哪位能科普一下ZHUANG的单分子荧光 - 未名空间MITBBS历史存档

哪位能科普一下ZHUANG的单分子荧光# Biology - 生物学

G*t2012-03-17 07:03

1 楼

一、《憨豆先生精选辑》电影推荐指数：★★★★★上映时间：1997年/英国豆瓣评分：9.6
二、《美丽人生》电影推荐指数：★★★★★上映时间：1997年/意大利豆瓣评分：9.5
三、《福尔摩斯二世》电影推荐指数：★★★★★上映时间：1924年/美国豆瓣评分：9.4
四、《机器人总动员》电影推荐指数：★★★★★上映时间：2008年/美国豆瓣评分：9.3
五、《极品基老伴：完结篇》电影推荐指数：★★★★上映时间：2016年/英国豆瓣评分：9.3
六、《疯狂动物城》电影推荐指数：★★★★★上映时间：2016年/美国豆瓣评分：9.2
七、《大话西游之大圣娶亲》电影推荐指数：★★★★★上映时间：1995年/中国豆瓣评分：9.2
八、《摩登时代》电影推荐指数：★★★★★上映时间：1936年/美国豆瓣评分：9.2
九、《城市之光》电影推荐指数：★★★★★上映时间：1931年/美国豆瓣评分：9.2
十、《三傻大闹宝莱坞》电影推荐指数：★★★★★上映时间：2011年/印度豆瓣评分：9.1

m*o2012-03-17 07:03

2 楼

不是生物领域，感觉Harvard 庄晓薇的这个方向作的好牛。她真的能够看见单分子的
in vivo 的运动吗？还有， Nucleic Acid - Protein Interactions？
Single-Molecule biology:
Nucleic Acid - Protein Interactions
We explore single-molecule fluorescence imaging and spectroscopy techniques
to study complex biomolecular systems.

g*02012-03-17 07:03

3 楼

这个帖子没人回答表明很多庄粉其实是叶公好龙。

s*y2012-03-17 07:03

4 楼

首先，庄看的是生物大分子，所以不像你想象中的那么小。
第二，看见的其实是分子上标记的荧光基团的信号，只要背景足够低，感光元件
足够敏感，荧光基团足够强，就能看见单个分子的荧光基团的信号。
但是如果直接用光学成像作定位的话会出问题，因为普通光学显微镜的
分辨率在0.2微米，这个大于大部分生物分子的尺寸，所以会无法准确定位。
庄的方法是倒过来推算，就是用定位激发的方式来确定该荧光分子的位置，
因为现代的物理机械定位的精度已经达到了纳米级别，所以可以比光学成像
的精度高。
至于说看蛋白和核酸的作用，其实就是在蛋白和核酸上放上不同的荧光集团，
然后看两者的作用。或者是看其中一个的结合和另外一个分子上标记的荧光
信号的影响，来倒过来推测他们的作用。
所以，看到的，都是信号的变化，并不是你想象的那么真的看到了一个DNA
链条扭来扭去的然后结合到了一个圆鼓鼓的蛋白上去那么的写实。

techniques

【在 m***o 的大作中提到】

: 不是生物领域，感觉Harvard 庄晓薇的这个方向作的好牛。她真的能够看见单分子的
: in vivo 的运动吗？还有， Nucleic Acid - Protein Interactions？
: Single-Molecule biology:
: Nucleic Acid - Protein Interactions
: We explore single-molecule fluorescence imaging and spectroscopy techniques
: to study complex biomolecular systems.

h*n2012-03-17 07:03

5 楼

求定位激发原理

【在 s******y 的大作中提到】

: 首先，庄看的是生物大分子，所以不像你想象中的那么小。
: 第二，看见的其实是分子上标记的荧光基团的信号，只要背景足够低，感光元件
: 足够敏感，荧光基团足够强，就能看见单个分子的荧光基团的信号。
: 但是如果直接用光学成像作定位的话会出问题，因为普通光学显微镜的
: 分辨率在0.2微米，这个大于大部分生物分子的尺寸，所以会无法准确定位。
: 庄的方法是倒过来推算，就是用定位激发的方式来确定该荧光分子的位置，
: 因为现代的物理机械定位的精度已经达到了纳米级别，所以可以比光学成像
: 的精度高。
: 至于说看蛋白和核酸的作用，其实就是在蛋白和核酸上放上不同的荧光集团，
: 然后看两者的作用。或者是看其中一个的结合和另外一个分子上标记的荧光

s*y2012-03-17 07:03

6 楼

在我的理解里，一种最简单的方法，就是用机械的方式，把激光的激发头
对准某个点，对准的精度可以达到纳米。当然，激光对得再准，也有一个
发出的光的光斑问题，因为因为激光也是光，也有一个0.2um的问题，但是通过计算，
可以知道激光点的那个光斑里面的最高强度的峰的位置在哪里，然后再经过计算，就知
道应该是什么什么范围里面能受到最大的激发（这个范围就会远小于0.2um）。然后一
条线上扫描过去后，再经过计算，把那些因为是受到非光峰的
散光而被激发的点的信号给抹去，剩下的点大概应该就是精确的点了。

