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原核表达蛋白的毒性问题
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原核表达蛋白的毒性问题# Biology - 生物学
H*s
1
现在在尝试用原核系统(E.coli)表达一个病毒蛋白(400aa),T7 promoter,BL21(DE3
) host。现在遇到了一个难题,这个基因怎么也克隆不到原核表达载体里去。转化后有
colonies,但是小提质粒后发现没有插入片段。
首先排除的是克隆问题,同样的片段,同样的酶切位点,使用完全同样的试剂,该基因
很容易就克隆到真核表达载体里去。
尝试了cytoplasm表达载体,periplasm表达载体,和不同的宿主菌,都是同样的结果。
(原核表达老手了,头一次遇到这种情况)。
是不是此蛋白毒性太大,即使是一点点的leaky expression都不行?
我现在在想的试验是:(1)做一个这个基因的文库,来看看到底是哪部分有毒性;(2
)使用GroES的leader peptide试试看。
各位有没有什么建议?谢谢。
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e*s
2
感觉还是不能排除是克隆的问题。
载体不同,Ligation效率会差别很大。
要是没试过的话,可以试试看从那个真核载体里切出来,再克隆到原核载体里去。比
PCR片段直接克隆容易些。
你说的毒性问题,我个人认为可能性很小。可能我做的比较少,还没遇见过这样的情况。

DE3
(2

【在 H****s 的大作中提到】
: 现在在尝试用原核系统(E.coli)表达一个病毒蛋白(400aa),T7 promoter,BL21(DE3
: ) host。现在遇到了一个难题,这个基因怎么也克隆不到原核表达载体里去。转化后有
: colonies,但是小提质粒后发现没有插入片段。
: 首先排除的是克隆问题,同样的片段,同样的酶切位点,使用完全同样的试剂,该基因
: 很容易就克隆到真核表达载体里去。
: 尝试了cytoplasm表达载体,periplasm表达载体,和不同的宿主菌,都是同样的结果。
: (原核表达老手了,头一次遇到这种情况)。
: 是不是此蛋白毒性太大,即使是一点点的leaky expression都不行?
: 我现在在想的试验是:(1)做一个这个基因的文库,来看看到底是哪部分有毒性;(2
: )使用GroES的leader peptide试试看。

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m*z
3
用BL21做克隆?不太可行吧?克隆应该还是在DH5a等类似的里面。在这些e.coli里面没
有leaky expression的问题,只有BL21才有这个问题吧

DE3
(2

【在 H****s 的大作中提到】
: 现在在尝试用原核系统(E.coli)表达一个病毒蛋白(400aa),T7 promoter,BL21(DE3
: ) host。现在遇到了一个难题,这个基因怎么也克隆不到原核表达载体里去。转化后有
: colonies,但是小提质粒后发现没有插入片段。
: 首先排除的是克隆问题,同样的片段,同样的酶切位点,使用完全同样的试剂,该基因
: 很容易就克隆到真核表达载体里去。
: 尝试了cytoplasm表达载体,periplasm表达载体,和不同的宿主菌,都是同样的结果。
: (原核表达老手了,头一次遇到这种情况)。
: 是不是此蛋白毒性太大,即使是一点点的leaky expression都不行?
: 我现在在想的试验是:(1)做一个这个基因的文库,来看看到底是哪部分有毒性;(2
: )使用GroES的leader peptide试试看。

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r*e
4
我感觉好像也是克隆的问题 , 不觉得leak expression 能这么厉害
原因可能是你的原核载体酶切处理得不好
你当然可以试试DH5a. ^^

DE3
(2

【在 H****s 的大作中提到】
: 现在在尝试用原核系统(E.coli)表达一个病毒蛋白(400aa),T7 promoter,BL21(DE3
: ) host。现在遇到了一个难题,这个基因怎么也克隆不到原核表达载体里去。转化后有
: colonies,但是小提质粒后发现没有插入片段。
: 首先排除的是克隆问题,同样的片段,同样的酶切位点,使用完全同样的试剂,该基因
: 很容易就克隆到真核表达载体里去。
: 尝试了cytoplasm表达载体,periplasm表达载体,和不同的宿主菌,都是同样的结果。
: (原核表达老手了,头一次遇到这种情况)。
: 是不是此蛋白毒性太大,即使是一点点的leaky expression都不行?
: 我现在在想的试验是:(1)做一个这个基因的文库,来看看到底是哪部分有毒性;(2
: )使用GroES的leader peptide试试看。

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Z*5
5
同意楼上,试试DH5a, TOP10等菌株。 过了这一步才能确认是不是对细菌有毒性。
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H*s
6
I have tried DH5a/Top10/XL-1blue and it did not work neither.
I am very sure that there is no problem with my cut vector because I used it
to do library of huge size and never got any problem. I routinely use this
vector and same restriction sites for library cloning and never failed.
To make sure it is not cloning problem, I also did another control ligation.
Using the same materials, I ligated GFP fragment into the vector and got
tons of green colonies after induction. From the GFP control experiment, I
know that my vector is clean cut.
Any suggestions?

