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【求助】用低浓度PCR产物做第二轮PCR

【求助】用低浓度PCR产物做第二轮PCR# Biology - 生物学

n*q2011-11-23 08:11

1 楼

3天前要求看房，这小子说owner不让看，昨天看了特喜欢，晚上口头说给offer,第二天
agent 说owner 接受了别人offer, 比ask price low, 我们还准备给ask price offer. 我
一气之下给 listing agent 电话，人家说天天都让看的呀。我准备直接给listing
agent offer了。人家还会把buyer agent的 commission 给我。 closing fee 是不是
也是selleer 付呢？

C*32011-11-23 08:11

2 楼

听大家说了好长时间香港电影没落了，我都不以为意。现在终于表现得水落石出了，新
片少了，都没什么看的了，还能不是衰落吗。不知大家有木有这样的赶脚。。

t*z2011-11-23 08:11

3 楼

各位同仁，
本人最近纠结于这个技术问题：怎样以低浓度或者非特异PCR产物为模板再做一轮PCR，
以达到纯化和增强目标产物的目的？
两轮PCR用的是同样的引物（不是巢式PCR）。本人原先以为，第一轮的PCR产物已经相
当多了，而且和引物百分之百互补，虽然条带暗些，但是稍微拿那么0.几ul出来，怎么
也够做下一轮PCR了。但是实验结果往往差强人意，即便尝试优化条件也不见明显改善
。经过多次试验，我发现用原始引物做第二轮PCR，效率很低，往往失败；而用巢式引
物却几乎都能成功。样本有限，感受未必客观。
在此向请教各位有经验的同仁：用原始引物做第二轮PCR，果真效率很低吗？有什么办
法可以提高这样的PCR的效率呢？什么方法才是更加有效的提纯强化目标产物的方法呢？
多谢大家！

p*a2011-11-23 08:11

4 楼

别想了。无论如何你的agent钱照拿。closing fee怎么出看你和卖主怎么商量和你出价
的情况

【在 n**q 的大作中提到】

: 3天前要求看房，这小子说owner不让看，昨天看了特喜欢，晚上口头说给offer,第二天
: agent 说owner 接受了别人offer, 比ask price low, 我们还准备给ask price offer. 我
: 一气之下给 listing agent 电话，人家说天天都让看的呀。我准备直接给listing
: agent offer了。人家还会把buyer agent的 commission 给我。 closing fee 是不是
: 也是selleer 付呢？

