如何证明3个或3个以上的蛋白存在一个protein complex中 - 未名空间MITBBS历史存档

如何证明3个或3个以上的蛋白存在一个protein complex中# Biology - 生物学

a*p2011-05-12 07:05

1 楼

最近公司调整，本人的工作被Relocate到另外一个州，不从就雷。从职业发展的角度考
虑，从了。
准备自己一个人过去工作，LD和小孩继续留在当地（LD有一不错的工作）。我在一两
年内再找回来或LD找过去。我在新工作地点租Apartment。
Relocation Package 是公司的标准程序，包括一些Lump Sum 的钱用于House-hunting
Trip， Temp-Living等等。说是按家庭的标准，其实根本不管你怎么花。
另外的一个Benefit 是公司帮助卖房子，好处还挺多的。
现在我在考虑趁此机会卖掉当前（不太令人满意的）房子，同时由LD出面在其工作单位
附近买个新一点好一点的房子，这样LD上下班可以节约30Mile，小孩的学校也更好一点
。而且房子的维修负担也会少很多。
这样做有啥不妥的地方吗？倒不是担心一两年后如果需要再次卖房的经济问题，而是考
虑这样做是否跟公司条例冲突。
我理解公司管不了我家属在哪里生活和工作，那么公司也应该管不了我家属在哪里买房
。我现在卖房是因为我的工作变动，公司政策允许的。我家属住哪里不应该影响我能否
适用公司卖房的条例。
这样理解有问题吗？多谢。

