问个qRT-PCR加样顺序的问题 - 未名空间MITBBS历史存档

问个qRT-PCR加样顺序的问题# Biology - 生物学

j*42010-12-28 08:12

1 楼

分享一篇文章，仅希望能有所帮助，造成不便之处，还请多多包涵。
因文章较长，在此仅贴出部份内容，如有兴趣更了解文章，可参考以下完整原文网页：
http://www.nezha.com.tw/first-dt-1.php?id=142
以下为自原文所节录之部份：
这无常人生，戏无常啊～佛学通识本概论，欲要众生学于中，才有课程好参与啊！每每
，每堂课会验证在人生中的百态，是真的要令大家学习，欸呀～不是真的每每做学问啊
，这不知何如讲，唉~

今天来谈一个“学说”好吗？欸呀～一个叫“文字学说”的故事：我们每一个人日常生
活中，与所有人接触啊，某某人讲一句话，三个人听，三个人意会不同；如然说所讲一
部经文，众百人听，可能领悟皆不一，所以，很多人讲，话中有禅机，只看有缘人，有
机者得，无缘者无得。所以，怎可以一概全？佛学思想，所谈的任何学问也好，是为了
憾动灵魂而传布，而不是为了讲给所有肉身而言，谈了这么久，怎还是用肉身思考做学
问啊？这～师父我台湾行回来巨大感受。

谈佛法、谈道门，欸呀～谈的最深刻听的叫“灵魂”，不是人。这个“人”的存活性占
两步骤，哎呀～再重述一次：我想还是许多人无法真体悟啊，每每依我是哪一个人称出
现、我是哪一个行业别出现、或是依做什么工作出现、站在哪一个角度看人生，狭隘到
不行！真狭隘。那就叫以一概全啊！谈完许多门课，大家都知道，只有灵魂永生不灭，
何如还有工作角度、立场？以单一角度看世界啊，往往我们讲，就叫截章取义，发表个
人意见啊，那这个也不行吧！所谈啊，或许领悟力有高低，你怎知啊，不是对他现实当
下状况产生最大帮助啊！而不是对自己自身产生帮助啊！能够说：他的领悟力不好？还
是说，他提的问题粗浅？

师父又要再重申啊，每每我一直所提的很多的意见重申：他灵魂在觉醒之前，在学习的
过程中，或许有许多的问题是他当下最大的阻碍，我们讲，何如感同身受啊？讲实际嘛
：如果我们个人家庭和乐，所以家庭绝不是我们的问题嘛，只要大家协调好，那我们可
能就只是一时语言冲击。可是如然，对方的家中正产生极大的冲突与变化，那这个问题
不就是他当下最严重的吗？那他针对那问题考量，好像也没错，是吧？怎么用一个正确
角度看人生啊？我们所言，登高处望远，心胸宽大包容，而会先体检他当下的问题啊！

师父我何来此？度的是所有百态众生，所有提出来的问题，欸～师父皆不拒绝也不嫌弃
原因，那不就是人所设定的所有你们讲的，人世间三百六十个行业，行行出状元，那也
不就是很多不同人类阶级分别中，所有人会谈的各种话语，是吧！

而每每，人只执着于文字的传播，或者觉得那个思想领悟的大小，唉呀～为什么我师父
总聊得颇为开心啊？师父听的是灵魂之语言，或许他这辈子，书念的不好、生活的环境
没塑造好、亦或自己曾经迷失不努力，可是，当他肯真正向学，他肯真正来谋得人生真
正的一点真谛，或许语言很粗鄙、或许语言没学问、或许语言没内涵、旁边的人可以笑
，师父永远很感动！为啥？讲错与否、讲对与否，无谓啊！而是他的灵魂真正在学习，
而倾听他内心那可爱的世界，已经充满了善念，已经充满了善念。师父每每听到他们虽
然讲错，故做严肃状，指责他几句，只是要调整他的思考逻辑，而非是真正在责怪于他
，产生的叫“灵魂的共振”，看到的是可爱的灵魂总算出现，有时现几种法身相，或许
大家亦然不，不过，师父真的满心欢喜啊！欢喜的是啥？欢喜的是灵魂总算觉醒，哎呀
，够了！

而不是要创造一部伟大的学说，如果你们问：“师父啊！怎么能把这真理回归于世界啊
？”我想不是创作一套伟大的学问现世给世人啊，而是这一部学说也好、或是理论亦好
啦，随便你们谈啊！能不能与所有的灵魂共振？这是我比较思考，而不是这套学说很特
立独行，欸～很有可看性。哎呀～如果又有可看性、又有什么故事，他还不是又演一部
人生的肥皂剧再出来，只是它比较奇特，吸引人注意。所谈跟这累劫社会所出现的学说
有啥不同啊？也不过叫一句话：仅供人参考吧！

那花这么大的心血与心力，又干啥了？而是，这个话语，简单的几句话，是用师父这一
条老旧的灵魂真实谈出来，而能与你们所有的灵魂沟通与共振，而灵魂觉醒，肉身愿意
才有办法真实体会啦！佛学概论就谈一个组织架构，谈什么？怎么确实生活存在现实社
会？怎么又知自己灵魂真正思考，两者达成平衡，此为人生！而无有恐惧、无有猜忌，
真正所谈到现在，如果有人真愿重头整理，细细观察，师父一直传述的“佛学概论”就
这一观念啊！

人生中，现实社会如然大家都能很清楚的知道：这辈子来学习一些没学过的功课亦好、
或是精练功课的纯度亦好。那么，这个社会的组成有各式各样阶级的人分，是否所有能
出现在你周遭的人，都是你这部功课中的一份子？他扮演这个功课的所有的剧本的每一
个角色，来创造一个你学习的环境，或许，他也在跟你学习，你也在跟所有人学习。
..................

T*x2010-12-28 08:12

2 楼

前面我问了一个两个无线网的问题，问题没有解决。
（有几个人的回答太专业了，我看不懂）
重新描述一下问题：
我们这里有一个地区性的免费的at&t的无线网，我就用这个上internet。
家里原本有一个wireless router，现在作为家庭内部网使用，不能上internet。
一台电脑同时上两个wireless网的问题现在解决不了了，
我就退而求其次，让一台电脑同时上一个wireless网，一个wired网：
我希望用att的wireless上internent，另外用一根网线连接我的wireless router。
这样家庭内部网就用wired network。
但是还是不行：
我试图打开网页，但是浏览器好像优先使用wired network，所以还是上不了网。
一旦拔掉网线，只剩下wireless network （att），就可以上网了。
请问有什么办法指定优先使用wireless network吗？

b*y2010-12-28 08:12

3 楼

就是我随便什么视屏文件往上一放都可以放，而且空间大得多。如果iPad的话还要转成
MP4。特别是一些家庭录像什么的都是照相机或者camcorder拍的，很多都是AVI的格式
。盗版的就更不用说了。Nook Color也不行，也要转成它可以硬解的MP4，不然放的很
不好。不知道现在其它的Android Tablet能不能达到这种程度
说起来iPad类的Tablet确实在很多方面都是对Laptop的downgrade，包括运算能力和存
储空间，和易用性（是的，在大部分方面Laptop易用性更好）。提升的方面是体积小，
轻便和电池续航能力。Tablet确实在相当一段时间内没有办法取代Laptop，只能是补充
。
***刚刚丈母娘又问我怎么往iPad上传宝宝视频有感。

Z*52010-12-28 08:12

4 楼

大家做qRT-PCR的时候，一般是最后加模板还是最后加引物？
我觉得为了使定量准确，应该先加模板，然后分装，再分别加引物。
因为决定Ct值的是模板量，引物是过量的，先加模板分装后再加引物能够保证内参和目
的基因所使用的模板量差异达到最小。

l*e2010-12-28 08:12

5 楼

disable掉有线网卡

c*i2010-12-28 08:12

6 楼

nook color上用moboplayer,一般的美剧和四百M左右的电影都没有压力

h*n2010-12-28 08:12

7 楼

I think you are right.
I talked with tech experts in ABI and they suggested the primer should be
the last to dispense.

