m*u
2 楼
☆─────────────────────────────────────☆
smiling85 (奥特曼在打小怪兽) 于 (Mon Aug 3 19:37:53 2009, 美东) 提到:
加州是块好地方，常晴，又不至于太热、太干，不湿热，自然没什么蚊虫，自打来了以
后，一直列为首要优点之一……apartment里常见一点的，顶多就是蜘蛛，和踪着垃圾
的一点小飞虫而已。。。
现在诡异的问题是：家里突然出现几十只苍蝇！！！
昨天晚上开始，先是发现有一、两只在飞，我和LD循迹去找，才发现除了飞着的以外，
在客厅的阳台窗和厨房的小窗上还散落停靠着许多，昨天共计打死8只。
今天下午回家，继续看到有在飞的苍蝇，循迹去找，在前一天的两个窗户上发现更多的
！基本上我们两个打了将近一个小时，怎么都有20只了，没有再计算了……
1、在当前的apartment住了近一年了，从没见过一只苍蝇或蚊子，从来没有。
2、在当前的状态下，家里也没有添置任何什么特殊的东西或食物。
3、在当前的状态下，家里也没有什么门户大开，常年开着的窗户、闭着的纱窗，有点
小缝缝，也早就一直如此了。
5、这些苍蝇的特
smiling85 (奥特曼在打小怪兽) 于 (Mon Aug 3 19:37:53 2009, 美东) 提到:
加州是块好地方，常晴，又不至于太热、太干，不湿热，自然没什么蚊虫，自打来了以
后，一直列为首要优点之一……apartment里常见一点的，顶多就是蜘蛛，和踪着垃圾
的一点小飞虫而已。。。
现在诡异的问题是：家里突然出现几十只苍蝇！！！
昨天晚上开始，先是发现有一、两只在飞，我和LD循迹去找，才发现除了飞着的以外，
在客厅的阳台窗和厨房的小窗上还散落停靠着许多，昨天共计打死8只。
今天下午回家，继续看到有在飞的苍蝇，循迹去找，在前一天的两个窗户上发现更多的
！基本上我们两个打了将近一个小时，怎么都有20只了，没有再计算了……
1、在当前的apartment住了近一年了，从没见过一只苍蝇或蚊子，从来没有。
2、在当前的状态下，家里也没有添置任何什么特殊的东西或食物。
3、在当前的状态下，家里也没有什么门户大开，常年开着的窗户、闭着的纱窗，有点
小缝缝，也早就一直如此了。
5、这些苍蝇的特
p*1
3 楼
两个我们每天见到的普通人，他们为寻找一个能说上话的人，历经千难万险和千山万
水，演绎了一幕幕动人心魄的故事；这两个寻找者是姐弟俩，一个在离婚，一个在结婚。
一部类似《一次别离》的中国电影《一句顶一万句》，日前在河南黄河边拍摄完成。
电影取材于刘震云小说《一句顶一万句》的后半部分——“回延津记”，执导这部
电影的是他的女儿刘雨霖。
刘雨霖曾获得奥斯卡短片奖
刘雨霖有比“刘震云女儿”更重要的标签。2014年，27岁的刘雨霖，凭其导演的电
影短片《门神》（Door God），获得奥斯卡（短片）奖，是中国大陆第一个获得奥斯卡
奖的导演。《门神》同时入围了法国戛纳电影节、日本东京电影节、意大利圣兰托电影
节、美国百慕大电影节、金棕榈电影节等50多个知名电影节，获得了包括最佳短片、最
佳导演、最佳剧本、最佳女演员、最受观众欢迎奖、评委会大奖等10多个国际奖项。
2014年导演获得奥斯卡短片奖2014年导演获得奥斯卡短片奖
刘雨霖毕业于纽约大学电影学院研究生院。纽约大学电影学院是世界公认的最好的
电影学府之一，培养过众多世界闻名的导演，如奥利弗·斯通、马丁·斯科西斯、伍迪
