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细胞稳定转染求助

细胞稳定转染求助# Biology - 生物学

w*e2011-09-01 07:09

1 楼

我是女生，问事业和爱情。谢谢各位：）
太阳：[11宫] 水瓶26°04'
月亮：[01宫] 金牛06°55'
水星：[12宫] 双鱼06°59'
金星：[11宫] 双鱼02°25'
火星：[08宫] 射手07°29'
木星：[11宫] 水瓶28°39'
土星：[08宫] 射手08°50'
天王：[09宫] 射手21°40'
海王：[09宫] 摩羯05°06'
冥王：[07宫] 天蝎07°21' (逆行)
北交：[01宫] 金牛02°15'
上升：[01宫] 白羊13°44'
天顶：[10宫] 摩羯09°05'

s*s2011-09-01 07:09

2 楼

看到陈羽凡现在这个样子我都有点想骂白百合这个臭娘们了，就算已经离婚了，可是在
大众还不知道的时候就开始跟别人好，这把陈羽凡放在什么位置？现在好了，弄得陈羽
凡也退出娱乐圈了，可是退出娱乐圈就完事儿了吗？退出娱乐圈也挡不住这件事已经发
生已经被被人知道了，白百合倒是没什么，又是参加颁奖礼又是出演电视剧的，现在给
陈羽凡弄得可是够惨。
我都有点心疼了，可能是同病相怜吧，看到现在陈羽凡的样子就想到我当初被抛弃时候
的样子，不能说每天以泪洗面，但是借酒消愁这是每天都要做的事情。在娱乐新闻上看
到有人爆料陈羽凡整天的借酒消愁，现在竟然也跟狗仔干起来了，把人家汽车的窗户都
给砸了，后来都带着哭腔希望记者饶了自己，不要再说这件事了，毕竟是家丑。如果说
陈羽凡对这件事并没有上心的话那估计也做不出来这种举动吧？现在弄得又是天天喝酒
又是像狗仔求饶的，具体我都忘了说的什么了，但我知道很多话都是那种濒临“绝望”
时候才说出来的。从这件事上来看白百合真的把陈羽凡伤的不轻。

b*72011-09-01 07:09

3 楼

SHIPPING费去掉了.
PLANNED DELIVERY DATE从9/1 变成9/8了.
我的HP ORDER#是3059****.

b*82011-09-01 07:09

4 楼

新手，最近在做一个质粒的稳定转染至肝癌细胞，大概步骤如下，6孔板中转染，24小
时后按1:50的比例传至10cm dish中，（大约1~2万个细胞），再等24小时开始加药筛选
，没隔3天换液维持，至第9天前后开始出现大量细胞死亡，并出现镜下明显可见的
colony，至第12天左右出现肉眼下明显可见的colony，于是用黄色tips直接在肉眼下挑
取单个colony，分别转移至96孔板中培养，并逐渐放大至24孔板，然后进行鉴定。至今
挑了大概40个colony，仅有一个阳性，但是继续放大培养两代后阳性反应突然丢失。
现在我有两个问题,
1）阳性反应突然丢失的原因可能是什么？细胞不纯？阳性细胞被其他细胞取代？筛选
出colony并放大培养的最初几代过程中，是否一定不能中断选择药物？哪怕只有两三天
的中断？
2）在网上翻了些帖子，发现有的人会在挑出单个colony培养贴壁后在做有限稀释，挑
取单克隆，这样做是不是会是拿到真阳性克隆的机会更大？可不可以按照这样的思路来
做，先用我上面的挑取，培养并鉴定出一批（视运气好坏多少不等）有阳性反应的
colony（姑且认定这个colony里面含有我想要的稳定转染的细胞），再把这些colony的
细胞分别做有限稀释，最后分别鉴定每个单克隆，最终获得最优化的稳定转染细胞。
请高手指点，任何意见和建议都会给我很大帮助，先谢谢大家。

j*n2011-09-01 07:09

5 楼

蛮纠结的一个盘。
事业上属于能量表达都受阻，想aggressive却又压抑
爱情上感情丰富容易动感情的。。。。内容太多了。。。我仔细看看，明天再说吧。。。
好坏参半。