T*x2010-12-28 08:12

8 楼

这当然是可以的，但我希望一起使用。
上网的时候难道不能指定优先使用无线网吗？

【在 l*****e 的大作中提到】

: disable掉有线网卡

N*D2010-12-28 08:12

9 楼

还是windows，啥都能放

【在 b***y 的大作中提到】

: 就是我随便什么视屏文件往上一放都可以放，而且空间大得多。如果iPad的话还要转成
: MP4。特别是一些家庭录像什么的都是照相机或者camcorder拍的，很多都是AVI的格式
: 。盗版的就更不用说了。Nook Color也不行，也要转成它可以硬解的MP4，不然放的很
: 不好。不知道现在其它的Android Tablet能不能达到这种程度
: 说起来iPad类的Tablet确实在很多方面都是对Laptop的downgrade，包括运算能力和存
: 储空间，和易用性（是的，在大部分方面Laptop易用性更好）。提升的方面是体积小，
: 轻便和电池续航能力。Tablet确实在相当一段时间内没有办法取代Laptop，只能是补充
: 。
: ***刚刚丈母娘又问我怎么往iPad上传宝宝视频有感。

c*r2010-12-28 08:12

10 楼

我觉得先加样容易cross contaminate啊？

h*22010-12-28 08:12

11 楼

把你的笔记本作为网关？
att->笔记本->在连接里设置"共享internet连接"->wireless router的WAN口->wired/
wireless network to home computers

【在 T*******x 的大作中提到】

: 前面我问了一个两个无线网的问题，问题没有解决。
: （有几个人的回答太专业了，我看不懂）
: 重新描述一下问题：
: 我们这里有一个地区性的免费的at&t的无线网，我就用这个上internet。
: 家里原本有一个wireless router，现在作为家庭内部网使用，不能上internet。
: 一台电脑同时上两个wireless网的问题现在解决不了了，
: 我就退而求其次，让一台电脑同时上一个wireless网，一个wired网：
: 我希望用att的wireless上internent，另外用一根网线连接我的wireless router。
: 这样家庭内部网就用wired network。
: 但是还是不行：

M*n2010-12-28 08:12

12 楼

用来用去，还是windows最好用，

【在 N**D 的大作中提到】

: 还是windows，啥都能放

Z*52010-12-28 08:12

13 楼

我之所以问这个问题，是看了一些kit的protocol，上面都是说最后加模板，所以比较
困惑。

【在 h********n 的大作中提到】

: I think you are right.
: I talked with tech experts in ABI and they suggested the primer should be
: the last to dispense.

h*r2010-12-28 08:12

14 楼

这种情况典型解决办法就是拿一台电脑当网关了。
Control panel -> network and internet -> network connection
按lz的配置，这里一个无线连接一个有线连接，右键点无线连接
Property -> Sharing -> (click) Allow other network blahblah -> select your
wired connection.

【在 h**2 的大作中提到】

: 把你的笔记本作为网关？
: att->笔记本->在连接里设置"共享internet连接"->wireless router的WAN口->wired/
: wireless network to home computers

d*92010-12-28 08:12

15 楼

nc实在太值得玩了

【在 c*******i 的大作中提到】

: nook color上用moboplayer,一般的美剧和四百M左右的电影都没有压力

s*y2010-12-28 08:12

16 楼

做相对定量的话当然先加引物，否则的话，PCR的条件就很不一致了，产生的
曲线斜率也不一样（这个和过量已否无关）就很难在不同的模板之间比较了。
而且我不理解你这个先加模板的说法，因为我们一般都是比较不同模板的，
怎么可以先加模板呢？除非你是要做同一个模板里面不同基因的绝对定量，才有
这个选项。

【在 Z******5 的大作中提到】

: 大家做qRT-PCR的时候，一般是最后加模板还是最后加引物？
: 我觉得为了使定量准确，应该先加模板，然后分装，再分别加引物。
: 因为决定Ct值的是模板量，引物是过量的，先加模板分装后再加引物能够保证内参和目
: 的基因所使用的模板量差异达到最小。

t*t2010-12-28 08:12

17 楼

最基础的办法是设路由表。你什么系统，如果是windows，把route print的结果贴贴看
。（同时接有线和无线。）
另外，如果你某台机器同时上wireless和wired，那家里别的机器你打算怎么上
internet呢？

【在 T*******x 的大作中提到】

: 前面我问了一个两个无线网的问题，问题没有解决。
: （有几个人的回答太专业了，我看不懂）
: 重新描述一下问题：
: 我们这里有一个地区性的免费的at&t的无线网，我就用这个上internet。
: 家里原本有一个wireless router，现在作为家庭内部网使用，不能上internet。
: 一台电脑同时上两个wireless网的问题现在解决不了了，
: 我就退而求其次，让一台电脑同时上一个wireless网，一个wired网：
: 我希望用att的wireless上internent，另外用一根网线连接我的wireless router。
: 这样家庭内部网就用wired network。
: 但是还是不行：

j*e2010-12-28 08:12

18 楼

第一 pad本来就没打算代替notebook/pc
第二你ipad根本没用精有的是第三方能直接播放avi甚至mkv文件的app，传文件除了itunes也还有N种方法
感叹为啥东西还没用熟就能发表总结。
tech gadget这东西要用精还是要花点时间学习 iOS和android都一样。

Z*52010-12-28 08:12

19 楼

比如说我要检测没有处理的细胞Con和处理后的细胞Tre之间基因G表达的变化，那么就
是要分别定量Con和Tre cDNA中基因G和内参GAPDH的量。要看基因G的变化，就是看它
在实验组和对照组中相对于内参的变化。这个应该算是同一个模板里不同基因的相对
定量吧。

【在 s******y 的大作中提到】

: 做相对定量的话当然先加引物，否则的话，PCR的条件就很不一致了，产生的
: 曲线斜率也不一样（这个和过量已否无关）就很难在不同的模板之间比较了。
: 而且我不理解你这个先加模板的说法，因为我们一般都是比较不同模板的，
: 怎么可以先加模板呢？除非你是要做同一个模板里面不同基因的绝对定量，才有
: 这个选项。

a92010-12-28 08:12

20 楼

有线网卡不要设网关。

【在 T*******x 的大作中提到】

: 前面我问了一个两个无线网的问题，问题没有解决。
: （有几个人的回答太专业了，我看不懂）
: 重新描述一下问题：
: 我们这里有一个地区性的免费的at&t的无线网，我就用这个上internet。
: 家里原本有一个wireless router，现在作为家庭内部网使用，不能上internet。
: 一台电脑同时上两个wireless网的问题现在解决不了了，
: 我就退而求其次，让一台电脑同时上一个wireless网，一个wired网：
: 我希望用att的wireless上internent，另外用一根网线连接我的wireless router。
: 这样家庭内部网就用wired network。
: 但是还是不行：

A*a2010-12-28 08:12

21 楼

goodplayer
OPlayerHD
基本啥片都能放，rmvb, mkv等等

【在 b***y 的大作中提到】

: 就是我随便什么视屏文件往上一放都可以放，而且空间大得多。如果iPad的话还要转成
: MP4。特别是一些家庭录像什么的都是照相机或者camcorder拍的，很多都是AVI的格式
: 。盗版的就更不用说了。Nook Color也不行，也要转成它可以硬解的MP4，不然放的很
: 不好。不知道现在其它的Android Tablet能不能达到这种程度
: 说起来iPad类的Tablet确实在很多方面都是对Laptop的downgrade，包括运算能力和存
: 储空间，和易用性（是的，在大部分方面Laptop易用性更好）。提升的方面是体积小，
: 轻便和电池续航能力。Tablet确实在相当一段时间内没有办法取代Laptop，只能是补充
: 。
: ***刚刚丈母娘又问我怎么往iPad上传宝宝视频有感。

s*y2010-12-28 08:12

22 楼

份特。你这个明显用一个很简单的相对定量qPCR就可以搞定。
应该就是不同的模板！因为处理和没有处理的细胞的模板是分开的！
绝对不可以混到一起来！否则就没法作了！

【在 Z******5 的大作中提到】

: 比如说我要检测没有处理的细胞Con和处理后的细胞Tre之间基因G表达的变化，那么就
: 是要分别定量Con和Tre cDNA中基因G和内参GAPDH的量。要看基因G的变化，就是看它
: 在实验组和对照组中相对于内参的变化。这个应该算是同一个模板里不同基因的相对
: 定量吧。

b*t2010-12-28 08:12

23 楼

哪儿有那么麻烦，去买个能连接无线接入的无线ap即可
你说的情况不就是右下角那个么

x*q2010-12-28 08:12

24 楼

我知道解码最好的Android Tablet是蓝魔音乐汇W10
http://tech.hexun.com/2011-03-31/128376494.html
缺点是用的电阻屏。我准备等下一代电容屏就进一个。。。
另外 ipad不是专业1080P播放机，软解和硬解差远了。在这方面计较没啥意思

【在 b***y 的大作中提到】

: 就是我随便什么视屏文件往上一放都可以放，而且空间大得多。如果iPad的话还要转成
: MP4。特别是一些家庭录像什么的都是照相机或者camcorder拍的，很多都是AVI的格式
: 。盗版的就更不用说了。Nook Color也不行，也要转成它可以硬解的MP4，不然放的很
: 不好。不知道现在其它的Android Tablet能不能达到这种程度
: 说起来iPad类的Tablet确实在很多方面都是对Laptop的downgrade，包括运算能力和存
: 储空间，和易用性（是的，在大部分方面Laptop易用性更好）。提升的方面是体积小，
: 轻便和电池续航能力。Tablet确实在相当一段时间内没有办法取代Laptop，只能是补充
: 。
: ***刚刚丈母娘又问我怎么往iPad上传宝宝视频有感。

