 Roche 的 sales 说他们明后年就要不卖 Fugene 了。
这个试剂的专利要过期，他们挣不到钱了。奸商啊。

【在 Z******5 的大作中提到】

: 用磷酸钙转有啥好处啊？我一直用罗氏的FuGene HD，效果非常好，而且操作非常简单
: 。

S*s2010-12-15 08:12

37 楼

我马上就要开始用磷酸钙转染 culture neuron 了，你的回复对我也很有用，非常感谢
！还有，哪个公司的 buffer 比较好，你能推荐一个么？谢谢。

存。

【在 C*****h 的大作中提到】

C*h2010-12-15 08:12

38 楼

neuron实在是太难转染了。无论哪种试剂或者配方，都很难。
用lentivirus试一试吧。

【在 S*****s 的大作中提到】

: 我马上就要开始用磷酸钙转染 culture neuron 了，你的回复对我也很有用，非常感谢
: ！还有，哪个公司的 buffer 比较好，你能推荐一个么？谢谢。
:
: 存。

w*r2010-12-15 08:12

39 楼

很简单，没啥protpcol...
买polysciences, Inc的Polyethyleneimine "MAX" ，Cat#24765。
用灭菌的Milli-Q配成2mg/ml的溶液，每次配几毫升，别一次配太多，否则放久了容易
失效。
然后转染质粒的方法和lipofectimine 2000相同。
转别的细胞没怎么试过，不过转293真是量大又实惠:)
可能开始要试一下条件，有时候加太多细胞容易死。

【在 w*********n 的大作中提到】

: PEI这个听起来很棒，赶紧试一下。
: 有protocol吗？发到版上大家分享吧

s*t2010-12-15 08:12

40 楼

要不要提前换成serum-free的medium？

【在 w********r 的大作中提到】

: 很简单，没啥protpcol...
: 买polysciences, Inc的Polyethyleneimine "MAX" ，Cat#24765。
: 用灭菌的Milli-Q配成2mg/ml的溶液，每次配几毫升，别一次配太多，否则放久了容易
: 失效。
: 然后转染质粒的方法和lipofectimine 2000相同。
: 转别的细胞没怎么试过，不过转293真是量大又实惠:)
: 可能开始要试一下条件，有时候加太多细胞容易死。

l*e2010-12-15 08:12

41 楼

no.

【在 s*****t 的大作中提到】

: 要不要提前换成serum-free的medium？

s*t2010-12-15 08:12

42 楼

今天试了一下PEI转染，转了GFP然后FACs检测，发现25%的效率，请问怎么提高到90%的
效率？

【在 s*****t 的大作中提到】

: 最近一直在为293T细胞的转染发愁，如果那位大虾有磷酸钙的配方和protocol，请发给
: 我，非常感谢，
: 10个包子的酬谢！

l*e2010-12-15 08:12

43 楼

the transfection efficiency depend on the size of transfected plasimd. if
your plasimid is over 10k, it is impossible to increase efficiency to 90%. or
you buy fugenehd.

s*t2010-12-15 08:12

44 楼

GFP 才6kb左右，

or

【在 l********e 的大作中提到】

: the transfection efficiency depend on the size of transfected plasimd. if
: your plasimid is over 10k, it is impossible to increase efficiency to 90%. or
: you buy fugenehd.

C*h2010-12-15 08:12

45 楼

是不是你的DNA不纯？
DNA里面含有RNA或者蛋白质？

【在 s*****t 的大作中提到】

: 今天试了一下PEI转染，转了GFP然后FACs检测，发现25%的效率，请问怎么提高到90%的
: 效率？

s*t2010-12-15 08:12

46 楼

根据Lipofectin2000的protocol，转染之前是不是该换成Serum，antibiotics free的
medium？

【在 C*****h 的大作中提到】

: 是不是你的DNA不纯？
: DNA里面含有RNA或者蛋白质？

l*e2010-12-15 08:12

47 楼

其实很简单的，头一天铺盘子，第二转染是吸掉上清，加入pei mixture, incubate 4 hour, then take them out and add new fresh medium. for gfp, the effienciency should be around 80%.

