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请教western blot equal loading

请教western blot equal loading# Biology - 生物学

N*P2011-05-04 07:05

1 楼

我是新手，诚心请教western达人：
15% Tris.HCl precast gel (Biorad),coomassie blue染色以显示所有蛋白。把15%胶
直接扫描，图像没有做任何photoshop调整。protein maker是Biorad prestained SDS-
PAGE standards, broad range, 用了8ul. 1 lane是recombinant human IGF-1; 2-4 lanes为tissue lysates.这块胶经过染色以后，一直保存在4度双蒸水里面，快10个月了。
1.能否说第2，3，4 lanes equal loading?
2.我的标准曲线不是很准，但凭大家的经验，每条lane里面，大概加了多少ug蛋白？
3.Lane 1我加了500ng recombinant human IGF-1 (7.4kd)，对应的应该是最下面那一
条带。但这条带染色很弱。500ng纯蛋白显示的带，经过coomassie blue染色以后，是
否很明显？

h*o2011-05-04 07:05

2 楼

To me, lane 3 and 4 are comparable but both are higher than lane 2.
If it's for western, why not use a normalizer, say b-actin?

m*72011-05-04 07:05

3 楼

第一，你的tissue lysate测了总蛋白浓度没有？
第二，如楼上所说，你既然要做Western blot，为什么不用Western blot的常规方法用抗体去检测持家基因的表达量？
第三，谁能告诉我那些状如小气泡的东西是什么啊？难道是你的胶上就含着这些气泡？
第四，为什么这块胶泡了１０个月你才来问上样量可不可比？
第五，你为什么会认为别人能够目测蛋白浓度，就凭这张照片？
第六，５００ng蛋白接近commassie blue染色检测的下限了（有文献说下限为0.3-1ug/lane，与染色条件相关），你看不见也属正常。

s*t2011-05-04 07:05

4 楼

气泡不是胶里面的，是泡在水里外面的吧。

用抗体去检测持家基因的表达量？
1ug/lane，与染色条件相关），你
看不见也属正常。

【在 m*********7 的大作中提到】

: 第一，你的tissue lysate测了总蛋白浓度没有？
: 第二，如楼上所说，你既然要做Western blot，为什么不用Western blot的常规方法用抗体去检测持家基因的表达量？
: 第三，谁能告诉我那些状如小气泡的东西是什么啊？难道是你的胶上就含着这些气泡？
: 第四，为什么这块胶泡了１０个月你才来问上样量可不可比？
: 第五，你为什么会认为别人能够目测蛋白浓度，就凭这张照片？
: 第六，５００ng蛋白接近commassie blue染色检测的下限了（有文献说下限为0.3-1ug/lane，与染色条件相关），你看不见也属正常。

N*P2011-05-04 07:05

5 楼

谢谢楼上各位。
不好意思，发帖时没解释清楚。胶中的孔是mass-spec取样时打的。