Z*52010-12-28 08:12

25 楼

我也分特了，我的意思是比如定对照组中基因G和GAPDH的量时，应该先把模板，mix之
类的加到一起，最后分装之后再加引物。

【在 s******y 的大作中提到】

: 份特。你这个明显用一个很简单的相对定量qPCR就可以搞定。
: 应该就是不同的模板！因为处理和没有处理的细胞的模板是分开的！
: 绝对不可以混到一起来！否则就没法作了！

T*x2010-12-28 08:12

26 楼

我家有三台电脑：一个台式机，两个笔记本，都是windows7。
两个笔记本都有无线网，可以上att的公共无线网。
台式机目前只有有线网卡，所以不能上网，
我已经order了一个usb无线adapter，接上后就可以上att的公共无线网了。
家里本来有一个wireless router，现在台式机就接在上面，但是不能上网。
这个router想作为家庭内部网使用。
我发现一台机器不能同时上两个无线网，但是可以同时上一个无线网和一个有线网。
我的想法是：等台式机的USB adapter来了以后，
这台机器同时上att的公共无线网和我自己的router（通过网线连接）。
另外两台笔记本平时就上att的网，用来上网玩，需要和其他电脑通信的时候
就断掉att的网上，然后用wireless的方式上我自己的router，
这样就可以通过自己的router和我的其他电脑通信（以及共享打印机）。
这个方案虽然不是很完美，但是也不是很麻烦，毕竟选择连接wireless network
还是比较容易的。
但是我昨天试了一下：我用笔记本接网线连在我的router上，
同时这个笔记本也通过wireless上att

【在 h******r 的大作中提到】

: 这种情况典型解决办法就是拿一台电脑当网关了。
: Control panel -> network and internet -> network connection
: 按lz的配置，这里一个无线连接一个有线连接，右键点无线连接
: Property -> Sharing -> (click) Allow other network blahblah -> select your
: wired connection.

m*82010-12-28 08:12

27 楼

一般的山寨平板在放视频方面比IPAD强得多，基本上720P以下的什么格式都通吃。IPAD
就算JB也得用特殊软件（IFUNBOX等）管理，远不如其他平板，USB一接一考完事。
平板最大的问题是输入远不如上网本方便。要是再带上键盘什么的一堆零碎，便携性跟
上网本比就没有优势了。
如果说到IPAD的不足，还有一点很不好，上网的时候看到好的图片，电影或软件（不一
定是IOS软件）什么的，想下载下来永久保存，虽不是MISSION IMPOSSIBLE，也能累你
个半死。

Z*52010-12-28 08:12

28 楼

可能我表述的不完整，不清楚，还是重新说一次。
两个样品--实验组&对照组，两对引物--目的基因和内参，假设每个只做一管，不用
做重复，那么最后是4管反应体系。加样顺序有两种：
1，分别加一个2x的实验组cDNA，qPCR MIX, Dye，H2O 和对照组cDNA，qPCR MIX，
Dye，H2O，然后再分别分装成两管，最后分别加引物。
2，分别加一个2x的目的基因引物，qPCR MIX, Dye，H2O 和内参引物，qPCR MIX，
Dye，H2O，然后再分别分装成两管，最后分别加cDNA。
我觉得1更合理，但是很多kit的protocol上是最后才加cDNA。

T*x2010-12-28 08:12

29 楼

以下是route print的结果，有折行，sorry。
这是我用笔记本同时上att的无限网和通过网线连接上有线网的结果。
C:\Users\Zheng>route print
========================================================================
===
Interface List
12...00 1d 72 38 27 41 ......Marvell Yukon 88E8071 PCI-E Gigabit
Ethernet Cont
oller
11...00 1f e1 73 f0 65 ......Broadcom 802.11g Network Adapter
1...........................Software Loopback Interface 1
13...00 00 00 00 00 00 00 e0 Teredo Tunneling Pseudo-Interface
17...00 00 00 00 00 00 00 e0 Microsoft ISATAP Ada

【在 t****t 的大作中提到】

: 最基础的办法是设路由表。你什么系统，如果是windows，把route print的结果贴贴看
: 。（同时接有线和无线。）
: 另外，如果你某台机器同时上wireless和wired，那家里别的机器你打算怎么上
: internet呢？

m*t2010-12-28 08:12

30 楼

楼主明显的孤陋寡闻了。现在ipad上基本通用格式都可以放了，wmv,avi, rmvb,mkv等
。

h*n2010-12-28 08:12

31 楼

I mean in 3-replicate wells, the last thing is addition of primer.

【在 s******y 的大作中提到】

: 做相对定量的话当然先加引物，否则的话，PCR的条件就很不一致了，产生的
: 曲线斜率也不一样（这个和过量已否无关）就很难在不同的模板之间比较了。
: 而且我不理解你这个先加模板的说法，因为我们一般都是比较不同模板的，
: 怎么可以先加模板呢？除非你是要做同一个模板里面不同基因的绝对定量，才有
: 这个选项。

T*x2010-12-28 08:12

32 楼

即无线接入的无线路由器？
那应该是可以的，不过我不想再添设备了，希望最大限度的利用免费资源。

http://www.dlink.com.cn/webapp/util/web_edit/uploadfile/20090630145559599.
jpg

【在 b*****t 的大作中提到】

: 哪儿有那么麻烦，去买个能连接无线接入的无线ap即可
: 你说的情况不就是右下角那个么

e*y2010-12-28 08:12

33 楼

这些只是封装格式, 对编码格式的支持呢

【在 m****t 的大作中提到】

: 楼主明显的孤陋寡闻了。现在ipad上基本通用格式都可以放了，wmv,avi, rmvb,mkv等
: 。

y*k2010-12-28 08:12

34 楼

理论上确实1更好一点，可以减少不同管中cDNA量差异带来的误差
不过碰到大量sample的情况还是2更方便啊......并且我不觉得2会比1差很多......

，
，

【在 Z******5 的大作中提到】

: 可能我表述的不完整，不清楚，还是重新说一次。
: 两个样品--实验组&对照组，两对引物--目的基因和内参，假设每个只做一管，不用
: 做重复，那么最后是4管反应体系。加样顺序有两种：
: 1，分别加一个2x的实验组cDNA，qPCR MIX, Dye，H2O 和对照组cDNA，qPCR MIX，
: Dye，H2O，然后再分别分装成两管，最后分别加引物。
: 2，分别加一个2x的目的基因引物，qPCR MIX, Dye，H2O 和内参引物，qPCR MIX，
: Dye，H2O，然后再分别分装成两管，最后分别加cDNA。
: 我觉得1更合理，但是很多kit的protocol上是最后才加cDNA。

T*x2010-12-28 08:12

35 楼

有线网卡不要设网关？不是很懂，我找找看怎么弄。

【在 a9 的大作中提到】

: 有线网卡不要设网关。

M*n2010-12-28 08:12

36 楼

那还不错，最好是那种一个player可以播放全部格式，

【在 m****t 的大作中提到】

: 楼主明显的孤陋寡闻了。现在ipad上基本通用格式都可以放了，wmv,avi, rmvb,mkv等
: 。

C*e2010-12-28 08:12

37 楼

有人可以更加明确的告诉我假设加样非常准确的话
最后加引物和最后加模板两个到底有什么不一样么？

T*x2010-12-28 08:12

38 楼

我试了一下，似乎可以了！
我用一台电脑（笔记本）上att的公用无线网，然后按你说的方法把他做网关，
然后用网线把我自己的router接入到这台电脑上。
我的台式机接在router上，现在可以上网了。
这个方法真不错。谢谢。
现在我唯一的疑问是：
本来我的每台电脑都是分别接入att的无线网，下载速度互相应该不受影响。
现在一台电脑作为网关，其他电脑通过它上网，那么总带宽就被它限制住了吧？
我也不确定，也可能不会，我试试看。

your

【在 h******r 的大作中提到】

: 这种情况典型解决办法就是拿一台电脑当网关了。
: Control panel -> network and internet -> network connection
: 按lz的配置，这里一个无线连接一个有线连接，右键点无线连接
: Property -> Sharing -> (click) Allow other network blahblah -> select your
: wired connection.

d*02010-12-28 08:12

39 楼

flash?

【在 m****t 的大作中提到】

: 楼主明显的孤陋寡闻了。现在ipad上基本通用格式都可以放了，wmv,avi, rmvb,mkv等
: 。

Z*g2010-12-28 08:12

40 楼

都非常准确了,还有差别?可能就是省不省事的差别,比如样品多,扩的基因少,就先加引
物;样品少,扩的基因多,就先加模板,这样就比较省事.

