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怎么研究能进细胞核的蛋白质

怎么研究能进细胞核的蛋白质# Biology - 生物学

i*i2011-12-04 08:12

1 楼

Ned Stark would dig this

t*g2011-12-04 08:12

2 楼

正在研究一种被研究得不多的protein, 不少cancer cell line都表达这种蛋白质，但
protein level并不高。当我overexpress tagged protein之后，发现它能进入
nucleus。我生物刚入门，不清楚这种能进入nucleus是不是个big deal。有些疑问：
1）我用来分cytoplasmic and nuclear proteins的protocol，我的同事质疑我能不能
tell到底这个蛋白质能进nucleus还是membrane. 我用的是在abcam上找到的protocol,
Buffer A (cyto)
10 mM HEPES, 1.5 mM MgCl2, 10 mM KCl, 0.5 mM DTT,
0.05% NP40 (or 0.05% Igepal or Tergitol) pH 7.9
Buffer B (nucl)
5 mM HEPES, 1.5 mM MgCl2, 0.2 mM EDTA, 0.5 mM DTT, 150mM NaCl
26% glycerol (v/v), pH 7.9
2）接下来该怎么做？ immunofluorescence? 还是co-IP with the nuclear fraction
to find associated proteins? 可一般用来分nuclear fraction的buffer盐分含量
都很高，没法做IP啊。
希望各位不吝赐教，不胜感激！如果有更好的protocol，特别是允许做co-IP的，就更
好了。

i*i2011-12-04 08:12

3 楼

【在 i**i 的大作中提到】

: Ned Stark would dig this

m*52011-12-04 08:12

4 楼

首先，这个蛋白的功能分类是什么？如果是transcription factor那么进核很正常
主要还是看之前对这个蛋白质的功能分类和报道才知道是不是big deal。
其次，我觉得IF可以放在第一步做，分核质的protocol经常有假阳性假阴性分不干净，反而不如显微镜下看结果可靠。
还有楼主internal control用的是什么？一般用tublin作cyto的control，这个比较可靠。
不过核蛋白control大都不可靠，即使有leakage往往也看不出来

w*w2011-12-04 08:12

5 楼

团队的力量很强大
合成的力量很强大
同时赞一下姐妹花~~

【在 i**i 的大作中提到】

: Ned Stark would dig this

t*g2011-12-04 08:12

6 楼

谢谢回复。这个蛋白是一种tyrosine kinase. 做IF的话我必须要用overexpress的蛋
白，因为细胞本身这种蛋白量很少。（如果overexpress能进nucleus就能相信原来的
这种蛋白一定能进nucleus吗？）
nuclear internal control用的是lamin A/C。

i*i2011-12-04 08:12

7 楼

Skyrim- Peter Hollens & Lindsey Stirling

【在 w***w 的大作中提到】

:
: 团队的力量很强大
: 合成的力量很强大
: 同时赞一下姐妹花~~

b*s2011-12-04 08:12

8 楼

transcription factor没有核定位sequence，一般通过什么机制进核？
protein complex还是有未知的signal sequence？

，反而不如显微镜下看结果可靠。
可靠。

【在 m******5 的大作中提到】

: 首先，这个蛋白的功能分类是什么？如果是transcription factor那么进核很正常
: 主要还是看之前对这个蛋白质的功能分类和报道才知道是不是big deal。
: 其次，我觉得IF可以放在第一步做，分核质的protocol经常有假阳性假阴性分不干净，反而不如显微镜下看结果可靠。
: 还有楼主internal control用的是什么？一般用tublin作cyto的control，这个比较可靠。
: 不过核蛋白control大都不可靠，即使有leakage往往也看不出来