【在 h****n 的大作中提到】

: 求定位激发原理

s*y2012-03-17 07:03

7 楼

具体是不是这样，可以等我师姐有空了上来科普（当然，我不是说庄师姐，
虽然她也算是我师姐。呵呵呵）

【在 s******y 的大作中提到】

: 在我的理解里，一种最简单的方法，就是用机械的方式，把激光的激发头
: 对准某个点，对准的精度可以达到纳米。当然，激光对得再准，也有一个
: 发出的光的光斑问题，因为因为激光也是光，也有一个0.2um的问题，但是通过计算，
: 可以知道激光点的那个光斑里面的最高强度的峰的位置在哪里，然后再经过计算，就知
: 道应该是什么什么范围里面能受到最大的激发（这个范围就会远小于0.2um）。然后一
: 条线上扫描过去后，再经过计算，把那些因为是受到非光峰的
: 散光而被激发的点的信号给抹去，剩下的点大概应该就是精确的点了。

g*f2012-03-17 07:03

8 楼

其实我最想看到的就是DNA链条扭来扭去的然后结合到了一个圆鼓鼓的蛋白上。那样的
话什么基因调控等等的分子生物学问题都迎刃而解了

a*y2012-03-17 07:03

9 楼

this is not Zhuang's principle. The method you mentioned is STED, pioneered
by Stefan Hell (Zhuang's competitor).

【在 s******y 的大作中提到】

: 在我的理解里，一种最简单的方法，就是用机械的方式，把激光的激发头
: 对准某个点，对准的精度可以达到纳米。当然，激光对得再准，也有一个
: 发出的光的光斑问题，因为因为激光也是光，也有一个0.2um的问题，但是通过计算，
: 可以知道激光点的那个光斑里面的最高强度的峰的位置在哪里，然后再经过计算，就知
: 道应该是什么什么范围里面能受到最大的激发（这个范围就会远小于0.2um）。然后一
: 条线上扫描过去后，再经过计算，把那些因为是受到非光峰的
: 散光而被激发的点的信号给抹去，剩下的点大概应该就是精确的点了。

s*y2012-03-17 07:03

10 楼

呵呵，我只知道这种最简单的方法，庄具体用什么方法定位的我还真的不知道。
你能不能说说？

pioneered

【在 a**y 的大作中提到】

: this is not Zhuang's principle. The method you mentioned is STED, pioneered
: by Stefan Hell (Zhuang's competitor).

m*o2012-03-17 07:03

11 楼

谢谢SUNNYDAY。可是，如果标上了荧光基团，那in vivo 的试验还真实吗？我是
说，不管DNA， RNA或蛋白质，加上一个额外的基团，它们的生物行为会改变的，
比如， DNA和蛋白质的相互作用，就可能不是真正的相互作用了。

m*o2012-03-17 07:03

12 楼

可能很多庄粉像我一样，并不真正懂得她做的东西。呵呵，也就是叶公好龙。

【在 g********0 的大作中提到】

: 这个帖子没人回答表明很多庄粉其实是叶公好龙。

s*y2012-03-17 07:03

13 楼

这个不好说，加了的确会有这个改变分子行为的风险，但是你不加那个基团，
就会什么都看不到。所以有时候不同实验室用不同方法标记作出来的实验
的结果不能吻合。这个就是一个风险问题。
比较严格的时候，会把那个标记过的东西来测一下它的活性，看看和原始的
未标记的是否差不多，如果差不多的话，说明应该没有改变太多。

【在 m***o 的大作中提到】

: 谢谢SUNNYDAY。可是，如果标上了荧光基团，那in vivo 的试验还真实吗？我是
: 说，不管DNA， RNA或蛋白质，加上一个额外的基团，它们的生物行为会改变的，
: 比如， DNA和蛋白质的相互作用，就可能不是真正的相互作用了。

J*a2012-03-17 07:03

14 楼

that is not STED.

pioneered

【在 a**y 的大作中提到】

: this is not Zhuang's principle. The method you mentioned is STED, pioneered
: by Stefan Hell (Zhuang's competitor).

f*u2012-03-17 07:03

15 楼

我知道你说的这个方法，也记得庄好像用的不是这个。
庄的方法我记得是用比较弱的激发光，然后样品里面只有很小部分的荧光分子被激发，
从概率上来说两个相邻很紧的荧光分子被同时激发的可能性就很小了。
每个被激发的荧光分子会产生一个信号斑，然后她就认为这个斑的中心就是荧光分子所
在。
这个过程可以重复很多次，然后就可以得到很高的分辨率。
我印象里Janelia农场也有个人在做这个技术。
这个技术的缺点可能就是很慢，因为要扫很多次。