【在 C*******e 的大作中提到】

: 有人可以更加明确的告诉我假设加样非常准确的话
: 最后加引物和最后加模板两个到底有什么不一样么？

h*r2010-12-28 08:12

41 楼

哦，不好意思，我之前误解你的意思了。。以为你只有一台电脑同时有无线网卡和有线
网卡。
现在看来，你3台机器都有两种网卡，对吧？
你是打算用无线网卡直接接入ATT提供的因特网，用有线网卡连到路由器上组成家庭局域
网对吧？
如果是这样的话，还是很简单。
1。对每台电脑的两个网络连接做如下操作：
无线连接：右键 -> Property -> TCP/IPv4 -> Advanced -> uncheck automatic metr
ic, and set interface metric to be 1
有线连接：同样的操作，但要set interface metric=2
这样回答了你原帖的问题，为啥优先使用无线网，因为在automatic metric情况下，机
器自动选择速度快的连接作为默认网关。
2。然后每台电脑无线接入att，有线直接插在路由器上就应该OK了

【在 T*******x 的大作中提到】

: 我试了一下，似乎可以了！
: 我用一台电脑（笔记本）上att的公用无线网，然后按你说的方法把他做网关，
: 然后用网线把我自己的router接入到这台电脑上。
: 我的台式机接在router上，现在可以上网了。
: 这个方法真不错。谢谢。
: 现在我唯一的疑问是：
: 本来我的每台电脑都是分别接入att的无线网，下载速度互相应该不受影响。
: 现在一台电脑作为网关，其他电脑通过它上网，那么总带宽就被它限制住了吧？
: 我也不确定，也可能不会，我试试看。
:

m*t2010-12-28 08:12

42 楼

XBMC，很强大啊，支持几乎所有的编码，支持1080p.

【在 e***y 的大作中提到】

: 这些只是封装格式, 对编码格式的支持呢

c*r2010-12-28 08:12

43 楼

同学，你这个连term都乱用啊
模板是说template，就是你的cDNA。
你的例子中必须按2做，1有systematic error，你看不出来？
你的目的是比较Con和Tre的中以GAPDH做reference时候G的区别。所以是比较模板的区
别。
因此你需要把没差别的东西都一同混合，减少因为这些东西差别引起的系统误差。这里
面包括：MasterMix，Dye，水，所有primers等等，就是除了你的cDNA之外的所有东西
。然后分装到PCR plate上。然后把cDNA直接加到你的plate上，这样你的每一个well直
接的差别就是你的cDNA的差别，不是primer的差别。
另外，其实，你可以做one-step RT-PCR，定量更准确。

a92010-12-28 08:12

44 楼

在高级里调一下网络的顺序就行了。

局域
metr

【在 h******r 的大作中提到】

: 哦，不好意思，我之前误解你的意思了。。以为你只有一台电脑同时有无线网卡和有线
: 网卡。
: 现在看来，你3台机器都有两种网卡，对吧？
: 你是打算用无线网卡直接接入ATT提供的因特网，用有线网卡连到路由器上组成家庭局域
: 网对吧？
: 如果是这样的话，还是很简单。
: 1。对每台电脑的两个网络连接做如下操作：
: 无线连接：右键 -> Property -> TCP/IPv4 -> Advanced -> uncheck automatic metr
: ic, and set interface metric to be 1
: 有线连接：同样的操作，但要set interface metric=2

m*t2010-12-28 08:12

45 楼

现在有好几种软件都可以了，Skyfire浏览器可以直接在网页上看。

【在 d*****0 的大作中提到】

: flash?

C*e2010-12-28 08:12

46 楼

我就是这个意思啊
所以lz的意思没看懂
想让人指点一下

【在 Z**********g 的大作中提到】

: 都非常准确了,还有差别?可能就是省不省事的差别,比如样品多,扩的基因少,就先加引
: 物;样品少,扩的基因多,就先加模板,这样就比较省事.

t*t2010-12-28 08:12

47 楼

你如果每台机器都用同一个频道, 那没区别. 所谓"分别接入"只是逻辑上的, 物理上其
实还是时分复用的. 如果你三台机器用三个不同的频道那是有区别的.

【在 T*******x 的大作中提到】

: 我试了一下，似乎可以了！
: 我用一台电脑（笔记本）上att的公用无线网，然后按你说的方法把他做网关，
: 然后用网线把我自己的router接入到这台电脑上。
: 我的台式机接在router上，现在可以上网了。
: 这个方法真不错。谢谢。
: 现在我唯一的疑问是：
: 本来我的每台电脑都是分别接入att的无线网，下载速度互相应该不受影响。
: 现在一台电脑作为网关，其他电脑通过它上网，那么总带宽就被它限制住了吧？
: 我也不确定，也可能不会，我试试看。
:

e*y2010-12-28 08:12

48 楼

试过android上的, 非常差, 跟原生flash不是一回事, 不知道ios的会不会好点

【在 m****t 的大作中提到】

:
: 现在有好几种软件都可以了，Skyfire浏览器可以直接在网页上看。

C*e2010-12-28 08:12

49 楼

还是院长一针见血

【在 c******r 的大作中提到】

: 同学，你这个连term都乱用啊
: 模板是说template，就是你的cDNA。
: 你的例子中必须按2做，1有systematic error，你看不出来？
: 你的目的是比较Con和Tre的中以GAPDH做reference时候G的区别。所以是比较模板的区
: 别。
: 因此你需要把没差别的东西都一同混合，减少因为这些东西差别引起的系统误差。这里
: 面包括：MasterMix，Dye，水，所有primers等等，就是除了你的cDNA之外的所有东西
: 。然后分装到PCR plate上。然后把cDNA直接加到你的plate上，这样你的每一个well直
: 接的差别就是你的cDNA的差别，不是primer的差别。
: 另外，其实，你可以做one-step RT-PCR，定量更准确。

t*t2010-12-28 08:12

50 楼

你有线网的IP怎么分配的? 是用路由器的DHCP分配的吗?
if your router is using tomato, go to advanced->dhcp/dns->dnsmasq custom configuration, write in the box
dhcp-option "3 6"
this will suppress the default route and DNS of wired network.
The other way is to set your wired network to static IP; and don't set a
default gateway. but since you are using laptop, you may not want to do it.
same can be said for manually setting metric.

【在 T*******x 的大作中提到】

: 以下是route print的结果，有折行，sorry。
: 这是我用笔记本同时上att的无限网和通过网线连接上有线网的结果。
: C:\Users\Zheng>route print
: ========================================================================
: ===
: Interface List
: 12...00 1d 72 38 27 41 ......Marvell Yukon 88E8071 PCI-E Gigabit
: Ethernet Cont
: oller
: 11...00 1f e1 73 f0 65 ......Broadcom 802.11g Network Adapter

c*h2010-12-28 08:12

51 楼

现在啥格式都能放了。

【在 b***y 的大作中提到】

: 就是我随便什么视屏文件往上一放都可以放，而且空间大得多。如果iPad的话还要转成
: MP4。特别是一些家庭录像什么的都是照相机或者camcorder拍的，很多都是AVI的格式
: 。盗版的就更不用说了。Nook Color也不行，也要转成它可以硬解的MP4，不然放的很
: 不好。不知道现在其它的Android Tablet能不能达到这种程度
: 说起来iPad类的Tablet确实在很多方面都是对Laptop的downgrade，包括运算能力和存
: 储空间，和易用性（是的，在大部分方面Laptop易用性更好）。提升的方面是体积小，
: 轻便和电池续航能力。Tablet确实在相当一段时间内没有办法取代Laptop，只能是补充
: 。
: ***刚刚丈母娘又问我怎么往iPad上传宝宝视频有感。

s*y2010-12-28 08:12

52 楼

这个实验不是这么做的。因为大部分情况下面，不同的primer 所用的
PCR condition 不一样，所以不推荐在同一个cycle 里运行。
你应该是个菜鸟吧？那就不要乱改protocol 了。
这个实验应该这么做：
1. Primer gene G premixed, then add template control and template treated separately, with 3 replica .
2. Primer GAPDH premixed, then add template control and template treated separately, with 3 replica
所以要跑两次PCR.

【在 Z******5 的大作中提到】

: 我也分特了，我的意思是比如定对照组中基因G和GAPDH的量时，应该先把模板，mix之
: 类的加到一起，最后分装之后再加引物。

d*a2010-12-28 08:12

53 楼

wireless router直接连无限网
要把wireless router的mode从AP改成client
计算机通过cable连到router的LAN端口

【在 T*******x 的大作中提到】

: 前面我问了一个两个无线网的问题，问题没有解决。
: （有几个人的回答太专业了，我看不懂）
: 重新描述一下问题：
: 我们这里有一个地区性的免费的at&t的无线网，我就用这个上internet。
: 家里原本有一个wireless router，现在作为家庭内部网使用，不能上internet。
: 一台电脑同时上两个wireless网的问题现在解决不了了，
: 我就退而求其次，让一台电脑同时上一个wireless网，一个wired网：
: 我希望用att的wireless上internent，另外用一根网线连接我的wireless router。
: 这样家庭内部网就用wired network。
: 但是还是不行：

b*y2010-12-28 08:12

54 楼

你们这些人还是要求太低，随便一句啥格式都能放了就满足了。你们都没有领会我想表达的意思。
好吧，具体说说，就是一下几条。我敢说现在没有一个Pad能满足以下所有的，能满足其中两条就不错了。
格式支持
播放效果（特别是高清的视频）
存储空间
简单的传输方式
不需要转换文件（转小，或者转格式）

【在 c*****h 的大作中提到】

: 现在啥格式都能放了。

s*y2010-12-28 08:12

55 楼

可是他明显不是那个意思啊，他是想把template 先加上去，然后再加不同的
primer. 所以他这个不是为了做3-replicate

【在 h********n 的大作中提到】

: I mean in 3-replicate wells, the last thing is addition of primer.

