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转录因子结合位点

转录因子结合位点# Biology - 生物学

j*g2010-12-31 08:12

1 楼

【以下文字转载自 Reunion 讨论区】
发信人: jlong (不经常换), 信区: Reunion
标题: 中信代签失败后要求面签如何预约
发信站: BBS 未名空间站 (Thu Dec 15 23:56:43 2016, 美东)
给了如下网址
http://www.ustraveldocs.com/cn_zh/index.html?firstTime=No
登录进去之后，无法选择面签城市，试着重新开始新的签证申请/预约面谈时间，等到
了缴费这一步，手工输入缴费收据后不能识别，但网上说不用再重新缴费来着，所以很
困惑如何选面签城市。有过来人还望指教，多谢！

y*i2010-12-31 08:12

2 楼

Woody Allen的电影里面是不是没有出现过同性恋的角色？主角或者主要配角。

c*y2010-12-31 08:12

3 楼

3'端的报道好象很少。最近把一段3'段序列连到luciferase 3'端，与相应的转录因子
共同转化细胞，好像还确实影响luciferase 的表达。该怎样分析可能的机制？多谢

C*K2010-12-31 08:12

4 楼

你可能需要打电话给他们，让他们把你的签证费解锁。

P*a2010-12-31 08:12

5 楼

曼哈顿里他老婆梅大妈就出柜的啊

【在 y******i 的大作中提到】

: Woody Allen的电影里面是不是没有出现过同性恋的角色？主角或者主要配角。

d*p2010-12-31 08:12

6 楼

3' UTR contain sequence which can interact with mRNA binding proteins. These
interaction may affect splicing and the mRNA localization.

【在 c***y 的大作中提到】

: 3'端的报道好象很少。最近把一段3'段序列连到luciferase 3'端，与相应的转录因子
: 共同转化细胞，好像还确实影响luciferase 的表达。该怎样分析可能的机制？多谢

B*D2010-12-31 08:12

7 楼

didn't you watch "whatever works"??

【在 y******i 的大作中提到】

: Woody Allen的电影里面是不是没有出现过同性恋的角色？主角或者主要配角。

Z*52010-12-31 08:12

8 楼

应该是增强子吧。不一定要连到luciferase的3'端，很多位置都可以。

p*p2010-12-31 08:12

9 楼

实验和control的DNA constructs具体怎么建的？luciferase assay都有哪些control？
结果怎样？否则不好泛泛而谈。有可能如你所说的转录水平的调控，或者mRNA
processing的。影响mRNA结构/mRNA processing本身也会影响转录。

【在 c***y 的大作中提到】

c*y2010-12-31 08:12

10 楼

转录因子是forkhead family之一, expression construct 来自pCMV (pCMV-TF)。3'-
端序列已测得体外结合这个转录因子，luciferase constructs 来自promega pGL4.12
和 pGL4.24 (pGL4.12-3'DNA and pGL4.24-3'DNA, respectively)。 pGL4.12 无
promoter, pGL4.24有minP 作为promoter。Transfection 的Internal control 是
pGL4.74, HSV-TK-Renilla
control groups: cotransfection of pCMV-TF和pGL4.12; cotransfection of pCMV-
TF和pGL4.24; cotransfection of pGL4.12-3'DNA 和 pCMV; otransfection of pGL4.
24-3'DNA 和 pCMV
结果是：in the presence of minP （pGL4.24系列）,转录因子可以提高luciferase
reading 3-4倍；
还有那些control可以建议以下？多谢。相关的文献推荐以下更好，我自己也在查，只
是越查越觉得这种报道很少，对结论的疑虑也越严重。

【在 p****p 的大作中提到】

: 实验和control的DNA constructs具体怎么建的？luciferase assay都有哪些control？
: 结果怎样？否则不好泛泛而谈。有可能如你所说的转录水平的调控，或者mRNA
: processing的。影响mRNA结构/mRNA processing本身也会影响转录。

j*x2010-12-31 08:12

11 楼

TF binding sequence明确吗？

12
pGL4.

【在 c***y 的大作中提到】

: 转录因子是forkhead family之一, expression construct 来自pCMV (pCMV-TF)。3'-
: 端序列已测得体外结合这个转录因子，luciferase constructs 来自promega pGL4.12
: 和 pGL4.24 (pGL4.12-3'DNA and pGL4.24-3'DNA, respectively)。 pGL4.12 无
: promoter, pGL4.24有minP 作为promoter。Transfection 的Internal control 是
: pGL4.74, HSV-TK-Renilla
: control groups: cotransfection of pCMV-TF和pGL4.12; cotransfection of pCMV-
: TF和pGL4.24; cotransfection of pGL4.12-3'DNA 和 pCMV; otransfection of pGL4.
: 24-3'DNA 和 pCMV
: 结果是：in the presence of minP （pGL4.24系列）,转录因子可以提高luciferase
: reading 3-4倍；

c*y2010-12-31 08:12

12 楼

in vitro 实验鉴定了一个 consensus sequence
这里的3'端序列恰巧是含有这个consensus sequence的

【在 j****x 的大作中提到】

: TF binding sequence明确吗？
:
: 12
: pGL4.