x*o2011-11-23 08:11

5 楼

转的，觉得有道理
先说结论：
作为一个特殊文化意义上的“香港电影”这个概念，已经死掉了，基本是对历史的追溯
与概括，基本谈不上再有较大的更新。这个概念截止期没有明确界线。在我看来，9-7
只能算ICU，而且更多显现出来的是“果”而非“因”，《无间道》系列倒是可以看成
“香港电影”这一概念的最终挽歌。关于这一点，我在（如何评价《无间道》三部曲？
）下有具体阐述。
这个概念死掉，不是说它不再做电影了，或者说在电影界地位不重要了。这么多年的积
淀摆着，而且背后还有依旧庞大的娱乐业，香港仍然是一处电影重镇。而香港的电影人
依旧会在华语电影中占有一席之地，像杜琪峰为首的银河、许鞍华、林超贤等导演依然
保持着旺盛的创作力，并且也不时推出佳作。但这些都无法挽救香港电影这个概念的死
亡。为什么？听我慢慢道来。
旧时中国的电影首都应该是上海，但得益于大陆变局，正如纳粹肆虐使欧洲艺术家逃往
北美，不少电影人也前往香港。来的除了人才，更有资本，这些使得香港部分继承了旧
上海电影工业的衣钵。而香港虽然是在港英政府治下，但在相当长的阶段里，相对的自
由度都比海峡两岸的政权更为宽松。这些都促使香港电影产业兴起。
后来我们就看到了邵氏的做大。别看邵氏家大业大，旗下也是明星无数，其实邵氏拍片
比较省钱，跟现在这种烧钱拍片根本不能比。首先那些明星演员、导演都是邵氏员工，
靠工资过活的，管你人前多么风光，邵跑跑不多给你一个子儿你一点办法没有。你牛逼
你可以走啊，但出了邵氏也不好混，又有乖乖回来的，比如整天吐槽老板抠门的李翰祥
。而且邵氏是行业垂直垄断型企业，片场影院一把抓，有片场，拍片场地布景等花费可
以省不少，有影院，全产业联动，都是我的。再加上彼时观众对视觉工艺要求还不是特
别高，所以邵氏那些成本很低现在看起来“粗制滥造”的片子，一样有市场。就算票房
相对低一点有啥关系，成本这么低，回本压力小多了。而且香港片彼时在东南亚市场还
颇为吃香，有本埠做基底，外埠再卖一卖，日子还是比较好过的。
那么为什么香港片会在东南亚一带有市场？流行文化比较接近是一个方面。这还是要回
到前面说的香港的相对自由度，再加上高度的商业性，使得香港人拍片时既没有海峡两
岸的郑智负担，又会主动而有的放矢地针对市民阶层的口味开掘娱乐。以邵氏片为例，
你们以后后来王晶、周星驰的无厘头没下限，呵呵，看看邵氏武侠片，才知道什么叫脑
洞大开、节操洗地。这种以模糊而游动的道德标准为底线，在界限内肆无忌惮的“勇敢
”，是其他各方万万不及的。这种口味取向也为后面埋下了伏笔。
或许很多港片影迷提港片会以邵氏为正宗，但我是在八九十年代港片中长大的，所以八
九十年代的港片在我眼里可能地位会更高。为什么？这里要提到的就是香港电影新浪潮
了。邵氏虽然雄霸多年，但毕竟还是高度功利的商业指向，大片场经营更是把指标卡得
死死的，所以，虽不能说邵氏对香港电影的拍摄语言革新没贡献，但是相较它的江湖地
位，相对而言，贡献有限。而香港电影新浪潮则可以看成是一批少壮派影人带来的香港
电影语言的狂飙突进。谭家明、许鞍华、徐克等电影作者以突破性的姿态在电影形式和
内容上大举开拓。这次狂飙突进不仅是艺术上的，更是将一些当时看来前卫的手法与内
容推而广之，使得香港电影更加肆无忌惮。前面说到邵氏片虽然玩得狠，但邵氏的三观
其实仍是保守和传统的，电影拍摄方法还是相对守旧的，而经过新浪潮的冲击，香港电
影拍摄上玩得更high，内容上也越来越挑战传统底线。（顺便说一句，徐克的《蝶变》
