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请问有人用Dynal beads做IP么

请问有人用Dynal beads做IP么# Biology - 生物学

m*d2011-02-22 08:02

1 楼

原来用agarose beads做IP，最后recover protein的时候，加loading buffer到beads
里煮一会。现在第一次用Invitrogen的Dynal beads，请问大家都怎么elute protein下
来呢

W*C2011-02-22 08:02

2 楼

同样 95度 5分钟或者 70度 15分钟

c*r2011-02-22 08:02

3 楼

不能重复使用beads吗？

【在 W****C 的大作中提到】

: 同样 95度 5分钟或者 70度 15分钟

T*t2011-02-22 08:02

4 楼

Streptavidin-biotin的binding特别强，不变性弄不下来，所以没法重复使用。

【在 c*********r 的大作中提到】

: 不能重复使用beads吗？

w*e2011-02-22 08:02

5 楼

其实一个biotin跟SA的binding ms没想象的NB。我把biotinylated aptamer
coat到SA beads上做过sandwich assay，结果发现heat后掉下来的
aptamer造成极大background。杯具。。。

【在 T**********t 的大作中提到】

: Streptavidin-biotin的binding特别强，不变性弄不下来，所以没法重复使用。

T*t2011-02-22 08:02

6 楼

我没做过单biotin label的，都是直接上dual biotin，结合得很牢靠。跑PCR都没问题。

【在 w******e 的大作中提到】

: 其实一个biotin跟SA的binding ms没想象的NB。我把biotinylated aptamer
: coat到SA beads上做过sandwich assay，结果发现heat后掉下来的
: aptamer造成极大background。杯具。。。

T*t2011-02-22 08:02

7 楼

那你不加热呢？会不会好一点。

【在 w******e 的大作中提到】

w*e2011-02-22 08:02

8 楼

我的assay是biotin RNA beads+protein +unlabeled alternative RNA,
要elute unlabeled RNA的话除了heat外有什么比较保险的方法吗？
0.1M NaOH?

【在 T**********t 的大作中提到】

: 那你不加热呢？会不会好一点。

w*e2011-02-22 08:02

9 楼

有什么好办法往RNA上label多个biotin否？

题。

【在 T**********t 的大作中提到】

: 我没做过单biotin label的，都是直接上dual biotin，结合得很牢靠。跑PCR都没问题。

T*t2011-02-22 08:02

10 楼

估计不行，RNA容易被NaOH溶液水解。
我没做过这个assay，暂时能想到的也就是给biotin-RNA弄上个dual biotin label，让
它抓得更牢一点。在IDT合成的RNA是可以直接订带dual biotin label的，但是如果要
自己在实验室label的话我就不知道了，应该有kit买的。

【在 w******e 的大作中提到】

: 我的assay是biotin RNA beads+protein +unlabeled alternative RNA,
: 要elute unlabeled RNA的话除了heat外有什么比较保险的方法吗？
: 0.1M NaOH?

w*e2011-02-22 08:02

11 楼

俺的RNA巨长，还是2'F modified，合成要成千上万刀。。。杯具。。。

我买的kit只能label一个biotin。。。anyway，其实也可以改一下primer sequence
能distinguish labelled/nonlabelled RNA就行，我就是懒。。。

【在 T**********t 的大作中提到】

: 估计不行，RNA容易被NaOH溶液水解。
: 我没做过这个assay，暂时能想到的也就是给biotin-RNA弄上个dual biotin label，让
: 它抓得更牢一点。在IDT合成的RNA是可以直接订带dual biotin label的，但是如果要
: 自己在实验室label的话我就不知道了，应该有kit买的。

T*t2011-02-22 08:02

12 楼

巨长是多长？太长的话你可以买一段短的RNA然后跟你的长的RNA片段ligate起来。

【在 w******e 的大作中提到】

: 俺的RNA巨长，还是2'F modified，合成要成千上万刀。。。杯具。。。
:
: 我买的kit只能label一个biotin。。。anyway，其实也可以改一下primer sequence
: 能distinguish labelled/nonlabelled RNA就行，我就是懒。。。

s*s2011-02-22 08:02

13 楼

SA应该是4个domain？一般都是多biotin,想想pKa*4,恐怖

【在 w******e 的大作中提到】

s*s2011-02-22 08:02

14 楼

为啥会有unlabeled? 是指background么？
w

【在 w******e 的大作中提到】

: 我的assay是biotin RNA beads+protein +unlabeled alternative RNA,
: 要elute unlabeled RNA的话除了heat外有什么比较保险的方法吗？
: 0.1M NaOH?

s*s2011-02-22 08:02

15 楼

换其他的kit? 不是biotin-UTP一类的么？

【在 w******e 的大作中提到】

w*e2011-02-22 08:02

16 楼

80base。

嗯，我把splint ligation的东西都买了，就是懒得做。。。

【在 T**********t 的大作中提到】

: 巨长是多长？太长的话你可以买一段短的RNA然后跟你的长的RNA片段ligate起来。

w*e2011-02-22 08:02

17 楼

pKa??你是说Kd吧？

【在 s******s 的大作中提到】

: SA应该是4个domain？一般都是多biotin,想想pKa*4,恐怖

w*e2011-02-22 08:02

18 楼

unlabeled RNA binds to different site on the protein (hence the sandwich),
and is measured w/ qRT-PCR for read out. However, my labeled aptamer
has the same primer. hence the 杯具。。。其实主要是一直就没想到biotinylated
RNA会fall off，troubleshoot了好久。。。

【在 s******s 的大作中提到】

: 为啥会有unlabeled? 是指background么？
: w

w*e2011-02-22 08:02

19 楼

给个link？我用的kit是这个：
http://www.piercenet.com/browse.cfm?fldID=AD32B746-5056-8A76-4E
我只能label ends，不然可以用biotin-NTP加到synthesis reaction里。。。

【在 s******s 的大作中提到】

: 换其他的kit? 不是biotin-UTP一类的么？