w*e
2 楼
请教:用cell-free expression synthesize peptide/protein, 要求newly synthe-
sized peptide/protein自动被immobilize到beads上,并达到尽量高的copy number。
最直接的方法大概是在gene里加个FLAG/HA的sequence,beads上coat FLAG/HA
antibody。但Ab个头太大担心copy number上不去。
请教有什么alternative method?比如his6-peptide的coverage会不会更高?
比如有没有site-specific biotinylation的reagent可以跟cell-free expression
合用?
非常感谢!
sized peptide/protein自动被immobilize到beads上,并达到尽量高的copy number。
最直接的方法大概是在gene里加个FLAG/HA的sequence,beads上coat FLAG/HA
antibody。但Ab个头太大担心copy number上不去。
请教有什么alternative method?比如his6-peptide的coverage会不会更高?
比如有没有site-specific biotinylation的reagent可以跟cell-free expression
合用?
非常感谢!
t*r
3 楼
Co-ask.
w*e
4 楼
ding~
【在 w******e 的大作中提到】
: 请教:用cell-free expression synthesize peptide/protein, 要求newly synthe-
: sized peptide/protein自动被immobilize到beads上,并达到尽量高的copy number。
: 最直接的方法大概是在gene里加个FLAG/HA的sequence,beads上coat FLAG/HA
: antibody。但Ab个头太大担心copy number上不去。
: 请教有什么alternative method?比如his6-peptide的coverage会不会更高?
: 比如有没有site-specific biotinylation的reagent可以跟cell-free expression
: 合用?
: 非常感谢!
【在 w******e 的大作中提到】
: 请教:用cell-free expression synthesize peptide/protein, 要求newly synthe-
: sized peptide/protein自动被immobilize到beads上,并达到尽量高的copy number。
: 最直接的方法大概是在gene里加个FLAG/HA的sequence,beads上coat FLAG/HA
: antibody。但Ab个头太大担心copy number上不去。
: 请教有什么alternative method?比如his6-peptide的coverage会不会更高?
: 比如有没有site-specific biotinylation的reagent可以跟cell-free expression
: 合用?
: 非常感谢!
j*5
5 楼
coask
s*y
6 楼
6xHis 不是一个好选择,因为非特异结合非常严重(其实也不是真的非特异,
而是细胞裂解液里的好多蛋白本身就能结合金属离子)
你说的copy number, 是指每个bead 上被固定的多肽的数目吧?这个应该说
是“表面浓度”。
Antibody 的个头其实不是问题(再怎么大也超不过20nm),而是cross-linking
efficiency 会是大问题。
如果这个对你们真的很重要的话,可以用GST-fusion protein + Glutathione-beads
【在 w******e 的大作中提到】
: 请教:用cell-free expression synthesize peptide/protein, 要求newly synthe-
: sized peptide/protein自动被immobilize到beads上,并达到尽量高的copy number。
: 最直接的方法大概是在gene里加个FLAG/HA的sequence,beads上coat FLAG/HA
: antibody。但Ab个头太大担心copy number上不去。
: 请教有什么alternative method?比如his6-peptide的coverage会不会更高?
: 比如有没有site-specific biotinylation的reagent可以跟cell-free expression
: 合用?
: 非常感谢!
而是细胞裂解液里的好多蛋白本身就能结合金属离子)
你说的copy number, 是指每个bead 上被固定的多肽的数目吧?这个应该说
是“表面浓度”。
Antibody 的个头其实不是问题(再怎么大也超不过20nm),而是cross-linking
efficiency 会是大问题。
如果这个对你们真的很重要的话,可以用GST-fusion protein + Glutathione-beads
【在 w******e 的大作中提到】
: 请教:用cell-free expression synthesize peptide/protein, 要求newly synthe-
: sized peptide/protein自动被immobilize到beads上,并达到尽量高的copy number。
: 最直接的方法大概是在gene里加个FLAG/HA的sequence,beads上coat FLAG/HA
: antibody。但Ab个头太大担心copy number上不去。
: 请教有什么alternative method?比如his6-peptide的coverage会不会更高?
: 比如有没有site-specific biotinylation的reagent可以跟cell-free expression
: 合用?
: 非常感谢!
c*2
7 楼
I'm excited now. got citi AA 75K miles and CO 50K miles. If UA also can get
50K, then that can be total > $4000 in cash value.
50K, then that can be total > $4000 in cash value.
w*e
8 楼
多谢建议!
是这个。说copy number是每个beads上要coat不同的peptide。btw有什么好方法
测peptide浓度吗?如果已知peptide的部分序列的话
这个倒不知——ab biotinylation应该有满成熟的protocol吧?问题是我希望
每个beads(1到几um直径)上coat至少1e4 peptide,最好1e5以上。。。
要做一个peptide library的话,有点担心用GST做constant tag会不会太大?
有没有可能modification-by-synthesis的方法,加入一个biotin-AA analog,只在
某个位置incorporate的?继续伤脑筋ing
【在 s******y 的大作中提到】
: 6xHis 不是一个好选择,因为非特异结合非常严重(其实也不是真的非特异,
: 而是细胞裂解液里的好多蛋白本身就能结合金属离子)
: 你说的copy number, 是指每个bead 上被固定的多肽的数目吧?这个应该说
: 是“表面浓度”。
: Antibody 的个头其实不是问题(再怎么大也超不过20nm),而是cross-linking
: efficiency 会是大问题。
: 如果这个对你们真的很重要的话,可以用GST-fusion protein + Glutathione-beads
是这个。说copy number是每个beads上要coat不同的peptide。btw有什么好方法
测peptide浓度吗?如果已知peptide的部分序列的话
这个倒不知——ab biotinylation应该有满成熟的protocol吧?问题是我希望
每个beads(1到几um直径)上coat至少1e4 peptide,最好1e5以上。。。
要做一个peptide library的话,有点担心用GST做constant tag会不会太大?