h*32011-05-12 07:05

2 楼

这家租客特烦，不是大门坏了要修，就是墙壁被她那有毛病的儿子抠得坑坑洼洼要重新
粉刷。
请教是否有法律规定业主一定要维修呢？
谢谢。

L*n2011-05-12 07:05

3 楼

《步步惊心》基本还原了一个真实的历史，里面人物性格塑造上，添加了很多作者的改写
，添加了爱情故事情节，虚似的穿越人物，让剧情变得虐心，亦非正史，却比正史感人，
这就是剧作夸张描写后的特点。那真正历史上的那些主角，阿哥和康熙是什么星座呢，笔
者查资料，一个个找出了他们的出生时辰，看看他们到底是什么星座，是什么样的性格呢
！
康熙
姓名：爱新觉罗.玄烨
生辰：顺治十一年三月十八日
公历：1654年5月4日
星座：金牛座
金牛座一个现实主义的土象星座，比起处女座的耗用跌宕起伏和摩羯的复杂，金牛座最为
稳定固执，勤奋节俭，宽厚且有原则的星座。金牛座的隐忍造就这个在8岁登基皇帝的
自持
和忍耐。15岁擒鳌拜，然后灭吴三桂，收复台湾，击溃沙俄。金牛座向往宁静和繁荣的境
界，所以他也做到。垄断性的评价可能武断，但政绩可以说明一切，一生励精图治，在位
61年，后称千古一帝，盛世的开创者。当然，想继位称帝，可想他的儿子们苦等和斗争多
少年！
雍正
姓名：爱新觉罗·胤禛
生辰：康熙十七年十月三十日
公历：1678年12月13日
星座：射手座
射手座的人喜欢我行我素，行动力强。雍正在位仅仅13年，接手时国库空虚。在他宵衣旰
食的勤政下，抄家追凡赃，整饬吏治，加强粮食生产，废除贱籍，据说他在位13年，光在
奏折写下的批语就有1000多成字。还有射身座的人特立独行，有自己的独特的见解和想法
，历史上写他的性格颇为复杂，勤政刻苦，雷厉风行一方面，说他脾气暴躁，经常怒发冲
冠，而且刻薄残酷，办事也心狠手辣，也信道教迷丹药！还有纠正，康熙传位的确实是给
雍正。
太子（后被废）
姓名：爱新觉罗·胤礽
生辰：康熙十三年五月初三日巳时
公历：1674年6月6日
星座：双子座
双子座的聪明灵动和口才好是公认的。这位被废黜两次的太子，有史记载说其天资聪明，
开卷即讲，善于交际，而且精于射箭，连发连中不说，还写得一手好书法，美难言尽。双
子座就是双重性格的代表，积极与消极共存，压力会让他们焦躁，更容易被身边人影响。
他是由由康熙一手带大，是唯一的嫡出子，从1岁便立为太子，废黜后再复，可见康熙
有多
喜欢。可是最终因兄弟间激烈的夺嫡之争，导致人格扭曲，骄奢淫逸，被禁锢咸安宫内，
直到幽死。
八阿哥
姓名：爱新觉罗·胤禩
生辰：康熙二十年二月初十日
公历：1681年3月29日
星座：白羊座
白羊座以外的星座都没有的一个点，代表着初始能量由内向外爆发。白羊座的人热情善斗
，勇于冒险，精力旺盛。而历史上这个八阿哥是一个信仰权力和不甘落于他人之后的性格
，而且白羊座也是最容易被人理解接受的星座，所以会以他为首，建立八爷党。白羊座喜
欢往前看，不惜一切实现自己的目标。因其母现身辛者库，潜意识里的自卑让他表面更加
自傲，更加向往跃于他人之上。被权势和欲望，纠缠了半生，最后夺嫡失败，高墙圈禁中
死去。
十三阿哥
姓名：爱新觉罗·胤祥
生辰：康熙二十五年十月初—日
公历：1686年11月16日
星座：天蝎座
天蝎座的人喜静，喜好异于常人，内心有高度责任和忠诚感，也很少坦露于人，十三阿哥
自幼便与雍政知心。对其忠诚，为其分扰，实心任事。雍政在位的功绩，执行者多为他。
还有对外国交往都是由他。天蝎座一生都在寻找心灵上的朋友，更有彻骨的冷静和孤傲，
孤独的天蝎是睿智的，性格总是处在极端处。历史上的十三阿哥被圈禁是事实，但说是因
为康熙为了保护他，是不是十年，现在众说纷芸。不过在雍政登基之后，他一直在背后默
默献策，美名都给了雍政。因圈禁落病，加上事必躬亲的劳累，后病逝。
十四阿哥
姓名：爱新觉罗·胤禵原名：爱新觉罗·胤祯
生辰：康熙二十七年戊辰正月初九日酉时
公历：1688年2月10日
星座：水瓶座
水瓶座的人有一种没由来的骄傲，客观冷静，崇尚平等自由，重视精神上的交往。十四阿
哥聪明过人，文武双全，而且有义气，被康熙所厚爱，23岁便任抚远大将军进藏征讨策妄
阿拉布坦。水瓶座的男性内心极为复杂，看似平静，内心总是在矛盾中纠结。因为太关注
外面的世界，给身边的人带来压迫感。与雍政是同母兄弟，可是因为政见不同，反目成仇
。最后相比八爷党中，雍政只让他去守陵，后乾隆登基后恢复自由。
九阿哥
姓名：爱新觉罗·胤禟
生辰：康熙二十二年八月二十七日
公历：1683年10月17日
星座：天秤座
天秤座的身上永远是意气相投的特殊感知，并且理解能力强，多才多艺，不愿与人争。历
史上对这位爷的资料很少，从搜集的资料中提到，生辰和祭日为同一天。爱从商不爱从政
，曾经是富可敌国的九皇商。康熙把他定位成“成不了大器的奸商”。天秤座的人天性乐
观，喜欢呼朋唤友，不甘寂寞，而且不重视金钱。在八阿哥夺嫡时的费用都是他出的，十
四阿哥打战时，亲自设计战车送到西宁，支持他们可用不遗余力形容。直到失败后仍然不
离不弃，自古成王败寇，最后连姓氏都被剥夺！