·艾伦、科恩兄弟、斯派克·李，及《哈利·波特》的导演克里斯·哥伦布，还有华人
导演李安。这些导演都曾被提名或获得过奥斯卡奖。
电影拍摄期间，受到国际广泛关注
导演与《一句顶一万句》的意大利文译者帕特里西亚·里贝拉蒂（Patrizia Liberati
）在拍摄现场导演与《一句顶一万句》的意大利文译者帕特里西亚·里贝拉蒂（
Patrizia Liberati）在拍摄现场
导演与《一句顶一万句》的德文译者米歇尔·康·阿克曼（Michael Kahn-Ackermann）
在拍摄现场导演与《一句顶一万句》的德文译者米歇尔·康·阿克曼（Michael Kahn-
Ackermann）在拍摄现场
导演与《一句顶一万句》的日文译者水野卫子（みす__の えいこ）在拍摄现场导演与
《一句顶一万句》的日文译者水野卫子（みす__の えいこ）在拍摄现场
《一句顶一万句》是刘震云的扛鼎之作，曾获得过第八届茅盾文学奖，并被翻译成
英文、法文、德文、意大利文、西班牙文、瑞典文、阿拉伯文、日文、韩文等20多种文
字，具有广泛的国际影响。
由于原著的国际影响力，及导演获得过奥斯卡奖，影片拍摄期间，已引起广泛的国
际关注，众多国际影人及专家前来河南拍摄地探班。
刘雨霖对记者说，她之所以要拍摄《一句顶一万句》，是因为这两个普通人，为了
寻找说一句话的人，他们的渴望，他们的情感，被人忽略了。这些渴望和情感，其惊心
动魄的程度，不亚于伊拉克战争和叙利亚战争，只是藏在他们内心深处，又无处诉说。
现在我用电影的方式，替他们说出来了。这是我拍电影的目的。
记者问刘雨霖对目前中国电影的看法，她说，中国观众的观赏水平在不断提高，观
赏习惯在不断改变，他们越来越喜欢看有内容的电影，动人的电影，深入的电影，走心
的电影，这是令人欣喜的。其实，世界上只有两部电影，一部是好电影，一部是不好的
电影，我希望能拍出前者，即跟观众交心的电影。
刘雨霖曾这样评价父亲刘震云“刘老师对我的影响是无形的，他会告诉我该怎么看
待这个世界，怎么去观察生活，他的作品关注那些经常被我们忽略的人物和情感，故事
中人物关系和架构有自己的风格，这种东西对我影响比较大。”
水，演绎了一幕幕动人心魄的故事；这两个寻找者是姐弟俩，一个在离婚，一个在结婚。
一部类似《一次别离》的中国电影《一句顶一万句》，日前在河南黄河边拍摄完成。
电影取材于刘震云小说《一句顶一万句》的后半部分——“回延津记”，执导这部
电影的是他的女儿刘雨霖。
刘雨霖曾获得奥斯卡短片奖
刘雨霖有比“刘震云女儿”更重要的标签。2014年，27岁的刘雨霖，凭其导演的电
影短片《门神》（Door God），获得奥斯卡（短片）奖，是中国大陆第一个获得奥斯卡
奖的导演。《门神》同时入围了法国戛纳电影节、日本东京电影节、意大利圣兰托电影
节、美国百慕大电影节、金棕榈电影节等50多个知名电影节，获得了包括最佳短片、最
佳导演、最佳剧本、最佳女演员、最受观众欢迎奖、评委会大奖等10多个国际奖项。
2014年导演获得奥斯卡短片奖2014年导演获得奥斯卡短片奖
刘雨霖毕业于纽约大学电影学院研究生院。纽约大学电影学院是世界公认的最好的
电影学府之一，培养过众多世界闻名的导演，如奥利弗·斯通、马丁·斯科西斯、伍迪
·艾伦、科恩兄弟、斯派克·李，及《哈利·波特》的导演克里斯·哥伦布，还有华人
导演李安。这些导演都曾被提名或获得过奥斯卡奖。
电影拍摄期间，受到国际广泛关注
导演与《一句顶一万句》的意大利文译者帕特里西亚·里贝拉蒂（Patrizia Liberati