【在 Z******5 的大作中提到】
: 同意楼上,试试DH5a, TOP10等菌株。 过了这一步才能确认是不是对细菌有毒性。
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m*z
7
you vector is clean cut, but what about your insert? In these strains, there
shouldn't be any leaky expression...

it
this
ligation.

【在 H****s 的大作中提到】
: I have tried DH5a/Top10/XL-1blue and it did not work neither.
: I am very sure that there is no problem with my cut vector because I used it
: to do library of huge size and never got any problem. I routinely use this
: vector and same restriction sites for library cloning and never failed.
: To make sure it is not cloning problem, I also did another control ligation.
: Using the same materials, I ligated GFP fragment into the vector and got
: tons of green colonies after induction. From the GFP control experiment, I
: know that my vector is clean cut.
: Any suggestions?

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H*s
8
I cloned the same insert into mammalian expression vector (same restriction
sites) and did not get a problem, which indicates the insert is clean cut
too. In addition, the quality of insert was check by agarose gel
electrophoresis.

there

【在 m**z 的大作中提到】
: you vector is clean cut, but what about your insert? In these strains, there
: shouldn't be any leaky expression...
:
: it
: this
: ligation.

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C*N
9
载体的酶切位点是否是甲基化敏感的?建议在dam-的E coli里提载体,再酶切,连接。

DE3
(2

【在 H****s 的大作中提到】
: 现在在尝试用原核系统(E.coli)表达一个病毒蛋白(400aa),T7 promoter,BL21(DE3
: ) host。现在遇到了一个难题,这个基因怎么也克隆不到原核表达载体里去。转化后有
: colonies,但是小提质粒后发现没有插入片段。
: 首先排除的是克隆问题,同样的片段,同样的酶切位点,使用完全同样的试剂,该基因
: 很容易就克隆到真核表达载体里去。
: 尝试了cytoplasm表达载体,periplasm表达载体,和不同的宿主菌,都是同样的结果。
: (原核表达老手了,头一次遇到这种情况)。
: 是不是此蛋白毒性太大,即使是一点点的leaky expression都不行?
: 我现在在想的试验是:(1)做一个这个基因的文库,来看看到底是哪部分有毒性;(2
: )使用GroES的leader peptide试试看。

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g*y
10
克隆是不能用bl21(de3)的。这个菌株有end3基因表达, 你用来测序的miniprep DNA很
容易被这个酶降解。推荐卖
bl21(DE3)gold. 这个菌株end3已经knock out了。

DE3
(2

【在 H****s 的大作中提到】
: 现在在尝试用原核系统(E.coli)表达一个病毒蛋白(400aa),T7 promoter,BL21(DE3
: ) host。现在遇到了一个难题,这个基因怎么也克隆不到原核表达载体里去。转化后有
: colonies,但是小提质粒后发现没有插入片段。
: 首先排除的是克隆问题,同样的片段,同样的酶切位点,使用完全同样的试剂,该基因
: 很容易就克隆到真核表达载体里去。
: 尝试了cytoplasm表达载体,periplasm表达载体,和不同的宿主菌,都是同样的结果。
: (原核表达老手了,头一次遇到这种情况)。
: 是不是此蛋白毒性太大,即使是一点点的leaky expression都不行?
: 我现在在想的试验是:(1)做一个这个基因的文库,来看看到底是哪部分有毒性;(2
: )使用GroES的leader peptide试试看。

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Z*5
11
你用的啥载体啊? 比如PET有几个常用的载体,比如28a,30a,32a等,都试试。 或者
比如你用32a,可以先试试连到32b,32c里面,然后做亚克隆。
乱说的。 尝试一下也无妨。
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Z*5
12
"比如你用32a,可以先试试连到32b,32c里面,然后做亚克隆。"
这个实验应该可以确认到底是不是leaky expression导致的了。
应该做一下
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s*n
13
你可以试试pETcoco载体;实在不行就换其他的promoter,比如如pBAD。
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s*s
14
如果毒性这么强,克隆的片段应该是一个酶吧?做几个突变试试? 我以前碰到过毒性
蛋白,但和你的情况不一样,我是诱导之后宿主马上不生长,各种低温条件都试过。

DE3
(2

【在 H****s 的大作中提到】
: 现在在尝试用原核系统(E.coli)表达一个病毒蛋白(400aa),T7 promoter,BL21(DE3
: ) host。现在遇到了一个难题,这个基因怎么也克隆不到原核表达载体里去。转化后有
: colonies,但是小提质粒后发现没有插入片段。
: 首先排除的是克隆问题,同样的片段,同样的酶切位点,使用完全同样的试剂,该基因
: 很容易就克隆到真核表达载体里去。
: 尝试了cytoplasm表达载体,periplasm表达载体,和不同的宿主菌,都是同样的结果。
: (原核表达老手了,头一次遇到这种情况)。
: 是不是此蛋白毒性太大,即使是一点点的leaky expression都不行?
: 我现在在想的试验是:(1)做一个这个基因的文库,来看看到底是哪部分有毒性;(2
: )使用GroES的leader peptide试试看。