w*i2011-05-12 07:05

4 楼

呵呵，应版大的邀请，贡献一下愚见。
首先本人也是苹果的用户，从ipad到iphone，总体来说苹果今天的地位是和jobs的个人
魅力息息相关的，鹤立鸡群的产品用户体验是最好卖点，这样带来的一个最大的好处就
是profit margin奇高,price power也巨强，同样的做手机的三星，产品也不是不好，
但是就是无可同日而语。
最近的blow out ER更多的是得益于iphone 4S的彪悍战绩，而与之形成鲜明对比的是上
个季度的iphone销售和市场表现的低迷，所以iphone的市场表现和股价的走势关联非常
大。 iphone 4s本来不是很看好，作为ip5推出之前的一个过渡产品，但是跌破眼镜的
表现让人相信大家对于ip的追捧还远远未消退，所以我们有理由相信ip5出来的时候会
有同样的表现。
回到股价的走势，从ER前的pre er run到425，然后再ER那周刻意的控制在450左右，再
就是Feb OE的飙升拉高到525，然后是后来的一路飙升到现在的550.如果说Feb 15是拉
高出货兼杀call/put的话，然后这周就是借助ipad3来一次真正的高位盘整出货，因为
这个量上来了，而且sell into strength是惯用的庄家做法，而且consolidate一般都
会需要两周左右的时间，不会是一天就完事，但是鉴于AAPL的一大片利好的消息，所以
我们可以预料会近期还是会有人buy every dip.
所以个人的观点是这次调整应该是从上周四就开始了，股价应该会至少回到50MA附近，
也就是460左右。所以如果想做长期投资的同学不要急于进货，应该可以等到那个位置
入，而真正合适的投资点应该在去年11月份360多的价位的时候（当时在古板喊过进货
的）。而回到200MA也就是390的机会不大(但是回到425还是机会不少)，具体来说现在
大盘还没有崩盘的契机，而且FED的大本一直在为QE3找个借口，所以如果大盘从现在的
位置下降如果超过10%的话,我们应该会看到大家期待的QE3. （那个位置正好是SPY
200MA 125）
投资建议：如果AAPL股票跌到425的话，可以买入一点，当然如果现在这波还能够冲到
550以上的话，也就是MID APR high的话，坚决卖出AAPL股票，后面我看好AAPL在470～
560这个区间徘徊相当一段时间（所以做weekly swing trade应该会有不少机会的）。

a*u2011-05-12 07:05

5 楼

GST-fused protein A 拉下了B,C,D.且ABCD在胞浆和核内都有分布。文献报道BC、BD在
胞浆和核内都有直接的相互作用，但BCD是否在一个复合物未知或未报道。现在猜想
ABCD很有可能在一个复合物，A作为一个scaffold protein的角色。有什么方法说明4个
蛋白或者至少3个蛋白形成一个complex？有没有比较简单点的方法，国内实验室的设备
条件比较限制。

w*32011-05-12 07:05

6 楼

As long as u think u meet the relocation requirments, I don't see why not.
No issue for selling ur house.
But when u buy new, u better think how to explain to ur relocation
coordinator because u will have to provide docs for reimbursement .

r*12011-05-12 07:05

7 楼

一个都没有猜对！！
保持一贯的猜不对记录！！
faint！！

w*22011-05-12 07:05

8 楼

赞股神，多谢了

【在 w*********i 的大作中提到】

: 呵呵，应版大的邀请，贡献一下愚见。
: 首先本人也是苹果的用户，从ipad到iphone，总体来说苹果今天的地位是和jobs的个人
: 魅力息息相关的，鹤立鸡群的产品用户体验是最好卖点，这样带来的一个最大的好处就
: 是profit margin奇高,price power也巨强，同样的做手机的三星，产品也不是不好，
: 但是就是无可同日而语。
: 最近的blow out ER更多的是得益于iphone 4S的彪悍战绩，而与之形成鲜明对比的是上
: 个季度的iphone销售和市场表现的低迷，所以iphone的市场表现和股价的走势关联非常
: 大。 iphone 4s本来不是很看好，作为ip5推出之前的一个过渡产品，但是跌破眼镜的
: 表现让人相信大家对于ip的追捧还远远未消退，所以我们有理由相信ip5出来的时候会
: 有同样的表现。

L*g2011-05-12 07:05

9 楼

do you have antibody against B C D ( I suppose you have or at least B C D
have tags), your GST results have somehow support your hypothesis, so you
can add some more evidence
1)co-IP, give in vivo evidence (need tagged A expressed in cells)
2) gel-filtration(size exlusive column) using FPLC, check their
cofractionation status, if they all comes out at the same fractions (peaks
overlap). This may require equipment and buy columns.

w*32011-05-12 07:05

10 楼

Anyway， u should ask if it is a lump sum if u don't use it， they will
give u thy remaining to u by the end of the day

r*12011-05-12 07:05

11 楼

不过谁知道这个流传出来的是对的还是不对的啊。。。

C*G2011-05-12 07:05

12 楼

受村长推荐，我老也来拜读土大牛的大作哈
hiahia

a*u2011-05-12 07:05

13 楼

co-IP results also show A has interaction with B or C or D.
gel-filtration seems fine, but the equipment is a problem.

【在 L********g 的大作中提到】

: do you have antibody against B C D ( I suppose you have or at least B C D
: have tags), your GST results have somehow support your hypothesis, so you
: can add some more evidence
: 1)co-IP, give in vivo evidence (need tagged A expressed in cells)
: 2) gel-filtration(size exlusive column) using FPLC, check their
: cofractionation status, if they all comes out at the same fractions (peaks
: overlap). This may require equipment and buy columns.