【在 s******y 的大作中提到】

: 呵呵，我只知道这种最简单的方法，庄具体用什么方法定位的我还真的不知道。
: 你能不能说说？
:
: pioneered

p*l2012-03-17 07:03

16 楼

庄的STORM和Betzig的PALM，基本原理一样。一句话说，如果你是在独立的单分子拍照，成像的分辨率差没关系，只要信号足够亮，定位精确度可以比成像分辨率高很多。打个比方，我和个朋友约个地方碰头，出门忘了带眼镜，看啥都不太清楚，不过运气好，碰头的地方就只一个人站在那里，不是我那朋友会是谁。如果运气不好，碰头的地方人山人海，就找不着人在哪了。
显微镜的光学分辨极限是200nm,，一个单分子会成像成一个约200nm直径的模糊光团，但是如果事先知道这肯定是个单分子，那么这个模糊光团的中心肯定是这个分子的位置。这个中心定位的准确性，决定于我拍到的光团的亮度，越亮的光团，中心定位越准。但是，如果我事先不知道这个光团是从一个单分子来的，这个光团其实是有可能从两个甚至更多的单分子来的，可能分子之间间距很小，在图像上糊成了一团。那么光团的中心即使找到了，也没什么意义。也就是说，这种超分辨定位方法，只在每个单分子之间的间距大于200nm的时候才有用。
一个荧光的细胞，上帝都没法保证这里面每个荧光分子间距足够开，所以尽管这个定位的方法很简单，可是没法直接用在生物成像上。PALM和STORM的创新在于，找到了方法，能随机把荧光分子来来回回在不发光的状态和发光状态之间调制。每次曝光之前，他们把大多数分子调到off state，只留下少数分子发光。这样处理之后，就能大体满足图像内全是互相分得很开的单分子。拍成的图像可以用来精确定位每个分子。因为一张图像，只是看见了很小一部分散立的分子，要看见样品的全貌，PALM 和STROM必须反复对样品分子的调制操作，每次曝光只随机观测很少一部分分子，最后把几十甚至上百张精确定位的单分子图叠加起来，合成最后的图像。
PALM和STORM比较关键的地方，在于怎么保证所有的信号都是从独立单分子来的。on-off switching是个随机过程，也就是说即使能做到>99%的单分子都分得很开，也没人能100％保证没有挤成一团发光的分子。疑似来自多分子的光团需要在图像处理中去掉。我不是做这个的，具体方法我也不清楚，不过从“疑似”和“去掉”两词，大家可以细心体会这里面水有多深。

pioneered

【在 a**y 的大作中提到】

: this is not Zhuang's principle. The method you mentioned is STED, pioneered
: by Stefan Hell (Zhuang's competitor).

p*l2012-03-17 07:03

17 楼

理论上讲，只有在大分子上特定的位置上直接加小分子的荧光团，做出来的定位结果才可信。可是这个是不可能in vivo的。in vitro做，蛋白上site specific 加
fluorescent conjugation，据我所知也是很难的事。

【在 m***o 的大作中提到】

: 谢谢SUNNYDAY。可是，如果标上了荧光基团，那in vivo 的试验还真实吗？我是
: 说，不管DNA， RNA或蛋白质，加上一个额外的基团，它们的生物行为会改变的，
: 比如， DNA和蛋白质的相互作用，就可能不是真正的相互作用了。

p*l2012-03-17 07:03

18 楼

Hell的STED传承于爱因斯坦。
当年爱因斯坦预言了simulated emission effect，几十年后，人们靠特殊物质的
stimulated emission effect造出了激光，激光出现几十年后，Hell靠着强大的激光在
生物样品中做出了simulated emission effect，在这个effect的基础上实现了超分辨
成像。
爱因斯坦才是真正的牛人，特别敢想，而且只想不做实验，把实验都留给了别人做，造就好几个实验诺奖。

【在 s******y 的大作中提到】

: 呵呵，我只知道这种最简单的方法，庄具体用什么方法定位的我还真的不知道。
: 你能不能说说？
:
: pioneered

a*y2012-03-17 07:03

19 楼

From his description, I also agree that it is more close to near-field
techniques.
But I guess that he really meant STED, since STED is more useful for
biological studies?

【在 J**a 的大作中提到】

: that is not STED.
:
: pioneered

l*12012-03-17 07:03

20 楼

庄只是徐福炼丹给秦始皇炼那个长生不老丹吧?
Xiaoliang Sunney Xie
Raman Scattering is King Route to 单分子Raman scattering 光 (possible)
1)
Single DNA molecule detection in an optical trap using surface-enhanced Raman scattering
//apl.aip.org/resource/1/applab/v96/i21/p213701_s1
Abstract:
Raman spectra from single DNA molecules in their natural aqueous environment are presented. A DNA molecule that is anchored between two optically trapped dielectric beads is suspended in a solution with nanosized silver colloid particles. The nonspecific binding of the metal to the DNA enhances the Raman scattering that is excited by a near-infrared beam. A Raman spectrum is first recorded followed by a force-extension curve that verifies the presence of a single DNA molecule.
2)
Tip-enhanced Raman spectroscopy of single RNA strands: towards a novel direct-sequencing method.
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18188855
3) one Review:
Advanced microscopy of microbial cells.
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21082308
4)
First commercial instrument of CARS from LEICA soon:
CARS MICROSCOPY
Coherent Antistokes Raman Scattering (CARS) microscopy allows rapid and non-perturbative imaging of biological specimen with chemical selectivity. No specific staining is required. Visualization in CARS microscopy arises from the intrinsic vibrations of molecules only.
The technology was developed in the lab of Xiaoliang Sunney Xie, Professor of Chemistry and Chemical Biology at Harvard University http://bernstein.harvard.edu/research/cars.html. Leica Microsystems and Harvard Universitys Office of Technology Development (OTD) recently announced a license agreement to develop CARS microscopy as an extension of confocal/multiphoton microscopes http://www.leica-microsystems.com.
The IMB Microscopy Facility is worldwide
the first user of Leica's new commercial CARS microscope!
link
//microscopy.uni-graz.at/index.php?item=cars