B*t2011-09-01 07:09

6 楼

你这是22号4点以前的还是以后的，HP说以后ａｒｅ　ｂｅｉｎｇ　ｃａｎｃｅｌｅｄ
，　也就是说，咳嗽在逐步进行，是慢性咳嗽，百日咳。

c*n2011-09-01 07:09

7 楼

我是用serial dilution做的稳定细胞转染
得到阳性细胞后曾经试过把G418的浓度降低一半
阳性虽然还在，但是表达量降低将近一半
查过网上论坛，发现这个是epigenetical modification
于是重新用高浓度的G418，再次得到高表达的阳性细胞。
所以取决于你转染的质粒对细胞的毒性，药物有可能会很重要，即使在你得到阳性细胞
后。

【在 b**********8 的大作中提到】

: 新手，最近在做一个质粒的稳定转染至肝癌细胞，大概步骤如下，6孔板中转染，24小
: 时后按1:50的比例传至10cm dish中，（大约1~2万个细胞），再等24小时开始加药筛选
: ，没隔3天换液维持，至第9天前后开始出现大量细胞死亡，并出现镜下明显可见的
: colony，至第12天左右出现肉眼下明显可见的colony，于是用黄色tips直接在肉眼下挑
: 取单个colony，分别转移至96孔板中培养，并逐渐放大至24孔板，然后进行鉴定。至今
: 挑了大概40个colony，仅有一个阳性，但是继续放大培养两代后阳性反应突然丢失。
: 现在我有两个问题,
: 1）阳性反应突然丢失的原因可能是什么？细胞不纯？阳性细胞被其他细胞取代？筛选
: 出colony并放大培养的最初几代过程中，是否一定不能中断选择药物？哪怕只有两三天
: 的中断？

j*n2011-09-01 07:09

8 楼

金星在双鱼又同时和海王，冥王有好相位，说明你把爱情看成一种灵魂性的东西，渴望
的是灵魂伴侣吧。金星和月亮又有好相位，估计有成为贤妻良母的潜质。太阳与木星的
合相也许象征着一种乐观积极有扩张力的人生观，可惜水星的两个负面相位阻碍了表达
，会有挫折感。水星双鱼也许有直观能力，却缺少逻辑和判断力。水星的三个正相位加
强了你的灵感，直觉，你很有灵魂渗透力，但要警惕非理性的判断。
总之，非常有灵性，感情也丰富，找一个与你般配的人不容易。

b*72011-09-01 07:09

9 楼

21号的.

【在 B*****t 的大作中提到】

: 你这是22号4点以前的还是以后的，HP说以后ａｒｅ　ｂｅｉｎｇ　ｃａｎｃｅｌｅｄ
: ，　也就是说，咳嗽在逐步进行，是慢性咳嗽，百日咳。

a*72011-09-01 07:09

10 楼

做过牛intramuscular adipocytes的immortalization，转染带抗G418的端粒酶，怕转
染效果不好连续转染两次，存活的细胞都抗G418，并且一段时间不加G418也不会改变抗
性。

w*e2011-09-01 07:09

11 楼

谢谢版大，“非常有灵性”不解，如何解释？

【在 j**n 的大作中提到】

: 金星在双鱼又同时和海王，冥王有好相位，说明你把爱情看成一种灵魂性的东西，渴望
: 的是灵魂伴侣吧。金星和月亮又有好相位，估计有成为贤妻良母的潜质。太阳与木星的
: 合相也许象征着一种乐观积极有扩张力的人生观，可惜水星的两个负面相位阻碍了表达
: ，会有挫折感。水星双鱼也许有直观能力，却缺少逻辑和判断力。水星的三个正相位加
: 强了你的灵感，直觉，你很有灵魂渗透力，但要警惕非理性的判断。
: 总之，非常有灵性，感情也丰富，找一个与你般配的人不容易。

h*r2011-09-01 07:09

12 楼

esimated ship date: 08/26/2011
Ship Via: ECON VALUE FRT
Ship Complete : No
看不懂啊，现在也没收到。什么是ECON VALUE FRT, 为什么又是NO.