C*d2011-05-12 07:05

14 楼

卖房子肯定能报销。买房子可能不可以。有的公司可以选择直接拿relocation支票的，
就是扣的税重些，你可以问问。

s*m2011-05-12 07:05

15 楼

这个主要的都对，但是你要明白，你猜的是电视里虚构的，他们是历史真实的。。。所
以不存在你猜错的问题。
头脑清楚一点！！！（开玩笑呢，呵呵，别生气。。。）

【在 r**********1 的大作中提到】

: 不过谁知道这个流传出来的是对的还是不对的啊。。。

h*l2011-05-12 07:05

16 楼

大牛在这里给果粉办讲座：）

【在 w*********i 的大作中提到】

: 呵呵，应版大的邀请，贡献一下愚见。
: 首先本人也是苹果的用户，从ipad到iphone，总体来说苹果今天的地位是和jobs的个人
: 魅力息息相关的，鹤立鸡群的产品用户体验是最好卖点，这样带来的一个最大的好处就
: 是profit margin奇高,price power也巨强，同样的做手机的三星，产品也不是不好，
: 但是就是无可同日而语。
: 最近的blow out ER更多的是得益于iphone 4S的彪悍战绩，而与之形成鲜明对比的是上
: 个季度的iphone销售和市场表现的低迷，所以iphone的市场表现和股价的走势关联非常
: 大。 iphone 4s本来不是很看好，作为ip5推出之前的一个过渡产品，但是跌破眼镜的
: 表现让人相信大家对于ip的追捧还远远未消退，所以我们有理由相信ip5出来的时候会
: 有同样的表现。

l*12011-05-12 07:05

17 楼

I think you might need to do consecutive affinity column/pull down. Let's
say you tag your A, B, C, D with GST, V5, His, and HA.
You can start with GST-fused A to pull down the A-containing complexes.
Then pass the elution to V5-tag beads, elute the presumed A&B containing
complexes with V5 peptide. Pass the A&B containing complexes through His-
tag beads, elute the ABC complex with imidazole.
Use Western to probe the original sample and each elution for those 4 tags.
Of course, you can change the order of affinity purification to further
confirm it.

【在 a*******u 的大作中提到】

: GST-fused protein A 拉下了B,C,D.且ABCD在胞浆和核内都有分布。文献报道BC、BD在
: 胞浆和核内都有直接的相互作用，但BCD是否在一个复合物未知或未报道。现在猜想
: ABCD很有可能在一个复合物，A作为一个scaffold protein的角色。有什么方法说明4个
: 蛋白或者至少3个蛋白形成一个complex？有没有比较简单点的方法，国内实验室的设备
: 条件比较限制。

a*p2011-05-12 07:05

18 楼

就是想利用一下卖房子的好处，比如没有agent Fee，免费修理查出来的缺陷，
Guaranteed buyout priced 等。当然还有其它一些在原贴中提到的非经济上的好处.
买房的话就不需要通知单位也不需要他们的帮助了。自己掏钱就是了。

【在 C*******d 的大作中提到】

: 卖房子肯定能报销。买房子可能不可以。有的公司可以选择直接拿relocation支票的，
: 就是扣的税重些，你可以问问。

r*12011-05-12 07:05

19 楼

恩那～～

i*o2011-05-12 07:05

20 楼

呵呵，从apps的下载来看，二月底开始急剧下降，不是什么好兆头，又回到了去年九月
的样子，看ipad3能不能挽回些sales。

【在 w*********i 的大作中提到】

: 呵呵，应版大的邀请，贡献一下愚见。
: 首先本人也是苹果的用户，从ipad到iphone，总体来说苹果今天的地位是和jobs的个人
: 魅力息息相关的，鹤立鸡群的产品用户体验是最好卖点，这样带来的一个最大的好处就
: 是profit margin奇高,price power也巨强，同样的做手机的三星，产品也不是不好，
: 但是就是无可同日而语。
: 最近的blow out ER更多的是得益于iphone 4S的彪悍战绩，而与之形成鲜明对比的是上
: 个季度的iphone销售和市场表现的低迷，所以iphone的市场表现和股价的走势关联非常
: 大。 iphone 4s本来不是很看好，作为ip5推出之前的一个过渡产品，但是跌破眼镜的
: 表现让人相信大家对于ip的追捧还远远未消退，所以我们有理由相信ip5出来的时候会
: 有同样的表现。