有没有可能modification-by-synthesis的方法,加入一个biotin-AA analog,只在
某个位置incorporate的?继续伤脑筋ing
【在 s******y 的大作中提到】
: 6xHis 不是一个好选择,因为非特异结合非常严重(其实也不是真的非特异,
: 而是细胞裂解液里的好多蛋白本身就能结合金属离子)
: 你说的copy number, 是指每个bead 上被固定的多肽的数目吧?这个应该说
: 是“表面浓度”。
: Antibody 的个头其实不是问题(再怎么大也超不过20nm),而是cross-linking
: efficiency 会是大问题。
: 如果这个对你们真的很重要的话,可以用GST-fusion protein + Glutathione-beads
s*y
10 楼
如果你们有相对应的抗体的话可以简单的用免疫荧光法来测定
的确会有些大,而且会影响你的peptide comformation
有某些特定的氨基酸可以,比方说lysine (侧链被biotinlylated) 我忘记是
哪个公司有生产的了。你可以去骨狗一下。
不过,事先得警告一下,这个肯定会影响你的peptide构型。除非你故意把lysine
放在所有peptide 最后一位。
【在 w******e 的大作中提到】
: 多谢建议!
:
: 是这个。说copy number是每个beads上要coat不同的peptide。btw有什么好方法
: 测peptide浓度吗?如果已知peptide的部分序列的话
: 这个倒不知——ab biotinylation应该有满成熟的protocol吧?问题是我希望
: 每个beads(1到几um直径)上coat至少1e4 peptide,最好1e5以上。。。
: 要做一个peptide library的话,有点担心用GST做constant tag会不会太大?
: 有没有可能modification-by-synthesis的方法,加入一个biotin-AA analog,只在
: 某个位置incorporate的?继续伤脑筋ing
o*r
14 楼
Biotinylation is too complicated to do in your case, which modifies primary
amine group (N-term and side
chain of lysine).
His-tag will be a good idea.
【在 w******e 的大作中提到】
: 请教:用cell-free expression synthesize peptide/protein, 要求newly synthe-
: sized peptide/protein自动被immobilize到beads上,并达到尽量高的copy number。
: 最直接的方法大概是在gene里加个FLAG/HA的sequence,beads上coat FLAG/HA
: antibody。但Ab个头太大担心copy number上不去。
: 请教有什么alternative method?比如his6-peptide的coverage会不会更高?
: 比如有没有site-specific biotinylation的reagent可以跟cell-free expression
: 合用?
: 非常感谢!
amine group (N-term and side
chain of lysine).
His-tag will be a good idea.
【在 w******e 的大作中提到】
: 请教:用cell-free expression synthesize peptide/protein, 要求newly synthe-
: sized peptide/protein自动被immobilize到beads上,并达到尽量高的copy number。
: 最直接的方法大概是在gene里加个FLAG/HA的sequence,beads上coat FLAG/HA
: antibody。但Ab个头太大担心copy number上不去。
: 请教有什么alternative method?比如his6-peptide的coverage会不会更高?
: 比如有没有site-specific biotinylation的reagent可以跟cell-free expression
: 合用?
: 非常感谢!
s*8
15 楼
UA 的这个50K bonus的卡还不好啊?年费95很贵的啊,有必要申请 吗?
o*r
16 楼
For the his-tagged protein, if you add imidazole in your sample (usually 10-
50 mM) when binding to the Ni
beads, almost no non-specifical binding will be observed.
And his-tag is usually better than GST-tag: 1. it's small; 2. it can be used
for denatured protein.
【在 s******y 的大作中提到】
: 6xHis 不是一个好选择,因为非特异结合非常严重(其实也不是真的非特异,
: 而是细胞裂解液里的好多蛋白本身就能结合金属离子)
: 你说的copy number, 是指每个bead 上被固定的多肽的数目吧?这个应该说
: 是“表面浓度”。
: Antibody 的个头其实不是问题(再怎么大也超不过20nm),而是cross-linking
: efficiency 会是大问题。
: 如果这个对你们真的很重要的话,可以用GST-fusion protein + Glutathione-beads
50 mM) when binding to the Ni
beads, almost no non-specifical binding will be observed.
And his-tag is usually better than GST-tag: 1. it's small; 2. it can be used
for denatured protein.
【在 s******y 的大作中提到】
: 6xHis 不是一个好选择,因为非特异结合非常严重(其实也不是真的非特异,
: 而是细胞裂解液里的好多蛋白本身就能结合金属离子)
: 你说的copy number, 是指每个bead 上被固定的多肽的数目吧?这个应该说
: 是“表面浓度”。
: Antibody 的个头其实不是问题(再怎么大也超不过20nm),而是cross-linking
: efficiency 会是大问题。
: 如果这个对你们真的很重要的话,可以用GST-fusion protein + Glutathione-beads
b*t
17 楼
targeted
no annual fee
no annual fee
w*e
18 楼
Thanks! have you tried strept II tag BTW? bumped into it when googling
10-
used
【在 o*****r 的大作中提到】
: For the his-tagged protein, if you add imidazole in your sample (usually 10-
: 50 mM) when binding to the Ni
: beads, almost no non-specifical binding will be observed.
: And his-tag is usually better than GST-tag: 1. it's small; 2. it can be used
: for denatured protein.
10-
used
【在 o*****r 的大作中提到】
: For the his-tagged protein, if you add imidazole in your sample (usually 10-
: 50 mM) when binding to the Ni
: beads, almost no non-specifical binding will be observed.
: And his-tag is usually better than GST-tag: 1. it's small; 2. it can be used
: for denatured protein.
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