我觉得一般，但《第一类型危险》是真的好，手法到精神上的刺激，high爆了）我是先
看的八九十年代港片，再看的老邵氏，最后补了一些新浪潮的课，新浪潮在中间带来的
美学变化很明显，这也带动了观众观赏口味的变化。而随着新浪潮而来的不止是电影形
式与内容之变，更是市场竞争的加剧。邵氏作为一个老片场，多少在这场狂飙突进里有
些守成了。本来邹文怀、何冠昌分出来的嘉禾就几乎可以分庭抗礼，80年代后一干其他
公司兴起，邵氏却仍坚持着片场产品。作品质量和新颖程度和这些新贵比，明显有所不
及。
而在这场激烈竞争中，大量中小公司涌现出来，融资、拍片方式更加灵活，内容上更无
拘束。香港电影在亚太市场真正达到高峰。到这时，“香港电影”这个动态概念才慢慢
定型，我把它归纳一下，大致有几个特征：
第一，肯定不用讲，香港片商投资，或以香港制作班底为主。
第二，以香港市民文化口味为主，融合有英国的欧美式中产阶级文化、广东地方文化、
香港本地民间文化，并对4-9前上海市民文化也有一定程度的继承，呈现出来的是杂糅
状态。
第三，以商业利益的追逐为终极目标，为达到此目标，底线可以无限放低。
这里的“放低”是中性含义，一方面是趣味上可以无限低俗，像有一阶段邵氏片无论必
要与否每片必有裸镜，如果这还不算难以接受，我们也可以拿好莱坞做个对比，同样是
狂热追逐商业利益，在美国的清教传统之下，《人肉叉烧包》、《乌鼠机密档案》中直
接表现对儿童的虐杀是无论如何都不会在主流影片中出现的。但香港电影对此的容忍度
比较高。
而在另一方面，这个“放低”可以理解为，为了赢得最大娱乐效果，香港电影可以怪招
频出，无名山村里的吃人魔王可以cosplay林肯，流氓地痞的生身父亲也可以是
Chairman Miao……这些固然会引起争议，但也使得香港电影呈现出无与伦比的创作活
力。后来常说的“无厘头”就是这种风格的部分总结。
第四，尽皆狂欢，如果不是喜剧，至少也会有喜剧因素。这一阶段香港电影哪怕是很悲
情的故事，像89年版的《人海孤鸿》，94年的《暴雨骄阳》都是不乏社会反思和道德劝
诫的苦情片，即便如此，片中仍不乏“查乳癌查舌癌”、“奶罩倒穿”等笑料。所有场
次，只要编导想要，只需一秒钟，统统变喜剧。这一点对我影响蛮大的。
第五，这是波德维尔提到过的，原话不记得了，大意是：即便香港电影呈现出高度量产
的状态，这些影片平均来看，并非完全的烂作，细看每一部要么在技法上要么在内容上
都会有些想法，但总体制作会因为赶时间而显得粗糙。所以港片往往呈现的是有佳句少
妙章的状态。
这话既可以理解为急功近利，也可以从积极的意义上理解：香港电影的主要班底，少有
学院科班出身的，大部分是仅受过速成培训，甚至速成培训都未经历直接在片场拜师学
艺摸爬滚打练出来的。这样出身的班底，虽然很少能提出什么理论，但手活儿极熟练，
个别混得不错的，脑子都很灵活，能想出一些匪夷所思的招数。所以虽然速度快，但东
西都还挺有个样子，甚至里面不乏亮点。
这五点大致就是我对“香港电影”在艺术呈现上的定义，它的成因可以从前面我提到的
大的脉络看出。
那么，香港电影是怎么衰落的？为什么会衰落？
有人粗制滥造太多，有人说黑帮控制，有人说97回归，有人说大经济环境不佳……都有
道理。
归结一下，时代变了。
其实我们回过头看看它成功的过程可以看出来，香港电影能成功是一个诸多原因促成的
产物。
幸运地站在海峡两岸之外，既没有太大郑智压力和负担，又吸收了人才和资金。
本土文化、郑智氛围都很宽松，而且对商业有着强烈的追逐意识。
但一切到了90年代中后期，事儿都变了。