c*y2010-12-31 08:12

13 楼

需要补充的是，在类外的物种中，这个consensus sequence 主要位于5' 位点 (ChiP
数据)；换了我的，都跑到intron 或 3' 端了（ in vitro genomic selection）.
test这个3'端的,是觉得构建luciferase construct的思路清晰些

【在 c***y 的大作中提到】

: in vitro 实验鉴定了一个 consensus sequence
: 这里的3'端序列恰巧是含有这个consensus sequence的

p*p2010-12-31 08:12

14 楼

我的建议是再做一个pGL4.24-3'DNA的mutant construct，reshuffle 3'DNA片段中这个
TF的putative binding site。用这个mutant construct来代替你的pCMV-TF和pGL4.24
cotransfection中的pGL4.24。理由还是3'DNA插入到pGL4.24会影响mRNA的结构从而影
响level，所以我觉得用pGL4.24本身做pGL4.24-3'DNA的negative control不合适。

12
paCMV-
pGL4.

【在 c***y 的大作中提到】

p*p2010-12-31 08:12

15 楼

由于TF的结合位点consensus都很短，in vitro selection很容易出假阳性。可以考虑
用chip-seq来做in vivo的。

【在 c***y 的大作中提到】

: 需要补充的是，在类外的物种中，这个consensus sequence 主要位于5' 位点 (ChiP
: 数据)；换了我的，都跑到intron 或 3' 端了（ in vitro genomic selection）.
: test这个3'端的,是觉得构建luciferase construct的思路清晰些

c*y2010-12-31 08:12

16 楼

谢谢回复。能详细讲一下reshuffle的具体设计方案吗？你是担心任何3'端的插入片断
都会影响luciferase level?
我其实test 了3个不同的in vitro selection products ( 序列完全不同，但长度在
100-200bp), luciferase reading （after normalized with against Renilla
reading）分别是：0.6, 1.35, 1.1 (control reading 是0.39)

24

【在 p****p 的大作中提到】

: 我的建议是再做一个pGL4.24-3'DNA的mutant construct，reshuffle 3'DNA片段中这个
: TF的putative binding site。用这个mutant construct来代替你的pCMV-TF和pGL4.24
: cotransfection中的pGL4.24。理由还是3'DNA插入到pGL4.24会影响mRNA的结构从而影
: 响level，所以我觉得用pGL4.24本身做pGL4.24-3'DNA的negative control不合适。
:
: 12
: paCMV-
: pGL4.

c*y2010-12-31 08:12

17 楼

最初设计实验时的确在chip-seq 和 in vitro 之间犹豫过。主要是觉得Chip可能会
fish一些co-factor 的binding 序列。后来选择了 in vitro genomic selection,虽然
是in vitro,不过觉得有genomic background，目的还是obtain a small but
significant sequence group; 出乎意料的是 location, 没有5'端或first intron 的

【在 p****p 的大作中提到】

: 由于TF的结合位点consensus都很短，in vitro selection很容易出假阳性。可以考虑
: 用chip-seq来做in vivo的。

p*p2010-12-31 08:12

18 楼

如果3’DNA插入到luciferase的polyA signal之前，我想影响mRNA稳定性、processing
的可能性就大多了。
我说reshuffle的意思就是把consensus里面的几个Nt混一混，倒一倒，最终目的就是破
坏consensus但不影响长度。

【在 c***y 的大作中提到】

: 谢谢回复。能详细讲一下reshuffle的具体设计方案吗？你是担心任何3'端的插入片断
: 都会影响luciferase level?
: 我其实test 了3个不同的in vitro selection products ( 序列完全不同，但长度在
: 100-200bp), luciferase reading （after normalized with against Renilla
: reading）分别是：0.6, 1.35, 1.1 (control reading 是0.39)
:
: 24

c*y2010-12-31 08:12

19 楼

又做了一些实验，有了新的结果，所以想再听听意见。
鉴于有些cis-regulatory elements是多个基因共享的，所以同时检测了一下它在
luciferase 5'end 的效应。结果是，无论它在5'end 还是3'end, 都增强luciferase的
表达。
由于这个片段(长约250bp)含有转录因子的consensus(8bp)序列，所以做了个deletion
突变，去掉这个consensus序列。再去检测luciferase的活性，发现如果片段位于
luciferase 5'end, 突变后luciferase活性降低到只有原来的 20%；这应该是个好结果
，因为证明了5'end端的增强基因表达作用确实是由转录因子介导的。
奇怪的是，如果片段位于luciferase 3'end, 突变好像对luciferase的活性没影响。
该怎样这样的矛盾结果？

processing

【在 p****p 的大作中提到】

: 如果3’DNA插入到luciferase的polyA signal之前，我想影响mRNA稳定性、processing
: 的可能性就大多了。
: 我说reshuffle的意思就是把consensus里面的几个Nt混一混，倒一倒，最终目的就是破
: 坏consensus但不影响长度。

c*y2010-12-31 08:12

20 楼

没人能给点思路吗？

【在 c***y 的大作中提到】