）在拍摄现场导演与《一句顶一万句》的意大利文译者帕特里西亚·里贝拉蒂（
Patrizia Liberati）在拍摄现场
导演与《一句顶一万句》的德文译者米歇尔·康·阿克曼（Michael Kahn-Ackermann）
在拍摄现场导演与《一句顶一万句》的德文译者米歇尔·康·阿克曼（Michael Kahn-
Ackermann）在拍摄现场
导演与《一句顶一万句》的日文译者水野卫子（みす__の えいこ）在拍摄现场导演与
《一句顶一万句》的日文译者水野卫子（みす__の えいこ）在拍摄现场
《一句顶一万句》是刘震云的扛鼎之作，曾获得过第八届茅盾文学奖，并被翻译成
英文、法文、德文、意大利文、西班牙文、瑞典文、阿拉伯文、日文、韩文等20多种文
字，具有广泛的国际影响。
由于原著的国际影响力，及导演获得过奥斯卡奖，影片拍摄期间，已引起广泛的国
际关注，众多国际影人及专家前来河南拍摄地探班。
刘雨霖对记者说，她之所以要拍摄《一句顶一万句》，是因为这两个普通人，为了
寻找说一句话的人，他们的渴望，他们的情感，被人忽略了。这些渴望和情感，其惊心
动魄的程度，不亚于伊拉克战争和叙利亚战争，只是藏在他们内心深处，又无处诉说。
现在我用电影的方式，替他们说出来了。这是我拍电影的目的。
记者问刘雨霖对目前中国电影的看法，她说，中国观众的观赏水平在不断提高，观
赏习惯在不断改变，他们越来越喜欢看有内容的电影，动人的电影，深入的电影，走心
的电影，这是令人欣喜的。其实，世界上只有两部电影，一部是好电影，一部是不好的
电影，我希望能拍出前者，即跟观众交心的电影。
刘雨霖曾这样评价父亲刘震云“刘老师对我的影响是无形的，他会告诉我该怎么看
待这个世界，怎么去观察生活，他的作品关注那些经常被我们忽略的人物和情感，故事
中人物关系和架构有自己的风格，这种东西对我影响比较大。”
r*5
4 楼
以前没有做过这方面的，特像大家请教，谢过了 ：）
跟别人要了个他自己建的载体， 没有全部序列，只有酶切位点那部分的序列， 我也不
知道转录起始点在哪？ 我想做的是： 把我的蛋白CDNA 序列从起始密码到终止密码拷
贝过来， 再在CDNA 序列前加上KOZAC 序列， 最后在两端加上酶切位点和保护性碱基
就好了？ 这样对么？
可是怎么样才能保证没有移码呢？ 请各位指教啊？
我要用此质粒做转基因老鼠，已经费掉１万块了，如果再不成功，就惨了， 谢谢各位
。
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。
g*9
5 楼
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【在 C**K 的大作中提到】
: 要給cat sitter用的....
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a*d
6 楼
不清楚具体质粒结构，不过如果只是过表达一个蛋白，没有另外fusion其他tag或者GFP
fragment的话，你这样操作就够了，不需要担心移码问题。如果你另外fusion GFP或
者其他tag，则需要考虑表达的cDNA和连接的tag in frame。
fragment的话，你这样操作就够了，不需要担心移码问题。如果你另外fusion GFP或
者其他tag，则需要考虑表达的cDNA和连接的tag in frame。
C*K
7 楼
對, 就是這個, 謝謝!
只是多了點...