T*x2010-12-28 08:12

56 楼

谢谢。
昨天用网关的方法开始的时候成功了，但是过了一会所有机器都上不了internet了。
att的免费无线网也上不了internet了。
我当时估计有两种可能的原因：
一个是免费网的使用时间到期了。另一个可能和我设网关下接其他几台电脑有关。
等了一天都没好，一直都上不来。今天上午还专门跑到Starbucks去上网。
中午回来的时候发现att的免费网又可以上了。
这次我读了一下term and condition，没有时间到期的问题。
但是说到不可以resell等等，所以我想应该是我设网关下接其他几台电脑不行。
所以网关的方法就不可行了。
你下面说的方法我大概明白了，我会试试。

局域
metr

【在 h******r 的大作中提到】

: 哦，不好意思，我之前误解你的意思了。。以为你只有一台电脑同时有无线网卡和有线
: 网卡。
: 现在看来，你3台机器都有两种网卡，对吧？
: 你是打算用无线网卡直接接入ATT提供的因特网，用有线网卡连到路由器上组成家庭局域
: 网对吧？
: 如果是这样的话，还是很简单。
: 1。对每台电脑的两个网络连接做如下操作：
: 无线连接：右键 -> Property -> TCP/IPv4 -> Advanced -> uncheck automatic metr
: ic, and set interface metric to be 1
: 有线连接：同样的操作，但要set interface metric=2

s*c2010-12-28 08:12

57 楼

表达的意思。
足其中两条就不
错了。
华硕新的变形金刚就满足你的要求啊
xoom也行
你一个存储空间和简单的传输方式就把所有apple产品给毙了

【在 b***y 的大作中提到】

: 你们这些人还是要求太低，随便一句啥格式都能放了就满足了。你们都没有领会我想表达的意思。
: 好吧，具体说说，就是一下几条。我敢说现在没有一个Pad能满足以下所有的，能满足其中两条就不错了。
: 格式支持
: 播放效果（特别是高清的视频）
: 存储空间
: 简单的传输方式
: 不需要转换文件（转小，或者转格式）

c*r2010-12-28 08:12

58 楼

应该可以做multiplex reaction
GAPDH是可以做所谓的internal control的。就是说，在同一个pcr中，同时run两个甚
至两个targets，其中一个是control，另外一个是要测的基因。
这个internal control的目的有两个，一个是quality control，就是保证这个
reaction没有忘掉任何东西，没有加错任何东西等等。另外一个目的是loading
control，assumption就是两个sample中的GAPDH是不变的，换句话说，要测量的是在同
样量的GAPDH下，要测的基因在处理前和处理后有无变化。
为了达到这个目的，最好是run multiplex。这样才能保证测到的GAPDH和G之间是来自
确定的同一个loading量。
另外一个run multiplex的原因是统计的原因。如果分开run GAPDH和G，那么
triplicate之后会得到三个G的量，和三个GAPDH的量，而这六个量之间没有一一对应的
关系。就是说不能用G1/GAPDH1，G2/GAPDH2。。。。而只能用G的平均值/GAPDH的平均
值。但是得到的这个平均值却没有standard deviation。因为G的值是符合正态分布的
，GAPDH的三个值也符合正态分布。但是两个值相除之后却不是正态分布。因此不存在
standard deviation。如果做图，那么只有一个bar，却没有分布范围，不知道其可信
区间在哪里。
因此，qPCR，一般都是run multiplex的reaction的。
而调整PCR condition是相对简单的事情，比如适当设计primers就可以了。

separately, with 3 replica .
separately, with 3 replica

【在 s******y 的大作中提到】

: 这个实验不是这么做的。因为大部分情况下面，不同的primer 所用的
: PCR condition 不一样，所以不推荐在同一个cycle 里运行。
: 你应该是个菜鸟吧？那就不要乱改protocol 了。
: 这个实验应该这么做：
: 1. Primer gene G premixed, then add template control and template treated separately, with 3 replica .
: 2. Primer GAPDH premixed, then add template control and template treated separately, with 3 replica
: 所以要跑两次PCR.

j*02010-12-28 08:12

59 楼

ipad就是大妈们的。。

【在 b***y 的大作中提到】

: 就是我随便什么视屏文件往上一放都可以放，而且空间大得多。如果iPad的话还要转成
: MP4。特别是一些家庭录像什么的都是照相机或者camcorder拍的，很多都是AVI的格式
: 。盗版的就更不用说了。Nook Color也不行，也要转成它可以硬解的MP4，不然放的很
: 不好。不知道现在其它的Android Tablet能不能达到这种程度
: 说起来iPad类的Tablet确实在很多方面都是对Laptop的downgrade，包括运算能力和存
: 储空间，和易用性（是的，在大部分方面Laptop易用性更好）。提升的方面是体积小，
: 轻便和电池续航能力。Tablet确实在相当一段时间内没有办法取代Laptop，只能是补充
: 。
: ***刚刚丈母娘又问我怎么往iPad上传宝宝视频有感。

Z*g2010-12-28 08:12

60 楼

sun姐可能误解了LZ的意思了，LZ是说对于同一模板（比如control的cDNA）,假设要扩3
个基因，又假设每个基因3个replica，就是9管，这样先配9倍体积的1X mix,包括
Mastermix,dye,H2O,cDNA,然后分装成9管，每三管分别加入1个基因的primer；同样对
treated的cDNA也一样。
然后有人说这样就产生了由引物带来的系统误差。我的问题是如果最后加入模板，由
pipeting所产生的误差叫什么误差？如果由引物带来的系统误差都足够大到不能忽略的
话，那么可以想象，由最后一步加入模板所产生的这种误差会大到何等程度。这样反而
最后加引物更为准确了。
不过如果最后加引物，对于同一模板同一扩增基因的replica而言，似乎就没什么意思
了，感觉这种replica目的是要测由所加引物所带来的差别。

【在 s******y 的大作中提到】

: 可是他明显不是那个意思啊，他是想把template 先加上去，然后再加不同的
: primer. 所以他这个不是为了做3-replicate

D*l2010-12-28 08:12

61 楼

这不是自己折磨么，在10“的显示器播放1080的高清。
一个720的mk要5GB。你还要玩机器上传，干脆电脑看算了。

表达的意思。
足其中两条就不错了。

【在 b***y 的大作中提到】

: 你们这些人还是要求太低，随便一句啥格式都能放了就满足了。你们都没有领会我想表达的意思。
: 好吧，具体说说，就是一下几条。我敢说现在没有一个Pad能满足以下所有的，能满足其中两条就不错了。
: 格式支持
: 播放效果（特别是高清的视频）
: 存储空间
: 简单的传输方式
: 不需要转换文件（转小，或者转格式）

f*r2010-12-28 08:12

62 楼

大家都过虑了。
模板（样品、cDNA）加得一致不一致，其实没那么重要。精益求精当然好，但RT-PCR是
个非常敏感的实验，duplicates或triplicates之间Ct值互相吻合的程度很低（相对于
其他定量试验而言，比如ELISA）。一般情况下，duplicates的Ct值相差0.5就可以容忍
（有的实验室可能要求0.2，我在此致用0.5来举例）。那么这个0.5是个什么概念呢？
那就是2^0.5，或者说根号2，也就是1.4。这两个duplicates，其中一个比另一个高40%
，这样都可以容忍。
你加模板的时候，假设加5ul。140%就相当于7ul。你想想看，谁加样的技术能差到这个
地步？所以说，模板加得是不是一致，并不重要。Ct值的偏差来自于其他试验条件。
那么引物啊、buffer啊、原料啊（dNTP）、酶啊等等的重要程度如何呢？我不想展开太
多。简便起见，我只说说引物和master mix（就是buffer，原料、酶、荧光染料的混合
物）。在对数扩增曲线（LOG VIEW）中，模板的多少主要影响x轴截距；引物的多少主
要影响平台的高度；master mix的特性主要影响斜率（线性区）。与模板对曲线的影响
强弱相仿，如果不彻底改变反应体系，仅仅是先加哪个先混合哪个，最终对扩增曲线的
影响是微乎其微的。如果大家实验室有富余盘子和药品，不妨自己做做各种反应物的浓
度曲线，看看这些因素到底能带来多大影响。
RT-PCR的系统误差远远高于随机误差，包括误差出现的频度与误差对最终结果的影响。
以下方面会带来比较明显的系统误差：
机器有没有校正
盘子能不能盖严
膜或者盖子是不是每个孔都很干净
盘子well壁是不是光滑，cycle过程中，会不会有水汽凝结在壁上，而不流回well底部
盘子与机器是否绝对吻合，盘子是不是能真正放平

t*p2010-12-28 08:12

63 楼

两分钟的720P视频要200多MB,还是3GP的.