【在 g********0 的大作中提到】

: 这个帖子没人回答表明很多庄粉其实是叶公好龙。

a*e2012-03-17 07:03

21 楼

这个讲的不错。

照，成像的分辨率差没关系，只要信号足够亮，定位精确度可以比成像分辨率高很多。
打个比方，我和个朋友约个地方碰头，出门忘了带眼镜，看啥都不太清楚，不过运气好
，碰头的地方就只一个人站在那里，不是我那朋友会是谁。如果运气不好，碰头的地方
人山人海，就找不着人在哪了。
，但是如果事先知道这肯定是个单分子，那么这个模糊光团的中心肯定是这个分子的位
置。这个中心定位的准确性，决定于我拍到的光团的亮度，越亮的光团，中心定位越准
。但是，如果我事先不知道这个光团是从一个单分子来的，这个光团其实是有可能从两
个甚至更多的单分子来的，可能分子之间间距很小，在图像上糊成了一团。那么光团的
中心即使找到了，也没什么意义。也就是说，这种超分辨定位方法，只在每个单分子之
间的间距大于200nm的时候才有用。
位的方法很简单，可是没法直接用在生物成像上。PALM和STORM的创新在于，找到了方
法，能随机把荧光分子来来回回在不发光的状态和发光状态之间调制。每次曝光之前，
他们把大多数分子调到off state，只留下少数分子发光。这样处理之后，就能大体满
足图像内全是互相分得很开的单分子。拍成的图像可以用来精确定位每个分子。因为一
张图像，只是看见了很小一部分散立的分子，要看见样品的全貌，PALM 和STROM必须反
复对样品分子的调制操作，每次曝光只随机观测很少�: 徊糠址肿樱詈蟀鸭甘
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off switching是个随机过程，也就是说即使能做到>99%的单分子都分得很开，也没人
能100％保证没有挤成一团发光的分子。疑似来自多分子的光团需要在图像处理中去掉
。我不是做这个的，具体方法我也不清楚，不过从“疑似”和“去掉”两词，大家可以
细心体会这里面水有多深。

【在 p*l 的大作中提到】

: 庄的STORM和Betzig的PALM，基本原理一样。一句话说，如果你是在独立的单分子拍照，成像的分辨率差没关系，只要信号足够亮，定位精确度可以比成像分辨率高很多。打个比方，我和个朋友约个地方碰头，出门忘了带眼镜，看啥都不太清楚，不过运气好，碰头的地方就只一个人站在那里，不是我那朋友会是谁。如果运气不好，碰头的地方人山人海，就找不着人在哪了。
: 显微镜的光学分辨极限是200nm,，一个单分子会成像成一个约200nm直径的模糊光团，但是如果事先知道这肯定是个单分子，那么这个模糊光团的中心肯定是这个分子的位置。这个中心定位的准确性，决定于我拍到的光团的亮度，越亮的光团，中心定位越准。但是，如果我事先不知道这个光团是从一个单分子来的，这个光团其实是有可能从两个甚至更多的单分子来的，可能分子之间间距很小，在图像上糊成了一团。那么光团的中心即使找到了，也没什么意义。也就是说，这种超分辨定位方法，只在每个单分子之间的间距大于200nm的时候才有用。
: 一个荧光的细胞，上帝都没法保证这里面每个荧光分子间距足够开，所以尽管这个定位的方法很简单，可是没法直接用在生物成像上。PALM和STORM的创新在于，找到了方法，能随机把荧光分子来来回回在不发光的状态和发光状态之间调制。每次曝光之前，他们把大多数分子调到off state，只留下少数分子发光。这样处理之后，就能大体满足图像内全是互相分得很开的单分子。拍成的图像可以用来精确定位每个分子。因为一张图像，只是看见了很小一部分散立的分子，要看见样品的全貌，PALM 和STROM必须反复对样品分子的调制操作，每次曝光只随机观测很少一部分分子，最后把几十甚至上百张精确定位的单分子图叠加起来，合成最后的图像。
: PALM和STORM比较关键的地方，在于怎么保证所有的信号都是从独立单分子来的。on-off switching是个随机过程，也就是说即使能做到>99%的单分子都分得很开，也没人能100％保证没有挤成一团发光的分子。疑似来自多分子的光团需要在图像处理中去掉。我不是做这个的，具体方法我也不清楚，不过从“疑似”和“去掉”两词，大家可以细心体会这里面水有多深。
:
: pioneered

l*12012-03-17 07:03

22 楼

Please go to
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20643879
Schermelleh L, Heintzmann R, Leonhardt H.
A guide to super-resolution fluorescence microscopy. (2010)
J Cell Biol.190(2):165-.
you will know more:
PALM or STORM both are restricted in living cell imaing...