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s*y
8 楼
把质粒从头到尾测个续不就完了么？你既然知道部分序列，用它来设计引物
就好了，或者用你克隆进去的序列来设计引物。然后一段接一段的设计引物，
直接把全序列测完为止
还有，你可以把质粒先用来短暂转染细胞来表达蛋白么？如果可以的话那就更
简单了，表达之后用western blot 测一下，如果能够和抗体特异反应就说明
氨基酸序列是对的，再看看大小对不对，就好了。
【在 r*****5 的大作中提到】
: 以前没有做过这方面的，特像大家请教，谢过了 ：）
: 跟别人要了个他自己建的载体， 没有全部序列，只有酶切位点那部分的序列， 我也不
: 知道转录起始点在哪？ 我想做的是： 把我的蛋白CDNA 序列从起始密码到终止密码拷
: 贝过来， 再在CDNA 序列前加上KOZAC 序列， 最后在两端加上酶切位点和保护性碱基
: 就好了？ 这样对么？
: 可是怎么样才能保证没有移码呢？ 请各位指教啊？
: 我要用此质粒做转基因老鼠，已经费掉１万块了，如果再不成功，就惨了， 谢谢各位
: 。
就好了，或者用你克隆进去的序列来设计引物。然后一段接一段的设计引物，
直接把全序列测完为止
还有，你可以把质粒先用来短暂转染细胞来表达蛋白么？如果可以的话那就更
简单了，表达之后用western blot 测一下，如果能够和抗体特异反应就说明
氨基酸序列是对的，再看看大小对不对，就好了。
【在 r*****5 的大作中提到】
: 以前没有做过这方面的，特像大家请教，谢过了 ：）
: 跟别人要了个他自己建的载体， 没有全部序列，只有酶切位点那部分的序列， 我也不
: 知道转录起始点在哪？ 我想做的是： 把我的蛋白CDNA 序列从起始密码到终止密码拷
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: 就好了？ 这样对么？
: 可是怎么样才能保证没有移码呢？ 请各位指教啊？
: 我要用此质粒做转基因老鼠，已经费掉１万块了，如果再不成功，就惨了， 谢谢各位
: 。
g*9
9 楼
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【在 C**K 的大作中提到】
: 對, 就是這個, 謝謝!
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【在 C**K 的大作中提到】
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r*5
10 楼
谢谢你的指教，
我没有融合其他蛋白，就是一个蛋白，那像KOZAK 序列多一个少一个碱基什么的，也没
有什么大问题，对么？
我老板也不懂，我上次建好质粒去做老鼠了，结果一个阳性老鼠也没有，我老板就一直
在问我有没有保证移码没有发生，我就心虚了啊，哈
我没有融合其他蛋白，就是一个蛋白，那像KOZAK 序列多一个少一个碱基什么的，也没
有什么大问题，对么？
我老板也不懂，我上次建好质粒去做老鼠了，结果一个阳性老鼠也没有，我老板就一直
在问我有没有保证移码没有发生，我就心虚了啊，哈
r*5
11 楼
谢谢你的指教，
我没有融合其他蛋白，就是一个蛋白，那像KOZAK 序列多一个少一个碱基什么的，也没
有什么大问题，对么？
我老板也不懂，我上次建好质粒去做老鼠了，结果一个阳性老鼠也没有，我老板就一直
在问我有没有保证移码没有发生，我就心虚了啊，哈
我没有融合其他蛋白，就是一个蛋白，那像KOZAK 序列多一个少一个碱基什么的，也没
有什么大问题，对么？
我老板也不懂，我上次建好质粒去做老鼠了，结果一个阳性老鼠也没有，我老板就一直
在问我有没有保证移码没有发生，我就心虚了啊，哈
r*5
12 楼
sunnyday,谢谢你，
问题就在于我们这个载体只在活体肺里才高表达，我用好多细胞做过暂转染细胞来表达
，都没有成功，烦啊。
质粒建好后，也测序了，我插入的序列也对，可是不知道为什么没有阳性老鼠
【在 s******y 的大作中提到】
: 把质粒从头到尾测个续不就完了么？你既然知道部分序列，用它来设计引物