【在 s*****t 的大作中提到】

: 根据Lipofectin2000的protocol，转染之前是不是该换成Serum，antibiotics free的
: medium？

s*t2010-12-15 08:12

48 楼

PEI mixture 1ml ??

incubate 4 hour, then take them out
and add new fresh medium. for gfp, the effienciency should be around 80%.

【在 l********e 的大作中提到】

: 其实很简单的，头一天铺盘子，第二转染是吸掉上清，加入pei mixture, incubate 4 hour, then take them out and add new fresh medium. for gfp, the effienciency should be around 80%.

l*e2010-12-15 08:12

49 楼

for 60mm plate, 5ml pei mixture. for 6-well plate, 0.5 ml per well.

【在 s*****t 的大作中提到】

: PEI mixture 1ml ??
:
: incubate 4 hour, then take them out
: and add new fresh medium. for gfp, the effienciency should be around 80%.

s*t2010-12-15 08:12

50 楼

5ml的PEI mixture 怎么配？

【在 l********e 的大作中提到】

: for 60mm plate, 5ml pei mixture. for 6-well plate, 0.5 ml per well.

s*t2010-12-15 08:12

51 楼

请给个5ml（60mm plate）PEI mixture的配方。多谢~~

【在 l********e 的大作中提到】

: for 60mm plate, 5ml pei mixture. for 6-well plate, 0.5 ml per well.

p*y2010-12-15 08:12

52 楼

PEI Transfection
Transfection:
1. Split 293T cells one day before transfection in DMEM/10% FBS medium:
a. 6 well dish: 0.5x106 cells
b. 10cm dish: 4.0x106 cells
c. 15cm dish: 9.0x106 cells
2. Prior to transfection bring all reagents to room temperature.
3. In a sterile tube dilute total plasmid DNA (ug) in serum-free DMEM w/o
phenol red (volume of media is 10% of final volume in culture vessel). Use
transgene: viral packaging (psPAX2):viral envelope (pMD2G) constructs at 4:2
a. 6 well dish: 200ul + 3 ug of total DNA
b. 10cm dish: 1mL + 7-8 ug of total DNA
c. 15cm dish: 2mL + 11-12 ug of total DNA
4. Add PEI (1ug/uL) to the diluted DNA. Mix immediately by vortexing or
pipeting. The volume of PEI used is based on a 3:1 ratio of PEI (ug):total
DNA (ug).
a. 6 well dish: 9ul of PEI(1ug/ul) = 9ug
b. 10cm dish: 21ul of PEI (1ug/ul) = 21ug
c. 15cm dish: 33ul of PEI(1ug/ul) = 33ug
5. Incubate 15 minutes at RT
6. Add DNA/PEI mixture to cells
7. Harvest transfected cells and/or viral supernatant at 48 hours post-
transfection
Reagents:
PEI (1ug/ul) – PEI is Polyethylenimine 25kD linear from Polysciences (cat#
23966-2) or 25KD branched from Aldrich (catalogue number 40,872-7 "25 kDa
branched PEI"). To make a stock solution:
• Dissolve PEI in endotoxin-free dH2O that has been heated to ~80°
C.
• Let cool to room temperature.
• Neutralize to pH 7.0, filter sterilize (0.22um), aliquot and
store at -20°C; a working stock can be kept at 4°C.
Note: pH for PEI is critical, the working pH for PEI is around pH 7.0-7.4,
PEI without adjusting pH is very basic.

l*e2010-12-15 08:12

53 楼

写错了，应该是10cm, 5ml. the original con of PEI is 10mm. dilute 1000.
prepare 2.4ml DMEM with 0.1ml pei. prepare DNA mixture with 2.5ml DMEM with
DNA. add PEI mixture to DNA mixture dropwise, incubate at RM 20m, then take
the medium out from the plate and add the mixture. after 3-4hour incubate.
take the mixture out and add fresh medium.

s*t2010-12-15 08:12

54 楼

DMEM是没有antibiotics和Serum的吧？

with
take
.

【在 l********e 的大作中提到】

: 写错了，应该是10cm, 5ml. the original con of PEI is 10mm. dilute 1000.
: prepare 2.4ml DMEM with 0.1ml pei. prepare DNA mixture with 2.5ml DMEM with
: DNA. add PEI mixture to DNA mixture dropwise, incubate at RM 20m, then take
: the medium out from the plate and add the mixture. after 3-4hour incubate.
: take the mixture out and add fresh medium.