D*92011-05-12 07:05

21 楼

you have to separate the protein complex(es) by FPLC, then check the
component of different fractions.

w*32011-05-12 07:05

22 楼

my experience:
if you sell your house to the company, you dont need to pay a cent. Just
sign some forms. done.
if you buy a house, you just need loan and the company will pay allo ther
fees, which is really nice.In you case, you can not take adavantage... ^_^
also, you should have a lump sum for relocation. if you dont use it, the
company will pay u as cash!!! If you use some, you will get reimbursment and
still an get the remaining as cash!!!
Enjoy!

l*12011-05-12 07:05

23 楼

With gel filtration, how can you rule out the possibility where different
combinations of those four proteins might belong to different complexes and
those complexes happen to have same molecular weight?

【在 a*******u 的大作中提到】

: co-IP results also show A has interaction with B or C or D.
: gel-filtration seems fine, but the equipment is a problem.

a*p2011-05-12 07:05

24 楼

Lumpsum是有的。差不多是3个月工资吧。不用报销。(当初雷人选择的包裹也更这个差
不多，搞笑)
卖房的话不用出agent fee.这个是房价的6%左右吧。而且有公司保底的buyout offer.
加上对现在的房子也不是很满意，所以趁机出手。
而且LD的负担会稍小一点。
卖新房的好处相对较小，就不再计较能不能拿到了。

and

【在 w*****3 的大作中提到】

: my experience:
: if you sell your house to the company, you dont need to pay a cent. Just
: sign some forms. done.
: if you buy a house, you just need loan and the company will pay allo ther
: fees, which is really nice.In you case, you can not take adavantage... ^_^
: also, you should have a lump sum for relocation. if you dont use it, the
: company will pay u as cash!!! If you use some, you will get reimbursment and
: still an get the remaining as cash!!!
: Enjoy!

c*r2011-05-12 07:05

25 楼

1.co-IP
2.试试看nondenature gel，probe with anti-A，B，C，D，运气好的话能够显示一条
band
3.co-localization。immunofluorescent应该显示overlap。
4.特殊情况下，可以用更复杂的FRET啥的。

【在 a*******u 的大作中提到】

: GST-fused protein A 拉下了B,C,D.且ABCD在胞浆和核内都有分布。文献报道BC、BD在
: 胞浆和核内都有直接的相互作用，但BCD是否在一个复合物未知或未报道。现在猜想
: ABCD很有可能在一个复合物，A作为一个scaffold protein的角色。有什么方法说明4个
: 蛋白或者至少3个蛋白形成一个complex？有没有比较简单点的方法，国内实验室的设备
: 条件比较限制。

L*g2011-05-12 07:05

26 楼

agree, gel-filtratioin has its limit, thats why I list it on option 2 only
to add some more evidence to the GST, co-IP results.
But if A/B is the hub/scaffold, mutated A/B or KO AB may cause the
disassoation of B C D, then you will see differnt gel-filtration profilings.
through this comparison, you can say A/others are important for forming a
complex.
Also for linyijvn1, have you done some genetic analysis to add evidence that
A, B, C, D are depending on each other for functions? Personally I think
GST and co-IP results can be good enough to give some biochemical evidences.
you just need other aspects (e.g. genetic interactions or co-localization

and

【在 l*******1 的大作中提到】

: With gel filtration, how can you rule out the possibility where different
: combinations of those four proteins might belong to different complexes and
: those complexes happen to have same molecular weight?

I*r2011-05-12 07:05

27 楼

try crosslinking (maybe followed by mass spec)

【在 a*******u 的大作中提到】

: GST-fused protein A 拉下了B,C,D.且ABCD在胞浆和核内都有分布。文献报道BC、BD在
: 胞浆和核内都有直接的相互作用，但BCD是否在一个复合物未知或未报道。现在猜想
: ABCD很有可能在一个复合物，A作为一个scaffold protein的角色。有什么方法说明4个
: 蛋白或者至少3个蛋白形成一个complex？有没有比较简单点的方法，国内实验室的设备
: 条件比较限制。

D*a2011-05-12 07:05

28 楼

FRET?