: 就好了，或者用你克隆进去的序列来设计引物。然后一段接一段的设计引物，
: 直接把全序列测完为止
: 还有，你可以把质粒先用来短暂转染细胞来表达蛋白么？如果可以的话那就更
: 简单了，表达之后用western blot 测一下，如果能够和抗体特异反应就说明
: 氨基酸序列是对的，再看看大小对不对，就好了。
问题就在于我们这个载体只在活体肺里才高表达，我用好多细胞做过暂转染细胞来表达
，都没有成功，烦啊。
质粒建好后，也测序了，我插入的序列也对，可是不知道为什么没有阳性老鼠
【在 s******y 的大作中提到】
: 把质粒从头到尾测个续不就完了么？你既然知道部分序列，用它来设计引物
: 就好了，或者用你克隆进去的序列来设计引物。然后一段接一段的设计引物，
: 直接把全序列测完为止
: 还有，你可以把质粒先用来短暂转染细胞来表达蛋白么？如果可以的话那就更
: 简单了，表达之后用western blot 测一下，如果能够和抗体特异反应就说明
: 氨基酸序列是对的，再看看大小对不对，就好了。
a*d
13 楼
从ATG开始序列一致的话，不会有移码发生。KOZAK序列改变不会导致移码的。另外应该
像SUNY讲得那样，先做个简单的transfection，看看蛋白表达是否正常。然后再去做老
鼠。
【在 r*****5 的大作中提到】
: 谢谢你的指教，
: 我没有融合其他蛋白，就是一个蛋白，那像KOZAK 序列多一个少一个碱基什么的，也没
: 有什么大问题，对么？
: 我老板也不懂，我上次建好质粒去做老鼠了，结果一个阳性老鼠也没有，我老板就一直
: 在问我有没有保证移码没有发生，我就心虚了啊，哈
像SUNY讲得那样，先做个简单的transfection，看看蛋白表达是否正常。然后再去做老
鼠。
【在 r*****5 的大作中提到】
: 谢谢你的指教，
: 我没有融合其他蛋白，就是一个蛋白，那像KOZAK 序列多一个少一个碱基什么的，也没
: 有什么大问题，对么？
: 我老板也不懂，我上次建好质粒去做老鼠了，结果一个阳性老鼠也没有，我老板就一直
: 在问我有没有保证移码没有发生，我就心虚了啊，哈
s*y
14 楼
我觉得你最好把限制酶之前的序列也测一下（自己设计一个引物，倒过来往上游
测）
一般而言，要保证不移码的话，最好是这样：
1。放kozak sequence,
2. 在kozak sequence 之前的编码不要有ATG, 而最好有stop codon.
【在 r*****5 的大作中提到】
: sunnyday,谢谢你，
: 问题就在于我们这个载体只在活体肺里才高表达，我用好多细胞做过暂转染细胞来表达
: ，都没有成功，烦啊。
: 质粒建好后，也测序了，我插入的序列也对，可是不知道为什么没有阳性老鼠
测）
一般而言，要保证不移码的话，最好是这样：
1。放kozak sequence,
2. 在kozak sequence 之前的编码不要有ATG, 而最好有stop codon.
【在 r*****5 的大作中提到】
: sunnyday,谢谢你，
: 问题就在于我们这个载体只在活体肺里才高表达，我用好多细胞做过暂转染细胞来表达
: ，都没有成功，烦啊。
: 质粒建好后，也测序了，我插入的序列也对，可是不知道为什么没有阳性老鼠
r*5
15 楼
请问kozak sequence不是应该放在要表达的蛋白的ATG 之前么？就是的放在要表达的蛋
白的ATG的左面，对么
2. 在kozak sequence 之前的编码不要有ATG, 而最好有stop codon.
那这个stop codon是做什么的啊，
问题是我测载体的序列，测完了该怎么分析呢？ 我也不知道标准序列，很是郁闷
【在 s******y 的大作中提到】
: 我觉得你最好把限制酶之前的序列也测一下（自己设计一个引物，倒过来往上游
: 测）
: 一般而言，要保证不移码的话，最好是这样：
: 1。放kozak sequence,
: 2. 在kozak sequence 之前的编码不要有ATG, 而最好有stop codon.
白的ATG的左面，对么
2. 在kozak sequence 之前的编码不要有ATG, 而最好有stop codon.