【在 D*******l 的大作中提到】

: 这不是自己折磨么，在10“的显示器播放1080的高清。
: 一个720的mk要5GB。你还要玩机器上传，干脆电脑看算了。
:
: 表达的意思。
: 足其中两条就不错了。

C*e2010-12-28 08:12

64 楼

对于院长的这句话我不敢苟同
“只能用G的平均值/GAPDH的平均值。但是得到的这个平均值却没有standard
deviation”
如果照你这么说的
那还需要误差传递公式做什么

【在 c******r 的大作中提到】

: 应该可以做multiplex reaction
: GAPDH是可以做所谓的internal control的。就是说，在同一个pcr中，同时run两个甚
: 至两个targets，其中一个是control，另外一个是要测的基因。
: 这个internal control的目的有两个，一个是quality control，就是保证这个
: reaction没有忘掉任何东西，没有加错任何东西等等。另外一个目的是loading
: control，assumption就是两个sample中的GAPDH是不变的，换句话说，要测量的是在同
: 样量的GAPDH下，要测的基因在处理前和处理后有无变化。
: 为了达到这个目的，最好是run multiplex。这样才能保证测到的GAPDH和G之间是来自
: 确定的同一个loading量。
: 另外一个run multiplex的原因是统计的原因。如果分开run GAPDH和G，那么

b*g2010-12-28 08:12

65 楼

nook color 放700M的那种avi文件帧数能到20-25每秒，没有问题。

C*e2010-12-28 08:12

66 楼

“realtime PCR是个非常敏感的实验”
我非常同意这一点
换句话说，这个实验有很大的系统误差
说实话，是属于你做得越多想得越多越不喜欢不觉得可信的一种实验！

40%

【在 f*********r 的大作中提到】

: 大家都过虑了。
: 模板（样品、cDNA）加得一致不一致，其实没那么重要。精益求精当然好，但RT-PCR是
: 个非常敏感的实验，duplicates或triplicates之间Ct值互相吻合的程度很低（相对于
: 其他定量试验而言，比如ELISA）。一般情况下，duplicates的Ct值相差0.5就可以容忍
: （有的实验室可能要求0.2，我在此致用0.5来举例）。那么这个0.5是个什么概念呢？
: 那就是2^0.5，或者说根号2，也就是1.4。这两个duplicates，其中一个比另一个高40%
: ，这样都可以容忍。
: 你加模板的时候，假设加5ul。140%就相当于7ul。你想想看，谁加样的技术能差到这个
: 地步？所以说，模板加得是不是一致，并不重要。Ct值的偏差来自于其他试验条件。
: 那么引物啊、buffer啊、原料啊（dNTP）、酶啊等等的重要程度如何呢？我不想展开太

j*02010-12-28 08:12

67 楼

re

Z*52010-12-28 08:12

68 楼

假设两次加模板的量分别是X1和X2，得到的Ct值分别是Ct1和Ct2，
那么delta Ct= log（X1/X2，2）
假设加模板的误差是1%，简单点，就是你一管加了5ul，另一管加了4.95ul，那么
delta Ct就是0.0145，这个误差肯定是可以接受的；
但是假设加模板的误差是1/10，就是你一管加了5ul，另一管加了4.5ul，那么delta Ct
就是0.152，这个误差还是不算小，但也还算可以接受。
我想即使对于菜鸟而言，加模板的误差也不应该比1/10再大了，所以我还是收回我的问
题算了，不过很感谢各位的讨论。
我还是菜鸟，自己勤快一点，早算一算就好了。

【在 C*******e 的大作中提到】

: 有人可以更加明确的告诉我假设加样非常准确的话
: 最后加引物和最后加模板两个到底有什么不一样么？

s*82010-12-28 08:12

69 楼

能不能告诉我哪个app能放rmvb。一直没找到。

【在 c*****h 的大作中提到】

: 现在啥格式都能放了。

Z*52010-12-28 08:12

70 楼

同意你这个说法，哈哈。我就是要检测对照组和实验组中10几个基因的差别，所以就
先加模板了。

【在 Z**********g 的大作中提到】

: 都非常准确了,还有差别?可能就是省不省事的差别,比如样品多,扩的基因少,就先加引
: 物;样品少,扩的基因多,就先加模板,这样就比较省事.

b*e2010-12-28 08:12

71 楼

android: moboplayer，这个免费
iOS: AVPlayer，这个需要付费，不过你可以找到破解的

【在 s******8 的大作中提到】

: 能不能告诉我哪个app能放rmvb。一直没找到。

Z*52010-12-28 08:12

72 楼

菜鸟弱弱的问一下，one-step RT-PCR指的就是Two-Step Cycling？

【在 c******r 的大作中提到】

: 同学，你这个连term都乱用啊
: 模板是说template，就是你的cDNA。
: 你的例子中必须按2做，1有systematic error，你看不出来？
: 你的目的是比较Con和Tre的中以GAPDH做reference时候G的区别。所以是比较模板的区
: 别。
: 因此你需要把没差别的东西都一同混合，减少因为这些东西差别引起的系统误差。这里
: 面包括：MasterMix，Dye，水，所有primers等等，就是除了你的cDNA之外的所有东西
: 。然后分装到PCR plate上。然后把cDNA直接加到你的plate上，这样你的每一个well直
: 接的差别就是你的cDNA的差别，不是primer的差别。
: 另外，其实，你可以做one-step RT-PCR，定量更准确。

A*a2010-12-28 08:12

73 楼

app store 里搜索rmvb
不过大部分都要钱，有个OPlayer HD Lite，free的，就是有小广告

【在 s******8 的大作中提到】

: 能不能告诉我哪个app能放rmvb。一直没找到。

Z*52010-12-28 08:12

74 楼

我设计引物的时候都会设计成同一个退火温度的。一次PCR搞定，这样比较方便呢。

separately, with 3 replica .
separately, with 3 replica

【在 s******y 的大作中提到】

: 这个实验不是这么做的。因为大部分情况下面，不同的primer 所用的
: PCR condition 不一样，所以不推荐在同一个cycle 里运行。
: 你应该是个菜鸟吧？那就不要乱改protocol 了。
: 这个实验应该这么做：
: 1. Primer gene G premixed, then add template control and template treated separately, with 3 replica .
: 2. Primer GAPDH premixed, then add template control and template treated separately, with 3 replica
: 所以要跑两次PCR.

b*y2010-12-28 08:12

75 楼

我不是为了一定要看高清,就是为了一个方便。平时下载的视频大部分是高清的，平时
用电脑接电视看，有时也想放在Pad上看，但又不想专门转成Pad能看的格式。没那时间。
就算不方便直接拷上去看，就是直接能通过WiFi在Network share上放也行，我也能接受。

【在 D*******l 的大作中提到】

: 这不是自己折磨么，在10“的显示器播放1080的高清。
: 一个720的mk要5GB。你还要玩机器上传，干脆电脑看算了。
:
: 表达的意思。
: 足其中两条就不错了。

Z*52010-12-28 08:12

76 楼

"在同一个pcr中，同时run两个甚至两个targets，其中一个是control，另外一个是要
测的基因"
这个用TaqMan貌似是可以，但是我们一般只用SYBR GREEN，一管中不能同时跑两个反应
的。

【在 c******r 的大作中提到】

: 应该可以做multiplex reaction
: GAPDH是可以做所谓的internal control的。就是说，在同一个pcr中，同时run两个甚
: 至两个targets，其中一个是control，另外一个是要测的基因。
: 这个internal control的目的有两个，一个是quality control，就是保证这个
: reaction没有忘掉任何东西，没有加错任何东西等等。另外一个目的是loading
: control，assumption就是两个sample中的GAPDH是不变的，换句话说，要测量的是在同
: 样量的GAPDH下，要测的基因在处理前和处理后有无变化。
: 为了达到这个目的，最好是run multiplex。这样才能保证测到的GAPDH和G之间是来自
: 确定的同一个loading量。
: 另外一个run multiplex的原因是统计的原因。如果分开run GAPDH和G，那么

v*s2010-12-28 08:12

77 楼

这个不算本质区别

f*r2010-12-28 08:12

78 楼

讨论总是有益的。自己算，即使能得出准确数值，但是得不出集体讨论所覆盖的广泛外
延。
做RT-PCR，不用过分追求百分之几、十几、甚至几十的误差。因为cDNA存在百分之几百
、几千的差别（也就是数量级上有差别），才会有蛋白水平上detectable的差别，才会
有意义。