s*y2011-05-12 07:05

29 楼

Native gel and sucrose gradient centrifugation

【在 a*******u 的大作中提到】

: GST-fused protein A 拉下了B,C,D.且ABCD在胞浆和核内都有分布。文献报道BC、BD在
: 胞浆和核内都有直接的相互作用，但BCD是否在一个复合物未知或未报道。现在猜想
: ABCD很有可能在一个复合物，A作为一个scaffold protein的角色。有什么方法说明4个
: 蛋白或者至少3个蛋白形成一个complex？有没有比较简单点的方法，国内实验室的设备
: 条件比较限制。

e*s2011-05-12 07:05

30 楼

你的Pulldown结果表示这些是一个大的Complex，
这可能会是一个比较复杂点的课题。只要A和BCD中任何一个有Interaction，都可能把3
个蛋白都拉下来。甚至还有其他的Player,因此理论上，A和BCD都不结合甚至都可能把
他们拉下来。
要是我，我会先盯着A和B做。最好的办法是用Purified protein来PD，也只有这样才能
证明是direct interaction。因为你在in vivo能把B拉下来，所以如果AB是直接相互作
用的话，在In vitro，应该也能PD下来。

【在 a*******u 的大作中提到】

: GST-fused protein A 拉下了B,C,D.且ABCD在胞浆和核内都有分布。文献报道BC、BD在
: 胞浆和核内都有直接的相互作用，但BCD是否在一个复合物未知或未报道。现在猜想
: ABCD很有可能在一个复合物，A作为一个scaffold protein的角色。有什么方法说明4个
: 蛋白或者至少3个蛋白形成一个complex？有没有比较简单点的方法，国内实验室的设备
: 条件比较限制。

H*g2011-05-12 07:05

31 楼

For 3 proteins, you may try BiFC-FRET for in vivo and real-time interaction
analysis.

s*n2011-05-12 07:05

32 楼

有点沙盘推演的味道哦，呵呵。

a*u2011-05-12 07:05

33 楼

多谢建议，已经进行A和B的mapping了，比较繁琐，也不不太顺。

把3

【在 e****s 的大作中提到】

: 你的Pulldown结果表示这些是一个大的Complex，
: 这可能会是一个比较复杂点的课题。只要A和BCD中任何一个有Interaction，都可能把3
: 个蛋白都拉下来。甚至还有其他的Player,因此理论上，A和BCD都不结合甚至都可能把
: 他们拉下来。
: 要是我，我会先盯着A和B做。最好的办法是用Purified protein来PD，也只有这样才能
: 证明是direct interaction。因为你在in vivo能把B拉下来，所以如果AB是直接相互作
: 用的话，在In vitro，应该也能PD下来。

a*u2011-05-12 07:05

34 楼

thanks a lot.
Any reference papers or protocols recommended?
I have no experiences on protein affinity purification.

.

【在 l*******1 的大作中提到】

: I think you might need to do consecutive affinity column/pull down. Let's
: say you tag your A, B, C, D with GST, V5, His, and HA.
: You can start with GST-fused A to pull down the A-containing complexes.
: Then pass the elution to V5-tag beads, elute the presumed A&B containing
: complexes with V5 peptide. Pass the A&B containing complexes through His-
: tag beads, elute the ABC complex with imidazole.
: Use Western to probe the original sample and each elution for those 4 tags.
: Of course, you can change the order of affinity purification to further
: confirm it.

a*u2011-05-12 07:05

35 楼

CFP,YFP,GFP,RFP tagged protein去做confocal，但我的师姐说那样也不太令人信服不
能算是直接的证据。
不明白更复杂FRET怎么做，只知道CFP and YFP能做直接的相互作用，但是即使两两的
相互作用也不能说明3个或3个以上在一起，两个之间可以有竞争性排他占据的作用。
nondenaturation gel，能不能给个paper和protocol，听起来如果运气好的话，就能做
出来，而且成本或比较低。

【在 c******r 的大作中提到】

: 1.co-IP
: 2.试试看nondenature gel，probe with anti-A，B，C，D，运气好的话能够显示一条
: band
: 3.co-localization。immunofluorescent应该显示overlap。
: 4.特殊情况下，可以用更复杂的FRET啥的。

e*s2011-05-12 07:05

36 楼

这个有点太复杂了。
3-4步的Pull-down，Separation time 会很长。而且没一步骤换不同的Beads PD，如果
相互间的Kd不是ng级别的，我相信很少的蛋白会残留在最后的Eluate里面。
而且我认为，这个做法和楼主直接PD检测到3个Binding partners的结果没有实质性的
区别。

.