【在 b********7 的大作中提到】

: SHIPPING费去掉了.
: PLANNED DELIVERY DATE从9/1 变成9/8了.
: 我的HP ORDER#是3059****.

b*82011-09-01 07:09

13 楼

多谢回复，能否提供您关于serial dilution的更详细的信息，比如什么时候dilution
，转染后第二天？还是如我帖子中描述的挑到阳性colony后再dilution？
另外，重新用高浓度的G418后再次得到高表达的阳性细胞，请问这个细胞和之前浓度降低一半表达量也降低一半的细胞是同一批吗？

【在 c**n 的大作中提到】

: 我是用serial dilution做的稳定细胞转染
: 得到阳性细胞后曾经试过把G418的浓度降低一半
: 阳性虽然还在，但是表达量降低将近一半
: 查过网上论坛，发现这个是epigenetical modification
: 于是重新用高浓度的G418，再次得到高表达的阳性细胞。
: 所以取决于你转染的质粒对细胞的毒性，药物有可能会很重要，即使在你得到阳性细胞
: 后。

w*e2011-09-01 07:09

14 楼

贴个占星之门的星盘，背景白色的比较容易看清楚
版大，事业上的能多解释两句吗？谢谢

。。

【在 j**n 的大作中提到】

: 蛮纠结的一个盘。
: 事业上属于能量表达都受阻，想aggressive却又压抑
: 爱情上感情丰富容易动感情的。。。。内容太多了。。。我仔细看看，明天再说吧。。。
: 好坏参半。

B*t2011-09-01 07:09

15 楼

２１号的都３０５９了？操。

c*n2011-09-01 07:09

16 楼

很久之前所以既不清楚了
但肯定是转染后过了好几天
用的是polyclonal的细胞作dilution
在dilution之前并没有经过挑阳性细胞这步
我用的是corning 的single cell cloning protocol
你google就能找到
是同一批细胞.

dilution
降低一半表达量也降低一半的细胞是同一批吗？

【在 b**********8 的大作中提到】

:
: 多谢回复，能否提供您关于serial dilution的更详细的信息，比如什么时候dilution
: ，转染后第二天？还是如我帖子中描述的挑到阳性colony后再dilution？
: 另外，重新用高浓度的G418后再次得到高表达的阳性细胞，请问这个细胞和之前浓度降低一半表达量也降低一半的细胞是同一批吗？

j*n2011-09-01 07:09

17 楼

就是有精神上的追求，对世界和人性有特殊的洞察力和感受力。
但因为大多数人不管哪个星座都偏向于肤浅，只注重眼前的事物与生活，你有一天可能
会发觉自己是孤独的也是幸运的。

【在 w*******e 的大作中提到】

: 谢谢版大，“非常有灵性”不解，如何解释？

c*t2011-09-01 07:09

18 楼

我的3055xxxx就从来没更新过

b*82011-09-01 07:09

19 楼

非常感谢

【在 c**n 的大作中提到】

: 很久之前所以既不清楚了
: 但肯定是转染后过了好几天
: 用的是polyclonal的细胞作dilution
: 在dilution之前并没有经过挑阳性细胞这步
: 我用的是corning 的single cell cloning protocol
: 你google就能找到
: 是同一批细胞.
:
: dilution
: 降低一半表达量也降低一半的细胞是同一批吗？

j*n2011-09-01 07:09

20 楼

有看到一个金火刑。我过几天再仔细看看吧。

【在 w*******e 的大作中提到】

: 贴个占星之门的星盘，背景白色的比较容易看清楚
: 版大，事业上的能多解释两句吗？谢谢
:
: 。。

b*72011-09-01 07:09

21 楼

这个也不一定是最后的更新. 可能没有任何消息, 9/1又快到了. 结果就一周一周往后
拖..