Ct

【在 Z******5 的大作中提到】

: 假设两次加模板的量分别是X1和X2，得到的Ct值分别是Ct1和Ct2，
: 那么delta Ct= log（X1/X2，2）
: 假设加模板的误差是1%，简单点，就是你一管加了5ul，另一管加了4.95ul，那么
: delta Ct就是0.0145，这个误差肯定是可以接受的；
: 但是假设加模板的误差是1/10，就是你一管加了5ul，另一管加了4.5ul，那么delta Ct
: 就是0.152，这个误差还是不算小，但也还算可以接受。
: 我想即使对于菜鸟而言，加模板的误差也不应该比1/10再大了，所以我还是收回我的问
: 题算了，不过很感谢各位的讨论。
: 我还是菜鸟，自己勤快一点，早算一算就好了。

l*s2010-12-28 08:12

79 楼

装个xbmc，秒杀你的一切不满意。

c*r2010-12-28 08:12

80 楼

是吗？给科普一下吧

【在 C*******e 的大作中提到】

: 对于院长的这句话我不敢苟同
: “只能用G的平均值/GAPDH的平均值。但是得到的这个平均值却没有standard
: deviation”
: 如果照你这么说的
: 那还需要误差传递公式做什么

b*y2010-12-28 08:12

81 楼

xbmc就算了。我在我的Apple TV上装了，根本没法看我server上的高清电影。iPad 2不
知道，iPad应该计算能力应该也跟不上。

【在 l*****s 的大作中提到】

: 装个xbmc，秒杀你的一切不满意。

c*r2010-12-28 08:12

82 楼

sybr啊，那就没办法了

【在 Z******5 的大作中提到】

: "在同一个pcr中，同时run两个甚至两个targets，其中一个是control，另外一个是要
: 测的基因"
: 这个用TaqMan貌似是可以，但是我们一般只用SYBR GREEN，一管中不能同时跑两个反应
: 的。

l*s2010-12-28 08:12

83 楼

这个是硬件的能力，不是软件能够解决的。

【在 b***y 的大作中提到】

: xbmc就算了。我在我的Apple TV上装了，根本没法看我server上的高清电影。iPad 2不
: 知道，iPad应该计算能力应该也跟不上。

h*n2010-12-28 08:12

84 楼

在 triplicate里面加1 ul cDNA, 加样误差影响比较大. 如果加1 ul primer, 误差其
实没啥影响.

40%

【在 f*********r 的大作中提到】

: 大家都过虑了。
: 模板（样品、cDNA）加得一致不一致，其实没那么重要。精益求精当然好，但RT-PCR是
: 个非常敏感的实验，duplicates或triplicates之间Ct值互相吻合的程度很低（相对于
: 其他定量试验而言，比如ELISA）。一般情况下，duplicates的Ct值相差0.5就可以容忍
: （有的实验室可能要求0.2，我在此致用0.5来举例）。那么这个0.5是个什么概念呢？
: 那就是2^0.5，或者说根号2，也就是1.4。这两个duplicates，其中一个比另一个高40%
: ，这样都可以容忍。
: 你加模板的时候，假设加5ul。140%就相当于7ul。你想想看，谁加样的技术能差到这个
: 地步？所以说，模板加得是不是一致，并不重要。Ct值的偏差来自于其他试验条件。
: 那么引物啊、buffer啊、原料啊（dNTP）、酶啊等等的重要程度如何呢？我不想展开太

j*y2010-12-28 08:12

85 楼

看你怎么玩咯，有些东西ipad 是不能取代 windows 的，但有些东西iPad比笔记本方便
很多
就为了能在睡觉前抱着iPad看会视频，看完还能当枕头用，我就买了

j*x2010-12-28 08:12

86 楼

无论如何不建议使用1ul这样小的模板量，误差太大，我这里用机器人上样误差都有20-
30%，我猜想手工加之会更多吧
一般20ul的PCR体系，模板我使用4ul/以上（cDNA的话可以稀释），如果是sybr的话我
甚至用8ul，基本上模板造成的误差在10%以内了，再有triplicates基本上就消除影响了

【在 h********n 的大作中提到】

: 在 triplicate里面加1 ul cDNA, 加样误差影响比较大. 如果加1 ul primer, 误差其
: 实没啥影响.
:
: 40%

c*h2010-12-28 08:12

87 楼

avplayer
不同编码率的rmvb播放情况不同，有些编码率的声音会有点滞后，有些就没有问题。
如果不外出，在家里我一般是用air video，台式机、服务器上的视频就随便看了，没
有画音不同步的问题。

【在 s******8 的大作中提到】

: 能不能告诉我哪个app能放rmvb。一直没找到。

s*y2010-12-28 08:12

88 楼

顶一下这个。我一般都至少用3ul

20-
响了

【在 j****x 的大作中提到】

: 无论如何不建议使用1ul这样小的模板量，误差太大，我这里用机器人上样误差都有20-
: 30%，我猜想手工加之会更多吧
: 一般20ul的PCR体系，模板我使用4ul/以上（cDNA的话可以稀释），如果是sybr的话我
: 甚至用8ul，基本上模板造成的误差在10%以内了，再有triplicates基本上就消除影响了

c*h2010-12-28 08:12

89 楼

ipad上的话，air video就很好，拿个ipad在床上，wifi连接到台式机、服务器，随便看上面的视频，根本不用拷也不用转。

间。
接受。

【在 b***y 的大作中提到】

: 我不是为了一定要看高清,就是为了一个方便。平时下载的视频大部分是高清的，平时
: 用电脑接电视看，有时也想放在Pad上看，但又不想专门转成Pad能看的格式。没那时间。
: 就算不方便直接拷上去看，就是直接能通过WiFi在Network share上放也行，我也能接受。

f*r2010-12-28 08:12

90 楼

cDNA的量直接影响x轴截距，也就是Ct值。当然影响大了。引物只影响平台的高低，跟
Ct值没有直接关系。当然就是没啥影响了。
1ul，不要说试验人员的加样技术不行，就连枪都不一定过关。唉！厂家建议的50ul，
被鸡贼的PI改成25ul，后来不断改成15，甚至10。做人不能太贪心。

【在 h********n 的大作中提到】

: 在 triplicate里面加1 ul cDNA, 加样误差影响比较大. 如果加1 ul primer, 误差其
: 实没啥影响.
:
: 40%

s*g2010-12-28 08:12

91 楼

that just means u need different gadget to do different things.
ipad/iphone is revolutionary products for me because my kids can start to
use them right away.
using a PC, they need to learn about keyboard, mouse.
using ipad, even a 2 year old can do it.
Apple has a strong quarter again..

表达的意思。
足其中两条就不错了。

【在 b***y 的大作中提到】

: 你们这些人还是要求太低，随便一句啥格式都能放了就满足了。你们都没有领会我想表达的意思。
: 好吧，具体说说，就是一下几条。我敢说现在没有一个Pad能满足以下所有的，能满足其中两条就不错了。
: 格式支持
: 播放效果（特别是高清的视频）
: 存储空间
: 简单的传输方式
: 不需要转换文件（转小，或者转格式）

Z*52010-12-28 08:12

92 楼

听说那个384 well的就是用10ul的反应体系啊。我只用过96 well的，一般都是20ul体
系。

【在 f*********r 的大作中提到】

: cDNA的量直接影响x轴截距，也就是Ct值。当然影响大了。引物只影响平台的高低，跟
: Ct值没有直接关系。当然就是没啥影响了。
: 1ul，不要说试验人员的加样技术不行，就连枪都不一定过关。唉！厂家建议的50ul，
: 被鸡贼的PI改成25ul，后来不断改成15，甚至10。做人不能太贪心。

x*o2010-12-28 08:12

93 楼

airvideo! try it.

【在 b***y 的大作中提到】

: 就是我随便什么视屏文件往上一放都可以放，而且空间大得多。如果iPad的话还要转成
: MP4。特别是一些家庭录像什么的都是照相机或者camcorder拍的，很多都是AVI的格式
: 。盗版的就更不用说了。Nook Color也不行，也要转成它可以硬解的MP4，不然放的很
: 不好。不知道现在其它的Android Tablet能不能达到这种程度
: 说起来iPad类的Tablet确实在很多方面都是对Laptop的downgrade，包括运算能力和存
: 储空间，和易用性（是的，在大部分方面Laptop易用性更好）。提升的方面是体积小，
: 轻便和电池续航能力。Tablet确实在相当一段时间内没有办法取代Laptop，只能是补充
: 。
: ***刚刚丈母娘又问我怎么往iPad上传宝宝视频有感。

M*m2010-12-28 08:12

94 楼

我是引物相同的都先混在同一个1.5 ml管子里，其实也就是俩管子，一个是
housekeeping gene another one is the target gene，然后按模板在分出来，一般
technical control，就是同一个模板3个重复，96 well也就是32个小管，16 each for
the two genes，然后模板加3 ul，但是一般是做4份的量，因为分装第三个总会不够
，所以要多作出来一份。我是10 ul体系，所以就是做40 ul （36 ul master mix+4 ul
template），还有这样你模板不会只加1 ul，相对而言加的量更精确些。不知道说明
白没有。。。【在 Zifeng85 (Zifeng85) 的大作中提到: 】

g*72010-12-28 08:12

95 楼

得, 直接降格到toy for Kids.
跟strong quarter 有嘛关系.