1、影片的普遍制片成本提升，单靠本埠市场支撑不住，而大陆市场尚未成形，更谈不
上开放。
2、粗制滥造太多导致影片淤积，资金回笼成问题，本土经济不景气，台湾片商也在撤
资，缺乏金主。
3、周边重要电影市场，比如韩国，自身的电影产业发展迅猛，而且还设了国产片保护。
4、自身电影人才瞅准机会早早抽身，但造星断档，青黄不接，周润发、成龙、李连杰
（这个算出口转内销吧）纷纷投身好莱坞，，带来的空缺很能被填补。
5、上面这些原因造成的拍片量下降又直接导致原有片场师徒传承制实际破产——师父
自己都吃不饱呢，所以带来的是人才的全方位断档。别的不说，香港原来世界最强的电
影岗位——武术指导，你有见到多少新面孔吗？
香港电影人不能混吃等死啊，大家都想办法救市啊，这才有了《无间道》的应运而生。
但大家看这个系列可以看出来，片子是非常不错，但原来意义上的“香港电影”在这个
系列中基本荡然无存了。而且它这一个系列成功了，但并没有因此拯救香港电影，只是
带来的是随后一小段时间的跟风——题材、拍摄形式上统统跟风。中间虽然也不乏一些
能看的作品，但没有一部能达到《无间道》的成功，而在这个过程中，香港电影自身的
特质基本丧失了。
香港电影人怎么办呢？他们的目光瞄向了北方，中国大陆，这个正逐渐开放并兴起的新
市场。90年代合拍片还只是部分试水，到了这时候香港电影人已经是成批涌入大陆了。
有一个段子，一个朋友去见文隽，刚好一个香港编剧找文。编剧问他：文生，导演协会
已经开了普通话培训班，什么时候编剧协会也开一个？文隽有点尴尬，把那编剧敷衍几
句打发走了。跟90年代香港人来大陆排片不同，时代不一样了，大陆人不再是那个又土
又穷的表姐，土或许还是土，但穷——至少对于金主们来说，是一点都不穷了。
大量香港电影人在大陆获得了工作机会。我在这里要强调一下，这不是说大陆是香港电
影人的救世主，其实就是个工作机会。大陆毕竟熟谙商业电影拍摄法的人才还不够多，
这时候很需要拥有大量经验的香港人参与。而即使让香港人来操盘，也不是没有代价的
，你要在大陆拍片，并且要在大陆公映，你就得面对严苛的大陆%^&(大家都懂的）。更
何况香港人的口味跟大陆观众又有相当的区别，本来就不是最佳创作状态，又在高度限
制下开工，这样状态下出来的作品，你觉得还能叫“香港电影”么？
更何况大陆电影人也在慢慢自己成长，渐渐的，投资方发现，与其让香港人来拍，不如
试试大陆自己的导演，他们可能更了解大陆人的口味。从影片艺术水平上来讲，不好说
是耶非耶，但从商业成绩来看，香港人的“优势”也在逐渐消弭。哪怕是一些比较成功
已经成名的大导演，像陈可辛，从《如果·爱》开始，一直拍到《中国合伙人》才算第
一次真正在商业和口碑上赢得了大陆的认可。陈可辛这种文化接受力很强且血统多元一
早就倡导“亚洲电影”概念的作者尚且如此，你觉得其他人会更好多少么？
虽然大陆电影产业问题非常之多，但有资本的力量，并且也确实有一些有见识有能力的
企业与制作人在推动，“香港电影”这个概念逐渐消亡了，而标志着大陆、香港、台湾
乃至东南亚华人作者更大程度上融合的“华语电影”概念在这几年逐渐形成。香港仍然
是一块电影重镇，仍然有杜琪峰、许鞍华等作者，并且也不时会有个别新人涌现，但这
些成就已经是大“华语电影”的成就了。无论从地域人才的参与，还是电影内容的接近
，呈现出来的分别是电影作者的分别，而非大地域文化概念上的分别了。
消亡说起来令人伤感，但只要还有大批热爱电影的人仍然在保持创作，仍不时推出好作
品，你管它到底是“香港电影”还是“华语电影”呢？