D*A2011-09-01 07:09

22 楼

the genome-inserted plasmid DNA may affected by the chromosome around...
this may silence your gene.
Use modified BAC if you want to have a really stable expression

w*e2011-09-01 07:09

23 楼

谢谢版大帮忙看星盘，2013年了。人穷，双手奉上仅有的一个包子：）

【在 j**n 的大作中提到】

: 有看到一个金火刑。我过几天再仔细看看吧。

f*l2011-09-01 07:09

24 楼

我的21号凌晨3点的时3055xxxx，有没有22号凌晨4点前的兄弟，看看21号到底出了多少
？

D*A2011-09-01 07:09

25 楼

BTW, the selection drug has to be always added into your culture medium...

u*s2011-09-01 07:09

26 楼

小8说了，包子不管用，努力灌水才是硬道理 :b

【在 w*******e 的大作中提到】

: 谢谢版大帮忙看星盘，2013年了。人穷，双手奉上仅有的一个包子：）

a*02011-09-01 07:09

27 楼

我的是21号早上大概6点这样吧我的是3056....
目前也没有更新。。。。。

【在 f****l 的大作中提到】

: 我的21号凌晨3点的时3055xxxx，有没有22号凌晨4点前的兄弟，看看21号到底出了多少
: ？

b*82011-09-01 07:09

28 楼

Many thanks.
Could you pls give more detailed information about BAC and stable
transfection? Or any literature would help me greatly.

【在 D**A 的大作中提到】

: the genome-inserted plasmid DNA may affected by the chromosome around...
: this may silence your gene.
: Use modified BAC if you want to have a really stable expression

j*n2011-09-01 07:09

29 楼

丫，不好意思，让你久等了。
不知道你是从事什么职业的，你对事物有比较强的洞察力，直觉，这点可以在职场上起
到作用。但就像上面说的，土星合火星，两大凶星合在一起难免有
火星与土星呈0度
从正面观点来看，这种结合拥有辛苦工作的能力、强大的耐力、不会随机应变，还
有在危难处境中仍勇气十足的特性。除非在天宫图上，这种结合处于良好的状态，否则
这个合相代表的是气愤、痛苦和怨恨的特性。负面情形会造成愤恨和暴力结合，这种气
愤是由于土星在涅和自我表达方面的挫折感。通常他们会忍住气愤却突然爆发出来。当
此合相的遭困，可能会造成骨折和其它的皮肤病。
另外一个不利的火星相位是金火刑，这个也是容易引发负面情绪和人际关系上的冲突的
，主要表现在男女关系上。
能把火气压一下就好了。

【在 w*******e 的大作中提到】

: 谢谢版大帮忙看星盘，2013年了。人穷，双手奉上仅有的一个包子：）

s*l2011-09-01 07:09

30 楼

我20号中午的怎么是3059xxxx?

s*g2011-09-01 07:09

31 楼

转染,挑单克隆是对的.
但只要培养就要加抗生素时刻筛选.(除了做实验时候,撤抗生素.)--"一定不能中断选择药物"

h*e2011-09-01 07:09

32 楼

月亮在土象金牛可能对金火刑有益
就是那种思想会纠结，但最后还是有个出口的情况

f*l2011-09-01 07:09

33 楼

那岂不是21号有可能上10万？？

【在 a*******0 的大作中提到】

: 我的是21号早上大概6点这样吧我的是3056....
: 目前也没有更新。。。。。

D*A2011-09-01 07:09

34 楼

search Tony Hyman in MPI-Dresden

【在 b**********8 的大作中提到】

:
: Many thanks.
: Could you pls give more detailed information about BAC and stable
: transfection? Or any literature would help me greatly.

l*g2011-09-01 07:09

35 楼

b*72011-09-01 07:09

36 楼

10万不算多吧.

【在 f****l 的大作中提到】

: 那岂不是21号有可能上10万？？

c*t2011-09-01 07:09

37 楼

这种epigenetical modification和转染的质粒有关吗?
我最近做的稳定表达的细胞也是培养一段时间(3~4周)后表达降低(没有加G418),但是我
以前建立的没有这种情况.