【在 a****e 的大作中提到】

: 这个讲的不错。
:
: 照，成像的分辨率差没关系，只要信号足够亮，定位精确度可以比成像分辨率高很多。
: 打个比方，我和个朋友约个地方碰头，出门忘了带眼镜，看啥都不太清楚，不过运气好
: ，碰头的地方就只一个人站在那里，不是我那朋友会是谁。如果运气不好，碰头的地方
: 人山人海，就找不着人在哪了。
: ，但是如果事先知道这肯定是个单分子，那么这个模糊光团的中心肯定是这个分子的位
: 置。这个中心定位的准确性，决定于我拍到的光团的亮度，越亮的光团，中心定位越准
: 。但是，如果我事先不知道这个光团是从一个单分子来的，这个光团其实是有可能从两
: 个甚至更多的单分子来的，可能分子之间间距很小，在图像上糊成了一团。那么光团的

a*e2012-03-17 07:03

23 楼

very helpful. thanks

【在 l**********1 的大作中提到】

: Please go to
: //www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20643879
: Schermelleh L, Heintzmann R, Leonhardt H.
: A guide to super-resolution fluorescence microscopy. (2010)
: J Cell Biol.190(2):165-.
: you will know more:
: PALM or STORM both are restricted in living cell imaing...

l*12012-03-17 07:03

24 楼

De rien.

【在 a****e 的大作中提到】

: very helpful. thanks

l*12012-03-17 07:03

25 楼

CARS from Maxwell Equation.
please go to paper link:
//www.math.jussieu.fr/~texier/bbcnt.pdf

造就好几个实验诺奖。

【在 p*l 的大作中提到】

: Hell的STED传承于爱因斯坦。
: 当年爱因斯坦预言了simulated emission effect，几十年后，人们靠特殊物质的
: stimulated emission effect造出了激光，激光出现几十年后，Hell靠着强大的激光在
: 生物样品中做出了simulated emission effect，在这个effect的基础上实现了超分辨
: 成像。
: 爱因斯坦才是真正的牛人，特别敢想，而且只想不做实验，把实验都留给了别人做，造就好几个实验诺奖。

p*e2012-03-17 07:03

26 楼

讲个很清楚，门外汉学习了

照，成像的分辨率差没关系，只要信号足够亮，定位精确度可以比成像分辨率高很多。
打个比方，我和个朋友约个地方碰头，出门忘了带眼镜，看啥都不太清楚，不过运气好
，碰头的地方就只一个人站br />
一个约200nm直径的模糊光团，但是如果事先知道这肯定是个单分子，那么这个模糊光
团的中心肯定是这个分子的位置。这个中心定位的准确性，决定于我拍到的光团的亮度
，越亮的光团，中心定位越准。但是，如果我事先不知道br />
没法保证这里面每个荧光分子间距足够开，所以尽管这个定位的方法很简单，可是没法
直接用在生物成像上。PALM和STORM的创新在于，找到了方法，能随机把荧光分子来来
回回在不发光的状态和发光状态之间调制。每次曝光之前，他们把大多数分子调到off
s
off switching是个随机过程，也就是说即使能做到>99%的单分子都分得很开，也没人
能100％保证没有挤成一团发光的分子。疑似来自多分子的光团需要在图像处理中去掉
。我不是做这个的，具体方法

【在 p*l 的大作中提到】

: 庄的STORM和Betzig的PALM，基本原理一样。一句话说，如果你是在独立的单分子拍照，成像的分辨率差没关系，只要信号足够亮，定位精确度可以比成像分辨率高很多。打个比方，我和个朋友约个地方碰头，出门忘了带眼镜，看啥都不太清楚，不过运气好，碰头的地方就只一个人站在那里，不是我那朋友会是谁。如果运气不好，碰头的地方人山人海，就找不着人在哪了。
: 显微镜的光学分辨极限是200nm,，一个单分子会成像成一个约200nm直径的模糊光团，但是如果事先知道这肯定是个单分子，那么这个模糊光团的中心肯定是这个分子的位置。这个中心定位的准确性，决定于我拍到的光团的亮度，越亮的光团，中心定位越准。但是，如果我事先不知道这个光团是从一个单分子来的，这个光团其实是有可能从两个甚至更多的单分子来的，可能分子之间间距很小，在图像上糊成了一团。那么光团的中心即使找到了，也没什么意义。也就是说，这种超分辨定位方法，只在每个单分子之间的间距大于200nm的时候才有用。
: 一个荧光的细胞，上帝都没法保证这里面每个荧光分子间距足够开，所以尽管这个定位的方法很简单，可是没法直接用在生物成像上。PALM和STORM的创新在于，找到了方法，能随机把荧光分子来来回回在不发光的状态和发光状态之间调制。每次曝光之前，他们把大多数分子调到off state，只留下少数分子发光。这样处理之后，就能大体满足图像内全是互相分得很开的单分子。拍成的图像可以用来精确定位每个分子。因为一张图像，只是看见了很小一部分散立的分子，要看见样品的全貌，PALM 和STROM必须反复对样品分子的调制操作，每次曝光只随机观测很少一部分分子，最后把几十甚至上百张精确定位的单分子图叠加起来，合成最后的图像。
: PALM和STORM比较关键的地方，在于怎么保证所有的信号都是从独立单分子来的。on-off switching是个随机过程，也就是说即使能做到>99%的单分子都分得很开，也没人能100％保证没有挤成一团发光的分子。疑似来自多分子的光团需要在图像处理中去掉。我不是做这个的，具体方法我也不清楚，不过从“疑似”和“去掉”两词，大家可以细心体会这里面水有多深。
:
: pioneered