【在 s**g 的大作中提到】

: that just means u need different gadget to do different things.
: ipad/iphone is revolutionary products for me because my kids can start to
: use them right away.
: using a PC, they need to learn about keyboard, mouse.
: using ipad, even a 2 year old can do it.
: Apple has a strong quarter again..
:
: 表达的意思。
: 足其中两条就不错了。

M*m2010-12-28 08:12

96 楼

误差总是存在的，只要最后error bar不是很离谱我觉得都可以接受啊。
另外排枪觉得很不好用，有的时候有几个不能完全加进去，不过确实比一个一个加速度
快很多

扩3

【在 Z**********g 的大作中提到】

: sun姐可能误解了LZ的意思了，LZ是说对于同一模板（比如control的cDNA）,假设要扩3
: 个基因，又假设每个基因3个replica，就是9管，这样先配9倍体积的1X mix,包括
: Mastermix,dye,H2O,cDNA,然后分装成9管，每三管分别加入1个基因的primer；同样对
: treated的cDNA也一样。
: 然后有人说这样就产生了由引物带来的系统误差。我的问题是如果最后加入模板，由
: pipeting所产生的误差叫什么误差？如果由引物带来的系统误差都足够大到不能忽略的
: 话，那么可以想象，由最后一步加入模板所产生的这种误差会大到何等程度。这样反而
: 最后加引物更为准确了。
: 不过如果最后加引物，对于同一模板同一扩增基因的replica而言，似乎就没什么意思
: 了，感觉这种replica目的是要测由所加引物所带来的差别。

S*s2010-12-28 08:12

97 楼

你可以试试OPlayer 目前看来貌似avi,rmvb,wmv等常见格式都支持

【在 b***y 的大作中提到】

: 就是我随便什么视屏文件往上一放都可以放，而且空间大得多。如果iPad的话还要转成
: MP4。特别是一些家庭录像什么的都是照相机或者camcorder拍的，很多都是AVI的格式
: 。盗版的就更不用说了。Nook Color也不行，也要转成它可以硬解的MP4，不然放的很
: 不好。不知道现在其它的Android Tablet能不能达到这种程度
: 说起来iPad类的Tablet确实在很多方面都是对Laptop的downgrade，包括运算能力和存
: 储空间，和易用性（是的，在大部分方面Laptop易用性更好）。提升的方面是体积小，
: 轻便和电池续航能力。Tablet确实在相当一段时间内没有办法取代Laptop，只能是补充
: 。
: ***刚刚丈母娘又问我怎么往iPad上传宝宝视频有感。

M*m2010-12-28 08:12

98 楼

他应该不是指同一管而是同一plate，96的话就是各48，不过我们这里一个老板说还要
做3个no template的，所以其实是各45

【在 Z******5 的大作中提到】

: "在同一个pcr中，同时run两个甚至两个targets，其中一个是control，另外一个是要
: 测的基因"
: 这个用TaqMan貌似是可以，但是我们一般只用SYBR GREEN，一管中不能同时跑两个反应
: 的。

R*d2010-12-28 08:12

99 楼

pad是阉割的电脑，这个还用说吗？
无论是ios还是android目前都不支持flash应用，就这点laptop就是无法替代的。

【在 b***y 的大作中提到】

: 就是我随便什么视屏文件往上一放都可以放，而且空间大得多。如果iPad的话还要转成
: MP4。特别是一些家庭录像什么的都是照相机或者camcorder拍的，很多都是AVI的格式
: 。盗版的就更不用说了。Nook Color也不行，也要转成它可以硬解的MP4，不然放的很
: 不好。不知道现在其它的Android Tablet能不能达到这种程度
: 说起来iPad类的Tablet确实在很多方面都是对Laptop的downgrade，包括运算能力和存
: 储空间，和易用性（是的，在大部分方面Laptop易用性更好）。提升的方面是体积小，
: 轻便和电池续航能力。Tablet确实在相当一段时间内没有办法取代Laptop，只能是补充
: 。
: ***刚刚丈母娘又问我怎么往iPad上传宝宝视频有感。

M*m2010-12-28 08:12

100 楼

我一直作的10，结果也挺不错的啊，为什么说鸡贼？什么叫贪心，产出一样投入少挺好
的，实验室有钱无所谓钱不多就得较劲脑汁省钱。难道你是这些公司的？那么仇视。。
。。

【在 f*********r 的大作中提到】

: cDNA的量直接影响x轴截距，也就是Ct值。当然影响大了。引物只影响平台的高低，跟
: Ct值没有直接关系。当然就是没啥影响了。
: 1ul，不要说试验人员的加样技术不行，就连枪都不一定过关。唉！厂家建议的50ul，
: 被鸡贼的PI改成25ul，后来不断改成15，甚至10。做人不能太贪心。

D*l2010-12-28 08:12

101 楼

ipad 和iphone上用ZumoCast，可以播放任何文件，高清也可以，他在电脑这边实时重新编码在传给ipad或者iphone lol

间。
接受。

【在 b***y 的大作中提到】

: 我不是为了一定要看高清,就是为了一个方便。平时下载的视频大部分是高清的，平时
: 用电脑接电视看，有时也想放在Pad上看，但又不想专门转成Pad能看的格式。没那时间。
: 就算不方便直接拷上去看，就是直接能通过WiFi在Network share上放也行，我也能接受。

j*x2010-12-28 08:12

102 楼

LC480系统上一直用20，后来新来的博后建议改成10，测试了一下效果也还能接受，就是
SD明显大了不少，尤其是实验员负责加样的结果，经常惨不忍睹。后来换成了机器人情况
就好多了。对自己的枪和手比较有信心的话，10ul体系确实没什么问题

【在 M****m 的大作中提到】

: 我一直作的10，结果也挺不错的啊，为什么说鸡贼？什么叫贪心，产出一样投入少挺好
: 的，实验室有钱无所谓钱不多就得较劲脑汁省钱。难道你是这些公司的？那么仇视。。
: 。。

i*e2010-12-28 08:12

103 楼

虽然都是实话，但是这样做比较不靠谱

【在 b***y 的大作中提到】

: 就是我随便什么视屏文件往上一放都可以放，而且空间大得多。如果iPad的话还要转成
: MP4。特别是一些家庭录像什么的都是照相机或者camcorder拍的，很多都是AVI的格式
: 。盗版的就更不用说了。Nook Color也不行，也要转成它可以硬解的MP4，不然放的很
: 不好。不知道现在其它的Android Tablet能不能达到这种程度
: 说起来iPad类的Tablet确实在很多方面都是对Laptop的downgrade，包括运算能力和存
: 储空间，和易用性（是的，在大部分方面Laptop易用性更好）。提升的方面是体积小，
: 轻便和电池续航能力。Tablet确实在相当一段时间内没有办法取代Laptop，只能是补充
: 。
: ***刚刚丈母娘又问我怎么往iPad上传宝宝视频有感。

M*m2010-12-28 08:12

104 楼

赞有钱，还有机器人。。。SE我的还不错，可能如果差别不是特别明显的SE大了会影响
，但是差别大应该没什么问题吧

就是
情况

【在 j****x 的大作中提到】

: LC480系统上一直用20，后来新来的博后建议改成10，测试了一下效果也还能接受，就是
: SD明显大了不少，尤其是实验员负责加样的结果，经常惨不忍睹。后来换成了机器人情况
: 就好多了。对自己的枪和手比较有信心的话，10ul体系确实没什么问题

c*x2010-12-28 08:12

105 楼

笔记本多重

f*52010-12-28 08:12

106 楼

人本来设计个8瓦的东西，你非得用280瓦。。。

便看上面的视频，根本不用拷也不用转。

【在 c*****h 的大作中提到】

: ipad上的话，air video就很好，拿个ipad在床上，wifi连接到台式机、服务器，随便看上面的视频，根本不用拷也不用转。
:
: 间。
: 接受。

c*h2010-12-28 08:12

107 楼

东西是死的，人是活的。又不是非得按照一个方式来用。

人本来设计个8瓦的东西，你非得用280瓦。。。
★ Sent from iPhone App: iReader Mitbbs 6.88 - iPad Lite

【在 f*******5 的大作中提到】

: 人本来设计个8瓦的东西，你非得用280瓦。。。
:
: 便看上面的视频，根本不用拷也不用转。

j*52010-12-28 08:12

108 楼

OPlayer播rmvb的声画不同步问题解决了吗？

【在 A****a 的大作中提到】

: goodplayer
: OPlayerHD
: 基本啥片都能放，rmvb, mkv等等