【在 C***3 的大作中提到】

: 听大家说了好长时间香港电影没落了，我都不以为意。现在终于表现得水落石出了，新
: 片少了，都没什么看的了，还能不是衰落吗。不知大家有木有这样的赶脚。。

m*y2011-11-23 08:11

6 楼

you answered yourself. use nested pcr

呢？

【在 t*****z 的大作中提到】

: 各位同仁，
: 本人最近纠结于这个技术问题：怎样以低浓度或者非特异PCR产物为模板再做一轮PCR，
: 以达到纯化和增强目标产物的目的？
: 两轮PCR用的是同样的引物（不是巢式PCR）。本人原先以为，第一轮的PCR产物已经相
: 当多了，而且和引物百分之百互补，虽然条带暗些，但是稍微拿那么0.几ul出来，怎么
: 也够做下一轮PCR了。但是实验结果往往差强人意，即便尝试优化条件也不见明显改善
: 。经过多次试验，我发现用原始引物做第二轮PCR，效率很低，往往失败；而用巢式引
: 物却几乎都能成功。样本有限，感受未必客观。
: 在此向请教各位有经验的同仁：用原始引物做第二轮PCR，果真效率很低吗？有什么办
: 法可以提高这样的PCR的效率呢？什么方法才是更加有效的提纯强化目标产物的方法呢？

M*n2011-11-23 08:11

7 楼

如果没和buyer agent签任何东西，怎么知道是“你的”agent?

C*32011-11-23 08:11

8 楼

哈哈，这篇我觉得能写成这样，算是力作了。香港电影确实在发生巨大和根本性的转变，
有出现“华语电影”新片种的态势，香港电影原有的艺术特质在明显消失。
不过都说北京文化善侃，它的代表人物却刚刚出现，老舍看不见了，王朔的侃主要是写
出来的，现在最高水平的北京侃爷，就是你网名照中的这位人物——高晓松。

7

【在 x****o 的大作中提到】

: 转的，觉得有道理
: 先说结论：
: 作为一个特殊文化意义上的“香港电影”这个概念，已经死掉了，基本是对历史的追溯
: 与概括，基本谈不上再有较大的更新。这个概念截止期没有明确界线。在我看来，9-7
: 只能算ICU，而且更多显现出来的是“果”而非“因”，《无间道》系列倒是可以看成
: “香港电影”这一概念的最终挽歌。关于这一点，我在（如何评价《无间道》三部曲？
: ）下有具体阐述。
: 这个概念死掉，不是说它不再做电影了，或者说在电影界地位不重要了。这么多年的积
: 淀摆着，而且背后还有依旧庞大的娱乐业，香港仍然是一处电影重镇。而香港的电影人
: 依旧会在华语电影中占有一席之地，像杜琪峰为首的银河、许鞍华、林超贤等导演依然

m*22011-11-23 08:11

9 楼

NEVER EVER use the original pair for the 2nd round.
period.
end of discussion.
don't even think about it.
just remember.

呢？

【在 t*****z 的大作中提到】

n*q2011-11-23 08:11

10 楼

我没和agent 签任何东西。所以他不是exclusive agent

S*a2011-11-23 08:11

11 楼

狼是什么电影？

【在 C***3 的大作中提到】

t*z2011-11-23 08:11

12 楼

谢谢你的指点！你能告诉我原因吗？我自己觉得，使用原始引物做第二轮PCR，就相当
于第一轮PCR途中加入了新的反应试剂，按理说应该是可行的。结果不好，想必有什么
我不知道的生化上的道理吧。很想知道，能说一下吗？

【在 m**********2 的大作中提到】

: NEVER EVER use the original pair for the 2nd round.
: period.
: end of discussion.
: don't even think about it.
: just remember.
:
: 呢？

t*s2011-11-23 08:11

13 楼

确实可恶。如果没时间，说明一下，但是不能这么撒谎

C*32011-11-23 08:11

14 楼

有一个童话，也可以算做寓言，说有个小孩老说狼来了，等到狼真的来了，就没人来救
他了。

【在 S****a 的大作中提到】

: 狼是什么电影？

t*z2011-11-23 08:11

15 楼

我现在的实验结果，如果第二轮两边引物都用原始引物，则成功率较低，不过还是有一
些能够成功的。如果其中一个用原始引物而另一个用巢式引物，则成功率很高。两个都
用巢式引物自然也能成功。
我的这些引物大多没有相对应的巢式引物。要订购新的引物，毕竟有些费钱费时，如果
能借助现有的材料做出来，自然最好不过了。可不知有什么好办法。

i*k2011-11-23 08:11

16 楼

只要他用钥匙给你开门了就算。

【在 n**q 的大作中提到】

: 我没和agent 签任何东西。所以他不是exclusive agent

y*n2011-11-23 08:11

17 楼

学术界的观点一般是
97是分水岭
无间道是港片的回光返照
97之后随着大批香港导演的北上，我们熟悉的80-90年代的港片很难再出现普遍的复兴
坚持了10多年，杜大炮最后也不得不进行合拍片的尝试

