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求教: 谁做过biotin-DNA pull down 没?
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求教: 谁做过biotin-DNA pull down 没?# Biology - 生物学
j*n
1
这个星座也是非常另类,需要长期研究才能搞懂
1. 处处们说自己的前任BF/GF
表意:我很烦这个人/我恨死ta了/我很讨厌ta
本意:我曾经为ta纠结了很久很久(如果说的时候还是很激动证明还在纠结)
表意:我对这个人已经没有感觉了,没必要再提ta了
本意:和ta恋爱我伤的不轻,为了不再痛苦我决定不再承认这个人在我心里的价值(其
实还是有些不甘)
表意:XX人还是不错的,ta很爱我/我挺喜欢ta的
本意:但是我不爱ta,因为ta不是能让我为之疯狂的类型
2. 处处们说自己的现任BF/GF(平时)
表意:XX这个人这不好、那不好……(XX是处处的同性朋友)
本意:你最好少和XX接触,我吃醋,我怕ta把你从我身边抢走。
表意:ta是谁?(你跟处处提到你的一个普通的异性朋友)
本意:你和ta到底是什么关系?(这种时候一定要自发的澄清你和那位朋友的关系,不
然处处虽然嘴上不会说什么但心里会充分发挥悲观的想象力……)
表意:我不喜欢你穿那么暴露的衣服。
本意:我只是不喜欢你在外面暴露,和我单独在一起的时候欢迎暴露。
表意:你干嘛打扮得这么靓(帅)?or 把这头像换了,太难看了。
本意:除了我以外你还想勾引谁?这头像太招人喜欢了,不许用。
另:处处们对自己的另一半在校内、开心之类的网站上和异性交流(如买卖好友)相当
敏感(虽然他们不明说)。普通人开个玩笑的话,处处看在眼里就会觉得你们两个之间
一定有什么不能说的秘密。所以奉劝各位GGMM尽量少在上面和异性交流,更不要有一丁
点儿的暧昧。
3. 处处们说自己的现任BF/GF(闹别扭、吵架、冷战、处处低潮期)
表意:随你便吧,跟我没关系。
本意:我已经把我的想法说了,你要是不按我说的做我就一直不鸟你。
表意:你走吧,我不想再见到你。
本意:为了防止你最终因为受不了我而离开我,为了维护我的尊严和自我,这句话我要
先说出来,但你不要真的因此就不联系我了。
表意:对我来说你什么也不是。
本意:你让我痛苦,虽然没有你我会更痛苦。
4. 分手一段时间以后,处处们对前任BF/GF说(处处主动联系)
表意:你还好吗?
本意:我想你了。
表意:有时间见一面吗?
本意:我们还有机会吗?
表意:生日快乐 or 节日快乐
本意:希望你还想着我
5. 分手一段时间以后,处处们对前任BF/GF说(前任主动联系)
表意:你能不能别烦我?我不想和你再联系。(or 表现得很冷漠、说话小心翼翼)
本意:我还对你有感觉,但我怕自己再受伤,不要勾引我……
表意:我很好啊,你怎么样?
本意:我还对你有好感,但可能只能做朋友。
表意:无限的沉默…… or 根本无法与ta取得联系……
本意:如果不是现实原因,不是处处被伤得太重就是根本没感觉了。近期是没有挽回的
希望了。
-----------------------------------------------
以上是我个人对部分处处的总结,不代表所有的处处。
内容仅供参考,具体情况还要具体分析。
欢迎各位补充。

81人推荐 推荐
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s*m
2
求号码和链接。。。
非常感谢,郁闷死了,俺upgrade的还是4不是4s!!!
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z*y
3
某天突然就不行了,以前也发生过,不过过几天又好了。这回过来大概半个月了,还是
连不上。
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n*g
4
本人没有这方面的经验,有没有好的建议和protocol呢?
比如,DNA大小?
O(∩_∩)O谢谢
avatar
n*c
5
I got this from my order status. Try this number.
The items in your order are not in stock. We have placed an order, and your
estimated shipment date is as indicated. For more information on your order,
please call us at 1-866-391-0749
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z*b
6
我的从来没出过这样的问题。
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n*g
7
谁帮帮忙啊,谢谢
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w*s
8
成功了麻烦回复一下 谢谢!