e*o2012-03-17 07:03

27 楼

这套系统的硬件好像不是太贵，数据分析很难。据说现在有商业化的。不知道有谁在用
这套体系作实验没有，是不是需要train很长的时间才能玩得转？

p*n2012-03-17 07:03

28 楼

zhuang给talk的时候说只需要对现有imaging设备稍作改造，软件也很容易。
我猜既然算法和界面已经有了，操作应该难不到那里去。

【在 e***o 的大作中提到】

: 这套系统的硬件好像不是太贵，数据分析很难。据说现在有商业化的。不知道有谁在用
: 这套体系作实验没有，是不是需要train很长的时间才能玩得转？

p*l2012-03-17 07:03

29 楼

Raman scatter和Stimulated emission是两码事。

【在 l**********1 的大作中提到】

: CARS from Maxwell Equation.
: please go to paper link:
: //www.math.jussieu.fr/~texier/bbcnt.pdf
:
: 造就好几个实验诺奖。

v*s2012-03-17 07:03

30 楼

只要你运气不是太差，多分子的光团很难恰好也能符合高斯拟合，换句话说，你单分子
的光团理论上讲只有一个亮度中心，其余地方的亮度在极坐标下应该和角度无关，只依
赖于到亮度中心的距离，多分子的光团（特别是两分子，三分子的时候）几乎做不到这
一点，所以去掉这个倒不难。
但我始终对这玩意的原理感到不安，他实质上就是一个deconvolution。你看到的东西
是你的真实信号（假设是dirac function）和你的Instrument response（一个200纳米
的gaussian function）的convolution。那么你把gaussian function从你看到的东西
里面deconvolute掉以后，就是真实信号了。他只不过为了降低deconvolution的难度，
加了一些限制条件（真实信号只是单个dirac function）。
按这个理论，任何仪器的时空精度都可以无限了。我觉得不靠谱的，随便想一下，这个
肯定也要依赖于你的detection system的分辨率有多高，比如你CCD的pixel size是多
少。如果你一个pixel对应过去就是200纳米大小的一个方块，那你拟合出来的结果十有
八九都是在这个方块的中心，显然就不对了。再打个比方，你要测压强，先测了力，再
测了面积，然后一按计算器，搞出个七八位有效数字，这是忽悠人啊。

照，成像的分辨率差没关系，只要信号足够亮，定位精确度可以比成像分辨率高很多。
打个比方，我和个朋友约个地方碰头，出门忘了带眼镜，看啥都不太清楚，不过运气好
，碰头的地方就只一个人站在那里，不是我那朋友会是谁。如果运气不好，碰头的地方
人山人海，就找不着人在哪了。
，但是如果事先知道这肯定是个单分子，那么这个模糊光团的中心肯定是这个分子的位
置。这个中心定位的准确性，决定于我拍到的光团的亮度，越亮的光团，中心定位越准
。但是，如果我事先不知道这个光团是从一个单分子来的，这个光团其实是有可能从两
个甚至更多的单分子来的，可能分子之间间距很小，在图像上糊成了一团。那么光团的
中心即使找到了，也没什么意义。也就是说，这种超分辨定位方法，只在每个单分子之
间的间距大于200nm的时候才有用。
位的方法很简单，可是没法直接用在生物成像上。PALM和STORM的创新在于，找到了方
法，能随机把荧光分子来来回回在不发光的状态和发光状态之间调制。每次曝光之前，
他们把大多数分子调到off state，只留下少数分子发光。这样处理之后，就能大体满
足图像内全是互相分得很开的单分子。拍成的图像可以用来精确定位每个分子。因为一
张图像，只是看见了很小一部分散立的分子，要看见样品的全貌，PALM 和STROM必须反
复对样品分子的调制操作，每次曝光只随机观测很少�: 徊糠址肿樱詈蟀鸭甘
踔辽习僬啪范ㄎ坏牡シ肿油嫉悠鹄矗铣勺詈蟮耐枷瘛�
off switching是个随机过程，也就是说即使能做到>99%的单分子都分得很开，也没人
能100％保证没有挤成一团发光的分子。疑似来自多分子的光团需要在图像处理中去掉
。我不是做这个的，具体方法我也不清楚，不过从“疑似”和“去掉”两词，大家可以
细心体会这里面水有多深。