7

【在 x****o 的大作中提到】

m*y2011-11-23 08:11

18 楼

do a gel band purification after your first round PCR

【在 t*****z 的大作中提到】

: 我现在的实验结果，如果第二轮两边引物都用原始引物，则成功率较低，不过还是有一
: 些能够成功的。如果其中一个用原始引物而另一个用巢式引物，则成功率很高。两个都
: 用巢式引物自然也能成功。
: 我的这些引物大多没有相对应的巢式引物。要订购新的引物，毕竟有些费钱费时，如果
: 能借助现有的材料做出来，自然最好不过了。可不知有什么好办法。

r*o2011-11-23 08:11

19 楼

递offer了就是跟agent签合同了吧，不然你们怎么递的offer？

C*32011-11-23 08:11

20 楼

看来大致也就酱紫乐，谁说影版没有专家。。呵呵～～

【在 y****n 的大作中提到】

: 学术界的观点一般是
: 97是分水岭
: 无间道是港片的回光返照
: 97之后随着大批香港导演的北上，我们熟悉的80-90年代的港片很难再出现普遍的复兴
: 坚持了10多年，杜大炮最后也不得不进行合拍片的尝试
:
: 7

D*a2011-11-23 08:11

21 楼

我试过用一端相同一端巢式的，效率挺高的。
但是我只是为了测序，测序完了就没有下一步了，测序结果很干净。但是不知道lz如果
还想干别的效果如何。
同想听听是什么道理。

g*j2011-11-23 08:11

22 楼

me too

【在 D*a 的大作中提到】

: 我试过用一端相同一端巢式的，效率挺高的。
: 但是我只是为了测序，测序完了就没有下一步了，测序结果很干净。但是不知道lz如果
: 还想干别的效果如何。
: 同想听听是什么道理。

m*22011-11-23 08:11

23 楼

no need to think about.
all you need to know is if you do that, 100% guaranted failure. you are not
here to figure out the "我不知道的生化上的道理". Get the PCR done, move on.

【在 t*****z 的大作中提到】

: 谢谢你的指点！你能告诉我原因吗？我自己觉得，使用原始引物做第二轮PCR，就相当
: 于第一轮PCR途中加入了新的反应试剂，按理说应该是可行的。结果不好，想必有什么
: 我不知道的生化上的道理吧。很想知道，能说一下吗？

w*n2011-11-23 08:11

24 楼

做过几次，没遇到这样的问题。

呢？

【在 t*****z 的大作中提到】

t*z2011-11-23 08:11

25 楼

这位朋友，你的论断与事实不符。

not

【在 m**********2 的大作中提到】

: no need to think about.
: all you need to know is if you do that, 100% guaranted failure. you are not
: here to figure out the "我不知道的生化上的道理". Get the PCR done, move on.

A*02011-11-23 08:11

26 楼

use nested PCR or
semi-nested "用一端相同一端巢式的"

A*02011-11-23 08:11

27 楼

In second thought... What about adding one primer first for couple of cycles
while baking turkey and then add another primer later... Anyway, I never
tried it.
Good luck & Happy thanksgiving.