【在 s*******m 的大作中提到】
: 求号码和链接。。。
: 非常感谢,郁闷死了,俺upgrade的还是4不是4s!!!

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s*l
9
primer合成时加biotin,一般可以到80nt,DNA大小限制应该不大,几kb应该都能
pulldown下来的

【在 n***g 的大作中提到】
: 本人没有这方面的经验,有没有好的建议和protocol呢?
: 比如,DNA大小?
: O(∩_∩)O谢谢

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P*n
10
我等拿到电话激活的时候再去跟att交涉,另外我是从公司的premier买的,应该是免
activation的,这个18刀据说就算是activation?
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s*s
11
没看懂。你想用啥pull啥?用DNA probe去pull其他东西?

【在 n***g 的大作中提到】
: 本人没有这方面的经验,有没有好的建议和protocol呢?
: 比如,DNA大小?
: O(∩_∩)O谢谢

avatar
w*s
12
我打了800-331-0500 就是att新开手机给的账单右下角的号码
cs给了我$18 credit,等同于免了activation fee
更新一下 各位也可以试试
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o*4
13
20bp的DNA可以么?

【在 s****l 的大作中提到】
: primer合成时加biotin,一般可以到80nt,DNA大小限制应该不大,几kb应该都能
: pulldown下来的

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s*d
14
新用户呢,我两部一共72刀啊,有什么方法可以免掉吗?
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o*4
15
用DNA可以pull down 跟它结合的蛋白质么?

【在 s******s 的大作中提到】
: 没看懂。你想用啥pull啥?用DNA probe去pull其他东西?
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T*t
16
就像3楼所说,biotin可以在合成引物的时候直接label在5'端。正常的引物长度都可以
,也不贵。需要更长的片段可以用label好的引物去跑个PCR,和普通PCR的条件是一样
的。跑完PCR之后,用streptavidin beads可以直接把带biotin label的片段和其他片
段分开。
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s*s
17
当然啦

【在 o**4 的大作中提到】
: 用DNA可以pull down 跟它结合的蛋白质么?
avatar
s*s
18
你到底是用DNA pull啥?只要DNA,多长都可以,不过毫无意义。
要pull蛋白,20bp估计太小了吧?要pull其他的DNA,20bp不够
牢,一般用LNA,PNA一类的

【在 o**4 的大作中提到】
: 20bp的DNA可以么?
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s*s
19
一般比较段的就用引物了,比较长的,尤其要求结合比较牢的,可以
nick translation

【在 T**********t 的大作中提到】
: 就像3楼所说,biotin可以在合成引物的时候直接label在5'端。正常的引物长度都可以
: ,也不贵。需要更长的片段可以用label好的引物去跑个PCR,和普通PCR的条件是一样
: 的。跑完PCR之后,用streptavidin beads可以直接把带biotin label的片段和其他片
: 段分开。

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o*4
20
O(∩_∩)O谢谢,就是不知道用多长的DNA做pull down合适。 20bp是不是太小了?

【在 T**********t 的大作中提到】
: 就像3楼所说,biotin可以在合成引物的时候直接label在5'端。正常的引物长度都可以
: ,也不贵。需要更长的片段可以用label好的引物去跑个PCR,和普通PCR的条件是一样
: 的。跑完PCR之后,用streptavidin beads可以直接把带biotin label的片段和其他片
: 段分开。

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o*4
21
用DNA pull蛋白质

【在 s******s 的大作中提到】
: 你到底是用DNA pull啥?只要DNA,多长都可以,不过毫无意义。
: 要pull蛋白,20bp估计太小了吧?要pull其他的DNA,20bp不够
: 牢,一般用LNA,PNA一类的

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o*4
22

~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~这个怎么做啊?引物最长能合成多长啊?