【在 c**n 的大作中提到】

s*g2011-09-01 07:09

38 楼

我的3054****, 29日凌晨更新过，再没动静。说是30号寄，1号到。 hp SMB 骗子。

c*r2011-09-01 07:09

39 楼

这玩意儿就是一个体力活儿。都是实验室常规。
做起来也简单。就是ls说的。你先不要挑clone。直接pool用药到足够cell，然后seed
到96孔板上。数好细胞数，大概是每个板放50个细胞，就是每个孔0.5个细胞的样子。
seed几个板，4-5个其实就够了。这样大概一共seed了200到250个细胞。还是要在药里
面长，也可以浓度减半。如果够狠，多seed几个板，正常浓度的药也能长起来的。然后
就是说confirm一下表达，挑表达量合适的留下几个clones就可以了

【在 b**********8 的大作中提到】

l*a2011-09-01 07:09

40 楼

same here, also 3059. 不知道hp什么意思，到底是寄还是cancel，太吊胃口了，
cancel的话，我直接ebay，amazon多花100就完了，省的操这份心。。。

【在 b********7 的大作中提到】

: SHIPPING费去掉了.
: PLANNED DELIVERY DATE从9/1 变成9/8了.
: 我的HP ORDER#是3059****.

b*82011-09-01 07:09

41 楼

seed
谢谢，你说的这个方法其实倒不错，请问有人这样做过吗？成功过吗？

【在 c******r 的大作中提到】

: 这玩意儿就是一个体力活儿。都是实验室常规。
: 做起来也简单。就是ls说的。你先不要挑clone。直接pool用药到足够cell，然后seed
: 到96孔板上。数好细胞数，大概是每个板放50个细胞，就是每个孔0.5个细胞的样子。
: seed几个板，4-5个其实就够了。这样大概一共seed了200到250个细胞。还是要在药里
: 面长，也可以浓度减半。如果够狠，多seed几个板，正常浓度的药也能长起来的。然后
: 就是说confirm一下表达，挑表达量合适的留下几个clones就可以了

p*r2011-09-01 07:09

42 楼

Order# 3054****.Just called 1-888-728-9985. She even didn't bother to check
order #. She said there will be 30,000 (13,000?) units arriving/shipping
tomorrow. If no shipment email by tomorrow, wait for 6-8 weeks.

f*l2011-09-01 07:09

43 楼

这个太吓人了，6-8w。

check

【在 p*******r 的大作中提到】

: Order# 3054****.Just called 1-888-728-9985. She even didn't bother to check
: order #. She said there will be 30,000 (13,000?) units arriving/shipping
: tomorrow. If no shipment email by tomorrow, wait for 6-8 weeks.

c*t2011-09-01 07:09

44 楼

fuck hp, stop bullshitting.

h*r2011-09-01 07:09

45 楼

为什么我用邮件地址跟密码永远都登陆不进账户？我只能用order number的那种看看状
态，但是无法看到什么运费啊之类的，只能看到以下内容，一直没有更新。
Purchase Order# HP Order# Order Date Order Status Planned
Delivery Date Planned
Ship Date

a*a2011-09-01 07:09

46 楼

reset password?

【在 h***r 的大作中提到】

: 为什么我用邮件地址跟密码永远都登陆不进账户？我只能用order number的那种看看状
: 态，但是无法看到什么运费啊之类的，只能看到以下内容，一直没有更新。
: Purchase Order# HP Order# Order Date Order Status Planned
: Delivery Date Planned
: Ship Date

h*r2011-09-01 07:09

47 楼

我也以为是密码错误。重新设置后还是登陆不了。你们用的什么连接登录的？

【在 a***a 的大作中提到】

: reset password?

N*w2011-09-01 07:09

48 楼

试试密码改简单点，不要用怪异字符，hehe

【在 h***r 的大作中提到】

: 我也以为是密码错误。重新设置后还是登陆不了。你们用的什么连接登录的？