【在 l*******1 的大作中提到】

: I think you might need to do consecutive affinity column/pull down. Let's
: say you tag your A, B, C, D with GST, V5, His, and HA.
: You can start with GST-fused A to pull down the A-containing complexes.
: Then pass the elution to V5-tag beads, elute the presumed A&B containing
: complexes with V5 peptide. Pass the A&B containing complexes through His-
: tag beads, elute the ABC complex with imidazole.
: Use Western to probe the original sample and each elution for those 4 tags.
: Of course, you can change the order of affinity purification to further
: confirm it.

p*l2011-05-12 07:05

37 楼

there is no way to do a four part complex FRET as of now. It is an optical
instrument research problem. Current
microscopes just can't give you enough information to analyze FRET between
so many labels. You can try one pair
FRET at a time. But again what you get are not direct evidences of a four
part complex.

【在 a*******u 的大作中提到】

: CFP,YFP,GFP,RFP tagged protein去做confocal，但我的师姐说那样也不太令人信服不
: 能算是直接的证据。
: 不明白更复杂FRET怎么做，只知道CFP and YFP能做直接的相互作用，但是即使两两的
: 相互作用也不能说明3个或3个以上在一起，两个之间可以有竞争性排他占据的作用。
: nondenaturation gel，能不能给个paper和protocol，听起来如果运气好的话，就能做
: 出来，而且成本或比较低。

y*g2011-05-12 07:05

38 楼

treat the proteinA pd with trypsin digestion, then determine the mass of
fragments by mass spec. if bcd are not too big, chances are you can map the
sequence of each component. even the map is incomplete, you;ll still know if
the pd contains b, c or d.

i*g2011-05-12 07:05

39 楼

这玩意挺啰嗦的，要做一堆实验，
完全靠co-IP 有假阳性
更麻烦的是，你证明了他们在一个complex里面，功能呢？没有功能（也就是所谓：
making story）怎么发文章？

c*d2011-05-12 07:05

40 楼

There are known interactions between BC and BD. You may only have to prove C
+D in vivo with FRET. For in vitro, How about 2d gel separation.

c*r2011-05-12 07:05

41 楼

sure，师姐说得对啊。但是colocalization是充分非必要的。所以算supportive
evidence。
一个一个coIP吧，最直接证据

【在 a*******u 的大作中提到】

: CFP,YFP,GFP,RFP tagged protein去做confocal，但我的师姐说那样也不太令人信服不
: 能算是直接的证据。
: 不明白更复杂FRET怎么做，只知道CFP and YFP能做直接的相互作用，但是即使两两的
: 相互作用也不能说明3个或3个以上在一起，两个之间可以有竞争性排他占据的作用。
: nondenaturation gel，能不能给个paper和protocol，听起来如果运气好的话，就能做
: 出来，而且成本或比较低。

t*p2011-05-12 07:05

42 楼

这个不可行。crosslink的效率挺低的，要把一个4蛋白的complex连在一起是几乎不可
能的。

【在 I*********r 的大作中提到】

: try crosslinking (maybe followed by mass spec)

n*n2011-05-12 07:05

43 楼

IP-MS

the
if

【在 y********g 的大作中提到】

: treat the proteinA pd with trypsin digestion, then determine the mass of
: fragments by mass spec. if bcd are not too big, chances are you can map the
: sequence of each component. even the map is incomplete, you;ll still know if
: the pd contains b, c or d.

p*p2011-05-12 07:05

44 楼

What if what you've IPed has many complexes.

【在 n****n 的大作中提到】

: IP-MS
:
: the
: if

h*n2011-05-12 07:05

45 楼

do you mean IP then ESI?

【在 n****n 的大作中提到】

: IP-MS
:
: the
: if

e*02011-05-12 07:05

46 楼

这个想法不太现实，因为这样复杂的蛋白质复合体是需要很长时间和很多实验来证实的
。lz即便是硬做出一些实验结果，也很难发表。最现实的做法是，找出其中最容易检测
功能的蛋白，通过研究其余四个蛋白对目的蛋白功能的影响来说明其生物学意义。仅仅
证明蛋白质之间的物理结合是不能说明任何问题的，而且也是不适合用生物学方法在一
篇文章的工作量范围证明其全部。lz可以参考一下转录复合体的研究历史，看看自己能
不能一个人完成数十个实验室十几年的工作量。