【在 s******s 的大作中提到】
: 一般比较段的就用引物了,比较长的,尤其要求结合比较牢的,可以
: nick translation

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W*C
23

20bp不小  很多都是用这么大的  完全可以包括binding sites

【在 s******s 的大作中提到】
: 你到底是用DNA pull啥?只要DNA,多长都可以,不过毫无意义。
: 要pull蛋白,20bp估计太小了吧?要pull其他的DNA,20bp不够
: 牢,一般用LNA,PNA一类的

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o*4
24
能不能帮忙弄到一篇参考文献啊?
O(∩_∩)O谢谢

【在 W****C 的大作中提到】
:
: 20bp不小  很多都是用这么大的  完全可以包括binding sites

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T*t
25
你和nanog是分身啊?
Analysis of Protein-DNA Binding by Streptavidin-Agarose Pulldown
Kenneth K. Wu
Gene Mapping, Discovery, and Expression
Methods in Molecular Biology, 2006, Volume 338, 281-290, DOI: 10.1385/1-
59745-097-9:281
http://www.springerlink.com/content/j274505582u54474/fulltext.p

【在 o**4 的大作中提到】
: 能不能帮忙弄到一篇参考文献啊?
: O(∩_∩)O谢谢

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o*4
26
太感谢了啊,
我这有个enhancer,只有20bp,
你说我是用这个20bp去拉蛋白呢?还是用更长的DNA去拉蛋白比较好呢?
另外,多长最合适呢?
O(∩_∩)O谢谢

【在 T**********t 的大作中提到】
: 你和nanog是分身啊?
: Analysis of Protein-DNA Binding by Streptavidin-Agarose Pulldown
: Kenneth K. Wu
: Gene Mapping, Discovery, and Expression
: Methods in Molecular Biology, 2006, Volume 338, 281-290, DOI: 10.1385/1-
: 59745-097-9:281
: http://www.springerlink.com/content/j274505582u54474/fulltext.p

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s*s
27
要有六七个bp浪费在linker上吧

【在 W****C 的大作中提到】
:
: 20bp不小  很多都是用这么大的  完全可以包括binding sites

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s*s
28
这个是长的probe,普通的PCR产物或者plasmid, 用DNaseI随机切出nick,
然后用klenow还是啥重新合成片段掺入biotin。长度大概200bp-500bp,
取决于反应时间,时间越长,DNaseI的nick越多,片段越短

【在 o**4 的大作中提到】
: 太感谢了啊,
: 我这有个enhancer,只有20bp,
: 你说我是用这个20bp去拉蛋白呢?还是用更长的DNA去拉蛋白比较好呢?
: 另外,多长最合适呢?
: O(∩_∩)O谢谢

avatar
s*s
29
btw, 这个roche有mix, 酶/buffer/dNTP/biotin-dCTP啥的都混在一起,
加到DNA里面温浴一下就好了。

【在 s******s 的大作中提到】
: 这个是长的probe,普通的PCR产物或者plasmid, 用DNaseI随机切出nick,
: 然后用klenow还是啥重新合成片段掺入biotin。长度大概200bp-500bp,
: 取决于反应时间,时间越长,DNaseI的nick越多,片段越短

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T*t
30
其实我自己没做过pull down。。。说错了的话,谢绝追杀。
如果你知道你的binding motif是什么序列,在它前面加5-10bp的linker一般就够了吧
我觉得。不过要先用mfold或者类似的软件看一下你加的linker不会影响到你需要的那
个binding motif的二级结构。

【在 o**4 的大作中提到】
: 太感谢了啊,
: 我这有个enhancer,只有20bp,
: 你说我是用这个20bp去拉蛋白呢?还是用更长的DNA去拉蛋白比较好呢?
: 另外,多长最合适呢?
: O(∩_∩)O谢谢