【在 p*l 的大作中提到】

: 庄的STORM和Betzig的PALM，基本原理一样。一句话说，如果你是在独立的单分子拍照，成像的分辨率差没关系，只要信号足够亮，定位精确度可以比成像分辨率高很多。打个比方，我和个朋友约个地方碰头，出门忘了带眼镜，看啥都不太清楚，不过运气好，碰头的地方就只一个人站在那里，不是我那朋友会是谁。如果运气不好，碰头的地方人山人海，就找不着人在哪了。
: 显微镜的光学分辨极限是200nm,，一个单分子会成像成一个约200nm直径的模糊光团，但是如果事先知道这肯定是个单分子，那么这个模糊光团的中心肯定是这个分子的位置。这个中心定位的准确性，决定于我拍到的光团的亮度，越亮的光团，中心定位越准。但是，如果我事先不知道这个光团是从一个单分子来的，这个光团其实是有可能从两个甚至更多的单分子来的，可能分子之间间距很小，在图像上糊成了一团。那么光团的中心即使找到了，也没什么意义。也就是说，这种超分辨定位方法，只在每个单分子之间的间距大于200nm的时候才有用。
: 一个荧光的细胞，上帝都没法保证这里面每个荧光分子间距足够开，所以尽管这个定位的方法很简单，可是没法直接用在生物成像上。PALM和STORM的创新在于，找到了方法，能随机把荧光分子来来回回在不发光的状态和发光状态之间调制。每次曝光之前，他们把大多数分子调到off state，只留下少数分子发光。这样处理之后，就能大体满足图像内全是互相分得很开的单分子。拍成的图像可以用来精确定位每个分子。因为一张图像，只是看见了很小一部分散立的分子，要看见样品的全貌，PALM 和STROM必须反复对样品分子的调制操作，每次曝光只随机观测很少一部分分子，最后把几十甚至上百张精确定位的单分子图叠加起来，合成最后的图像。
: PALM和STORM比较关键的地方，在于怎么保证所有的信号都是从独立单分子来的。on-off switching是个随机过程，也就是说即使能做到>99%的单分子都分得很开，也没人能100％保证没有挤成一团发光的分子。疑似来自多分子的光团需要在图像处理中去掉。我不是做这个的，具体方法我也不清楚，不过从“疑似”和“去掉”两词，大家可以细心体会这里面水有多深。
:
: pioneered

v*s2012-03-17 07:03

31 楼

这个话也不能这么说吧。这要都能算传承，那估计直到18世纪，所有的物理学家都是传
承牛顿的。
我觉得STED能搞出来，最重要的不是stimulated emission，这个大家都知道，而是对
波前的精确控制，能有doughnut-shaped laser beam。

造就好几个实验诺奖。

【在 p*l 的大作中提到】

: Hell的STED传承于爱因斯坦。
: 当年爱因斯坦预言了simulated emission effect，几十年后，人们靠特殊物质的
: stimulated emission effect造出了激光，激光出现几十年后，Hell靠着强大的激光在
: 生物样品中做出了simulated emission effect，在这个effect的基础上实现了超分辨
: 成像。
: 爱因斯坦才是真正的牛人，特别敢想，而且只想不做实验，把实验都留给了别人做，造就好几个实验诺奖。

p*l2012-03-17 07:03

32 楼

Hell关于STED的第一篇文章，是93年发在optics letters上的。文章核心的公式就是当
年爱因斯坦写下的。
doughnut好不好确实很重要，但是没有强功率的激光，什么都白搭。从93年的第一篇文
章，到后来的nature method，Hell花了十年实现这个想法。这十年，恰好是高功率激
光研制制造技术腾飞的十年。早期Hell的实验，很多时候受激光功率波长的限制，常常
要自己搭激光。现在，Hell已经牛到有公司愿意为STED专门去研制激光了。

【在 v*****s 的大作中提到】

: 这个话也不能这么说吧。这要都能算传承，那估计直到18世纪，所有的物理学家都是传
: 承牛顿的。
: 我觉得STED能搞出来，最重要的不是stimulated emission，这个大家都知道，而是对
: 波前的精确控制，能有doughnut-shaped laser beam。
:
: 造就好几个实验诺奖。

v*s2012-03-17 07:03

33 楼

STED的分辨率直接取决于doughnut中间那个空心的大小，这个对一个超分辨技术来说当
然是最重要的因素。他要多强功率的激光，我倒没印象了。我个人觉得一般强功率激光
都是军事用途的，硬烧伤或者模拟核试验的，米帝境内功率最强的激光应该是波音搞得
那个反导弹系统，单位面积强度最大的应该是那个XX实验室里面用32束激光聚焦到同一
点搞核聚变的。科研上很少用到太强功率的激光，生物的更不可能了，直接把细胞气化
了。
其实只要有那个doughnut的激光，有很多手段可以达到超分辨的，stimulated
emission只是其中一种，还未必是最好的一种。这个里面最重要的idea是用激光
deplete你的on state。sunney xie好像就用类似的办法实现了raman的单分子探测。

【在 p*l 的大作中提到】

: Hell关于STED的第一篇文章，是93年发在optics letters上的。文章核心的公式就是当
: 年爱因斯坦写下的。
: doughnut好不好确实很重要，但是没有强功率的激光，什么都白搭。从93年的第一篇文
: 章，到后来的nature method，Hell花了十年实现这个想法。这十年，恰好是高功率激
: 光研制制造技术腾飞的十年。早期Hell的实验，很多时候受激光功率波长的限制，常常
: 要自己搭激光。现在，Hell已经牛到有公司愿意为STED专门去研制激光了。

p*l2012-03-17 07:03

34 楼

STED对激光有些特殊要求，不是总功率大就行了。
STED造doughnut的方法，早Hell几十年就有人知道怎么做了，可是一直只是
做光学的人自娱自乐的一个小东西。Hell从骨子上是个物理学家，他自己造激
光可以，但是做optical enigineering 的底子差点，所以走了好多弯路才发现
做doughnut方法已经在那里了。如果是专做imaging system engineering
的人，可能第一时间就想到了。不过我自己觉得想法比工程实现重要的多。
想法好，目标明确，工程上的难题不管花多久总能解决的。现在回头看Hell成
名前的文章，杂七杂八试了好多不靠谱的工程方案，个中心酸，恐怕只有同行
能感觉得到。