那这个stop codon是做什么的啊，
问题是我测载体的序列，测完了该怎么分析呢？ 我也不知道标准序列，很是郁闷
【在 s******y 的大作中提到】
: 我觉得你最好把限制酶之前的序列也测一下（自己设计一个引物，倒过来往上游
: 测）
: 一般而言，要保证不移码的话，最好是这样：
: 1。放kozak sequence,
: 2. 在kozak sequence 之前的编码不要有ATG, 而最好有stop codon.
s*y
16 楼
Kozak sequence 的确就是和你的蛋白的ATG 融合在一起的。
Kozak sequence 之前的stop codon 可以保证前面的序列如果不小心导致了蛋白
翻译到了那里肯定会被切断而不会干扰你后面的序列
【在 r*****5 的大作中提到】
: 请问kozak sequence不是应该放在要表达的蛋白的ATG 之前么？就是的放在要表达的蛋
: 白的ATG的左面，对么
: 2. 在kozak sequence 之前的编码不要有ATG, 而最好有stop codon.
: 那这个stop codon是做什么的啊，
: 问题是我测载体的序列，测完了该怎么分析呢？ 我也不知道标准序列，很是郁闷
Kozak sequence 之前的stop codon 可以保证前面的序列如果不小心导致了蛋白
翻译到了那里肯定会被切断而不会干扰你后面的序列
【在 r*****5 的大作中提到】
: 请问kozak sequence不是应该放在要表达的蛋白的ATG 之前么？就是的放在要表达的蛋
: 白的ATG的左面，对么
: 2. 在kozak sequence 之前的编码不要有ATG, 而最好有stop codon.
: 那这个stop codon是做什么的啊，
: 问题是我测载体的序列，测完了该怎么分析呢？ 我也不知道标准序列，很是郁闷
r*5
17 楼
好的，非常感谢您的指教， 看看我这次能不能成功 ：）
w*n
18 楼
没有转基因阳性小鼠，还是检不到蛋白表达？
【在 r*****5 的大作中提到】
: sunnyday,谢谢你，
: 问题就在于我们这个载体只在活体肺里才高表达，我用好多细胞做过暂转染细胞来表达
: ，都没有成功，烦啊。
: 质粒建好后，也测序了，我插入的序列也对，可是不知道为什么没有阳性老鼠
【在 r*****5 的大作中提到】
: sunnyday,谢谢你，
: 问题就在于我们这个载体只在活体肺里才高表达，我用好多细胞做过暂转染细胞来表达
: ，都没有成功，烦啊。
: 质粒建好后，也测序了，我插入的序列也对，可是不知道为什么没有阳性老鼠
r*5
19 楼
没有阳性小老鼠，GENE－TYPING 没有发现阳性的 ：（
【在 w******n 的大作中提到】
: 没有转基因阳性小鼠，还是检不到蛋白表达？
【在 w******n 的大作中提到】
: 没有转基因阳性小鼠，还是检不到蛋白表达？
s*y
20 楼
如果genotype 都没有通过的话，那就和移码不移码没有关系，而是你们的基因
根本就没有成功插入
【在 r*****5 的大作中提到】
: 没有阳性小老鼠，GENE－TYPING 没有发现阳性的 ：（
根本就没有成功插入
【在 r*****5 的大作中提到】
: 没有阳性小老鼠，GENE－TYPING 没有发现阳性的 ：（
r*5
21 楼
谢谢指导，可是我们有很多小老鼠啊，请问什么原因可以导致阳性率这么低呢？ 做转
基因的人也很有经验的啊，
基因的人也很有经验的啊，
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13% misconduct had witnessed in UK BMJ submitting authorsphd 面试后对方不回信正常么？请教质粒-20度冻存2年后不表达了请问大家关于clinical license，谢谢Anybody familiar with genome assembly software?用qPCR检测mRNA，高1000倍，却看不到蛋白物理和数学 问个英语的问题NF-kB phos-NF-kB antibodypaper help please老美医生实验室夫妻店能去吗?大家elisa用的antibody一般都是从什么公司买的啊U Louisville 的Biochemistry and Molecular Biology 怎么样NIH口头同意的K99会变卦？求文献，着急，十分感谢！这样被据的是不是得罪人了？K99大幅削减了!R21实验室这样的老印应该怎么防备？请问怎么查老板前些年的funding？