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o*4
31
哦,这个挺好的,也许我要用到

【在 s******s 的大作中提到】
: btw, 这个roche有mix, 酶/buffer/dNTP/biotin-dCTP啥的都混在一起,
: 加到DNA里面温浴一下就好了。

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o*4
32
那我就从基因组上enhancer的两边多扩增一些出来就行了吧?
比如100bp怎么样?
另外,使用单链DNA做pull down好?还是应该用双链呢?
O(∩_∩)O谢谢

【在 T**********t 的大作中提到】
: 其实我自己没做过pull down。。。说错了的话,谢绝追杀。
: 如果你知道你的binding motif是什么序列,在它前面加5-10bp的linker一般就够了吧
: 我觉得。不过要先用mfold或者类似的软件看一下你加的linker不会影响到你需要的那
: 个binding motif的二级结构。

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T*t
33
越长未必越好。我觉得还是从短片段开始做起,pull down效果如果不好再用长片段吧。
至于是单链还是双链,得看你打算pull down的蛋白是结合单链还是双链了。

【在 o**4 的大作中提到】
: 那我就从基因组上enhancer的两边多扩增一些出来就行了吧?
: 比如100bp怎么样?
: 另外,使用单链DNA做pull down好?还是应该用双链呢?
: O(∩_∩)O谢谢

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o*4
34
那还是用双链?这个更加接近in vivo吧
“越长未必越好”,怎么说啊?

吧。

【在 T**********t 的大作中提到】
: 越长未必越好。我觉得还是从短片段开始做起,pull down效果如果不好再用长片段吧。
: 至于是单链还是双链,得看你打算pull down的蛋白是结合单链还是双链了。

avatar
T*t
35
你不是要pull down跟那个enhancer特异结合的蛋白么?你的oligo越长,结构就越复杂
,最后pull down下来一堆别的东西怎么办?

【在 o**4 的大作中提到】
: 那还是用双链?这个更加接近in vivo吧
: “越长未必越好”,怎么说啊?
:
: 吧。

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o*4
36
做mutant啊,

【在 T**********t 的大作中提到】
: 你不是要pull down跟那个enhancer特异结合的蛋白么?你的oligo越长,结构就越复杂
: ,最后pull down下来一堆别的东西怎么办?

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T*t
37
哦。
那短片段也可以做Mutant啊。短片段可以直接合成,不是容易点么。你要直接上100bp
的也没啥就是了。我说过我没做过pull down,所以就是纸上谈兵而已。

【在 o**4 的大作中提到】
: 做mutant啊,
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W*C
38

不用100吧  越长不是越容易有2级结构。 我做NFKB的 就用20多个

【在 o**4 的大作中提到】
: 那我就从基因组上enhancer的两边多扩增一些出来就行了吧?
: 比如100bp怎么样?
: 另外,使用单链DNA做pull down好?还是应该用双链呢?
: O(∩_∩)O谢谢

avatar
W*C
39

一般都是双链吧 可以直接定双链的, 比较贵, 或者自己定两个互补单链的, 然
后做成双链

【在 o**4 的大作中提到】
: 那还是用双链?这个更加接近in vivo吧
: “越长未必越好”,怎么说啊?
:
: 吧。

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o*4
40
能拉下多少蛋白?

【在 W****C 的大作中提到】
:
: 一般都是双链吧 可以直接定双链的, 比较贵, 或者自己定两个互补单链的, 然
: 后做成双链

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o*4
41
好的,
请问你用的protoco是啥 啊?
你在哪个公司定的biotin的引物啊?
能拉下超过20种的蛋白么?
除了western检测外,能不能用MS?

【在 W****C 的大作中提到】
:
: 一般都是双链吧 可以直接定双链的, 比较贵, 或者自己定两个互补单链的, 然
: 后做成双链

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