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h*8
15
猛男,你先用TOP10搞清楚质粒,再去BL21表达蛋白

DE3
(2

【在 H****s 的大作中提到】
: 现在在尝试用原核系统(E.coli)表达一个病毒蛋白(400aa),T7 promoter,BL21(DE3
: ) host。现在遇到了一个难题,这个基因怎么也克隆不到原核表达载体里去。转化后有
: colonies,但是小提质粒后发现没有插入片段。
: 首先排除的是克隆问题,同样的片段,同样的酶切位点,使用完全同样的试剂,该基因
: 很容易就克隆到真核表达载体里去。
: 尝试了cytoplasm表达载体,periplasm表达载体,和不同的宿主菌,都是同样的结果。
: (原核表达老手了,头一次遇到这种情况)。
: 是不是此蛋白毒性太大,即使是一点点的leaky expression都不行?
: 我现在在想的试验是:(1)做一个这个基因的文库,来看看到底是哪部分有毒性;(2
: )使用GroES的leader peptide试试看。

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n*w
16
我最近也被蛋白表达的问题困扰着。
我设计了一个质粒,想表达一个fusion转录因子。但是从sds-page上来看,没有
overexpression的迹象,但是做wb,用该转录因子的抗体可以看到条带,虽然不多。用
gst, thrombin以后发现gst beads连上的是一个很小的片段,也就是说,表达的蛋白被
chop了,即使bl21是protease deficient的。。。
现在都不知道怎么办,应该用病毒表达这种full-length的?
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m*5
17
该转录因子多大,你试过哪些质粒
常用质粒都轮一遍,常常就能出奇迹
还有,试过不一样的培养基么

【在 n***w 的大作中提到】
: 我最近也被蛋白表达的问题困扰着。
: 我设计了一个质粒,想表达一个fusion转录因子。但是从sds-page上来看,没有
: overexpression的迹象,但是做wb,用该转录因子的抗体可以看到条带,虽然不多。用
: gst, thrombin以后发现gst beads连上的是一个很小的片段,也就是说,表达的蛋白被
: chop了,即使bl21是protease deficient的。。。
: 现在都不知道怎么办,应该用病毒表达这种full-length的?

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n*w
18
嘿,是你。
转录因子,连上fusion的部分,就2.4kb。
我就连在了pGEX-2T系列上,因为要做表达用,当然还用过TA vector。。。
培养基一开始用LB,后来照manual里用了YTA,其实和LB差不多。。。
我大概知道是什么原因了,我想换真核表达系统试试。。。
谢谢。

【在 m******5 的大作中提到】
: 该转录因子多大,你试过哪些质粒
: 常用质粒都轮一遍,常常就能出奇迹
: 还有,试过不一样的培养基么

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m*5
19
该转录因子多大,你试过哪些质粒
常用质粒都轮一遍,常常就能出奇迹
还有,试过不一样的培养基么

【在 n***w 的大作中提到】
: 我最近也被蛋白表达的问题困扰着。
: 我设计了一个质粒,想表达一个fusion转录因子。但是从sds-page上来看,没有
: overexpression的迹象,但是做wb,用该转录因子的抗体可以看到条带,虽然不多。用
: gst, thrombin以后发现gst beads连上的是一个很小的片段,也就是说,表达的蛋白被
: chop了,即使bl21是protease deficient的。。。
: 现在都不知道怎么办,应该用病毒表达这种full-length的?

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m*5
20
2.4 kb够大的了 …………
很多pGEX不work的东西放到pet28a里work得很好
另外,你如果能拿到主带只是很少的话建议全程低温(18c)

【在 n***w 的大作中提到】
: 嘿,是你。
: 转录因子,连上fusion的部分,就2.4kb。
: 我就连在了pGEX-2T系列上,因为要做表达用,当然还用过TA vector。。。
: 培养基一开始用LB,后来照manual里用了YTA,其实和LB差不多。。。
: 我大概知道是什么原因了,我想换真核表达系统试试。。。
: 谢谢。

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n*w
21
嗯。我用的是22度。。。

【在 m******5 的大作中提到】
: 2.4 kb够大的了 …………
: 很多pGEX不work的东西放到pet28a里work得很好
: 另外,你如果能拿到主带只是很少的话建议全程低温(18c)

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w*t
22
我遇到过好几次用Ecoli表达真核蛋白都是truncation,
应该是codon bias的问题,用Rossetta能好一些。
或者换insect cell。
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n*w
23
can you recommend some companies?
Thank you.

【在 w**t 的大作中提到】
: 我遇到过好几次用Ecoli表达真核蛋白都是truncation,
: 应该是codon bias的问题,用Rossetta能好一些。
: 或者换insect cell。

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h*8
24
你的问题我遇到过,几乎一模一样。
用的rossetta, 换了个培养基2yt,温度降到20度, iptg 降到0.2, ok 了。

【在 n***w 的大作中提到】
: 嗯。我用的是22度。。。
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