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“简单”的细胞（293T）实验的问题

“简单”的细胞（293T）实验的问题# Biology - 生物学

g*n2011-01-31 08:01

1 楼

【以下文字转载自 LosAngeles 讨论区】
发信人: gilljin (鱼鳃), 信区: LosAngeles
标题: H1B签证的问题
发信站: BBS 未名空间站 (Mon Nov 30 20:13:56 2009, 美东)
各位前辈大家好。
1.听说h1b现在名额还剩下1600个了，是真的吗？
2.如果在4月1日之前找到工作然后公司帮忙弄好材料递交上去等着抽签，是这样的吗，
现在还没有工作是不是已经太晚了？ opt今年6月份开始的。。。
3.祝大家心情好。
4.谢谢

i*t2011-01-31 08:01

2 楼

我想问一下
新公司是否会联系当前公司？
我的意思是说从A到B 中间。B给了offer，可能会做调查啥的 A是否会知道啊
主要是A是小公司如果大公司也就无所谓了
如果A会知道的话，那我去哪里根本不能保密啊
谁懂这方便的求教啊！

k*g2011-01-31 08:01

3 楼

apple店里有带回国直接可以用的裸机了么？想给国内的家里人带，同时求价格，先谢
啦~

f*g2011-01-31 08:01

4 楼

最近在养293T cells, 转染或者未转染的293T细胞放在FASC buffer (PBS+5% FBS）中
，然后在室温或者ice上放置两到三个小时，用7-AAD染色，发现60%的细胞都是 7-AAD+ （做 FACS的时候离 trypsinization差不多5-6小时吧）。刚刚trypsinized的细胞，然后立即作FACS， 7-AAD+的细胞比例很低，只有1-2%左右吧。
请问这种情况正常么？
我看到有的paper上， 293T细胞在室温或者冰上放置16个小时，然后用相应的抗体染色
，然后FACS 分析。这种情况难道所有的293T 细胞不会全部死掉么？如果细胞都死了
，应该都会被染色吧？
高手来分析一下吧？谢谢！

i*t2011-01-31 08:01

5 楼

真心求问啊！
多谢指点！

S*s2011-01-31 08:01

6 楼

你是不是检查一下你的 FACS Buffer？比如PBS 的 pH 值，是 1X 还是 10X PBS，FBS
有没有过期，或者 7-AAD 买了多久了？我也用 293T 做 Flow，样品分解成单细胞后
要花六到七个小时染色，然后每个样品里加 7-AAD 做对照。我的样品里 7-AAD
positive 的细胞都不多。我在 Negative 的细胞里 gate 一部分出来作为 P1，P1 一
般都在 70% 以上，另外有一部分 Negative 的细胞 FSC 和 SSC 值都很大我都不分析
了。你这个 50-60% 听起来有点吓人。或者你换一个染料来做这个实验，比如 DAPI？
如果 DAPI 的值和 7-AAD 的不一样说明两个药品当中有一个坏掉了。

AAD+ （做 FACS的时候离 trypsinization差不多5-6小时吧）。刚刚trypsinized的细
胞，然后立即作FACS， 7-AAD+的细胞比例很低，只有1-2%左右吧。

【在 f*******g 的大作中提到】

: 最近在养293T cells, 转染或者未转染的293T细胞放在FASC buffer (PBS+5% FBS）中
: ，然后在室温或者ice上放置两到三个小时，用7-AAD染色，发现60%的细胞都是 7-AAD+ （做 FACS的时候离 trypsinization差不多5-6小时吧）。刚刚trypsinized的细胞，然后立即作FACS， 7-AAD+的细胞比例很低，只有1-2%左右吧。
: 请问这种情况正常么？
: 我看到有的paper上， 293T细胞在室温或者冰上放置16个小时，然后用相应的抗体染色
: ，然后FACS 分析。这种情况难道所有的293T 细胞不会全部死掉么？如果细胞都死了
: ，应该都会被染色吧？
: 高手来分析一下吧？谢谢！

c*z2011-01-31 08:01

7 楼

tell them NOT to contact current employer

f*g2011-01-31 08:01

8 楼

谢谢你的回复 !
7-AAD应该是好的,我的293T细胞从培养皿detach后立即用7-AAD染色,viability挺高的,
有95%左右吧。但我用抗体染色时间长，要3-4小时，最后作FACS，7-AAD+ 的细胞就达
到了50-60%。
在室温下温育的时候，死细胞和活的细胞明显分成两个population，死细胞FSC明显变小了。
我的PBS是从公司买的， 1X，但从来没有测过pH。
谢谢

i*t2011-01-31 08:01

9 楼

这样就可以了？
现在单位就不可能知道我去哪里了吧？

【在 c***z 的大作中提到】

: tell them NOT to contact current employer

f*g2011-01-31 08:01

10 楼

我的MSN f*******[email protected],你有时间能不能加我的MSN，详细聊聊呢？谢谢！

的,
显变小了。

【在 f*******g 的大作中提到】

: 谢谢你的回复 !
: 7-AAD应该是好的,我的293T细胞从培养皿detach后立即用7-AAD染色,viability挺高的,
: 有95%左右吧。但我用抗体染色时间长，要3-4小时，最后作FACS，7-AAD+ 的细胞就达
: 到了50-60%。
: 在室温下温育的时候，死细胞和活的细胞明显分成两个population，死细胞FSC明显变小了。
: 我的PBS是从公司买的， 1X，但从来没有测过pH。
: 谢谢

i*t2011-01-31 08:01

11 楼

自己再re一下吧
多谢各位指点一下！
thanks

i*t2011-01-31 08:01

12 楼

re继续求问

f*n2011-01-31 08:01

13 楼

新公司填背景调查表的时候，都会有个选项，你选不联系现在的公司。这个大家都理解
，他们不会联系的。如果要Reference，找个关系好的同事，能保密就行。至于现在公
司知道不知道你去哪个新公司，这个重要吗？你都走了，人家要知道你去哪个公司干嘛
？除非跟现在公司签了什么文件，不能去竞争对手的情况除外。你走的时候，没有义务
告诉现在的公司你要去哪里。以前遇到过的大部分人都说，也有小部分人不说。现在
Social Media 这么发达，就算你不说，没多久大家还是会知道你去了哪里。再说，这
个世界很小，以后说不定在外面碰到现在公司的人，或者你又回现在的公司，还是留点
后路好，多个朋友多条路