s*a2011-11-23 08:11

28 楼

感觉有时候可以，有时候不可以。
不work的时候如果做个纯化再用做模板之后又可以了。
为啥？

【在 m**********2 的大作中提到】

: NEVER EVER use the original pair for the 2nd round.
: period.
: end of discussion.
: don't even think about it.
: just remember.
:
: 呢？

s*a2011-11-23 08:11

29 楼

感觉有时候可以，有时候不可以。
不work的时候如果做个纯化再用做模板之后又可以了。
为啥？

【在 m**********2 的大作中提到】

: NEVER EVER use the original pair for the 2nd round.
: period.
: end of discussion.
: don't even think about it.
: just remember.
:
: 呢？

t*z2011-11-23 08:11

30 楼

这个想法听上去不错啊，因为模板本身就这么长，单单一个引物没准也能扩增出来，不
会run-off了。哪天我可以试试。

cycles

【在 A********0 的大作中提到】

: In second thought... What about adding one primer first for couple of cycles
: while baking turkey and then add another primer later... Anyway, I never
: tried it.
: Good luck & Happy thanksgiving.

A*02011-11-23 08:11

31 楼

如果要试，试多几个cycles.

【在 t*****z 的大作中提到】

: 这个想法听上去不错啊，因为模板本身就这么长，单单一个引物没准也能扩增出来，不
: 会run-off了。哪天我可以试试。
:
: cycles

a*a2011-11-23 08:11

32 楼

拿0.几ul产物太多了，0.几ul搞不好ug级别的模板
纯化一下稀释1000倍至10万倍做个梯度试试。
我们pcr有杂带以后切胶纯化目的片段重新pcr没问题的
goodluck

b*n2011-11-23 08:11

33 楼

是这样的, 如果你第二轮继续用同一对primer的话, 第一轮的nonspecific product
will also be amplified. 所以一般来说, 第二轮应该至少换一个primer.

w*n2011-11-23 08:11

34 楼

我来给个可能解释吧，
首先，我用第一轮pcr产物做模板没遇到这样的问题，原因可能是上面同学说了，做了
胶回收纯化。
第一轮条带很弱的原因是因为引物特异性不好，那么pcr产物中有很多非特异性的产物
，如果不纯化目的条带，非特异性的产物在第二轮会竞争消耗掉引物，所以仍然得不到
加强的目的产物。

呢？

【在 t*****z 的大作中提到】

z*92011-11-23 08:11

35 楼

我也遇到同样的情况，我想，可不可以通过增加第二轮PCR的特异性，例如，升高
anneal tm，个人想法而已，还没有实践过，

t*z2011-11-23 08:11

36 楼

谢谢各位的提议！这两天我又做了一系列实验，试图提高两边都是原始引物的情况的扩
增效率，同时也做了几组一边原始一边巢式的。我目前发现：延长失活初始时间没用（
我原先设想长时间高温可以破坏DNA末端的二级结构）；延长延伸时间没用；增加模板
量有用（条带变深了）；增加反应循环数没用；降低温度没用（用的温度都高于理论Tm
）；增加镁离子没用（反而增加非特异扩增），改变缓冲液的种类没用（比如用Cl和用
SO4的）。我打算试试直接纯化和切胶回收。
大家的提议，我会陆续试试看！

m*22011-11-23 08:11

37 楼

why do yu want to do all these?
it is much easier to get another pair of primers.

Tm

【在 t*****z 的大作中提到】

: 谢谢各位的提议！这两天我又做了一系列实验，试图提高两边都是原始引物的情况的扩
: 增效率，同时也做了几组一边原始一边巢式的。我目前发现：延长失活初始时间没用（
: 我原先设想长时间高温可以破坏DNA末端的二级结构）；延长延伸时间没用；增加模板
: 量有用（条带变深了）；增加反应循环数没用；降低温度没用（用的温度都高于理论Tm
: ）；增加镁离子没用（反而增加非特异扩增），改变缓冲液的种类没用（比如用Cl和用
: SO4的）。我打算试试直接纯化和切胶回收。
: 大家的提议，我会陆续试试看！

d*i2011-11-23 08:11

38 楼

第一轮产物泡脚，在你目的片段预期大小的位置切胶回收，胶切取的范围可以稍微大一
些，纯化后再做第二轮用梯度PCR。