【在 v*****s 的大作中提到】

: STED的分辨率直接取决于doughnut中间那个空心的大小，这个对一个超分辨技术来说当
: 然是最重要的因素。他要多强功率的激光，我倒没印象了。我个人觉得一般强功率激光
: 都是军事用途的，硬烧伤或者模拟核试验的，米帝境内功率最强的激光应该是波音搞得
: 那个反导弹系统，单位面积强度最大的应该是那个XX实验室里面用32束激光聚焦到同一
: 点搞核聚变的。科研上很少用到太强功率的激光，生物的更不可能了，直接把细胞气化
: 了。
: 其实只要有那个doughnut的激光，有很多手段可以达到超分辨的，stimulated
: emission只是其中一种，还未必是最好的一种。这个里面最重要的idea是用激光
: deplete你的on state。sunney xie好像就用类似的办法实现了raman的单分子探测。

b*s2012-03-17 07:03

35 楼

搭车请教一下FCS. Fluorescence correlation spectroscopy (FCS). 这个是从另外的
角度来研究荧光分子的运动。不追求高分辨率，只是测fluctuations，普通共聚焦就够
了。原理看起来也不复杂，但是在搜集的数据分析阶段看起来很多需要经验，判断哪些
数据不好。而且很多时候得出跟传统方法（比如FRAP)很不一样的结论。很多时候可以
说FCS研究单个分子的波动，FRAP研究一个群体。但是对很多结果还是觉得半信半疑。
有没有高手给讲解一下。谢谢。

【在 p*l 的大作中提到】

: STED对激光有些特殊要求，不是总功率大就行了。
: STED造doughnut的方法，早Hell几十年就有人知道怎么做了，可是一直只是
: 做光学的人自娱自乐的一个小东西。Hell从骨子上是个物理学家，他自己造激
: 光可以，但是做optical enigineering 的底子差点，所以走了好多弯路才发现
: 做doughnut方法已经在那里了。如果是专做imaging system engineering
: 的人，可能第一时间就想到了。不过我自己觉得想法比工程实现重要的多。
: 想法好，目标明确，工程上的难题不管花多久总能解决的。现在回头看Hell成
: 名前的文章，杂七杂八试了好多不靠谱的工程方案，个中心酸，恐怕只有同行
: 能感觉得到。

b*s2012-03-17 07:03

36 楼

搭车请教一下FCS. Fluorescence correlation spectroscopy (FCS). 这个是从另外的
角度来研究荧光分子的运动。不追求高分辨率，只是测fluctuations，普通共聚焦就够
了。原理看起来也不复杂，但是在搜集的数据分析阶段看起来很多需要经验，判断哪些
数据不好。而且很多时候得出跟传统方法（比如FRAP)很不一样的结论。很多时候可以
说FCS研究单个分子的波动，FRAP研究一个群体。但是对很多结果还是觉得半信半疑。
有没有高手给讲解一下。谢谢。

【在 p*l 的大作中提到】

: STED对激光有些特殊要求，不是总功率大就行了。
: STED造doughnut的方法，早Hell几十年就有人知道怎么做了，可是一直只是
: 做光学的人自娱自乐的一个小东西。Hell从骨子上是个物理学家，他自己造激
: 光可以，但是做optical enigineering 的底子差点，所以走了好多弯路才发现
: 做doughnut方法已经在那里了。如果是专做imaging system engineering
: 的人，可能第一时间就想到了。不过我自己觉得想法比工程实现重要的多。
: 想法好，目标明确，工程上的难题不管花多久总能解决的。现在回头看Hell成
: 名前的文章，杂七杂八试了好多不靠谱的工程方案，个中心酸，恐怕只有同行
: 能感觉得到。

a*q2012-03-17 07:03

37 楼

实际的instrument response应该是pixel和gaussian function的convolution。稍微算
一下就可以发现，只要pixel的大小小于gaussian的standard deviation，pixel对定位
精度的影响是很小的。影响定位精度最大的因素是噪音，跟检测到的光子个数和背景强
度直接相关。所以信号无限的情况下，时空精度真的是可以无限的，只是实际实验中单
分子的信号当然不可能是无限的。

。

【在 v*****s 的大作中提到】

: STED的分辨率直接取决于doughnut中间那个空心的大小，这个对一个超分辨技术来说当
: 然是最重要的因素。他要多强功率的激光，我倒没印象了。我个人觉得一般强功率激光
: 都是军事用途的，硬烧伤或者模拟核试验的，米帝境内功率最强的激光应该是波音搞得
: 那个反导弹系统，单位面积强度最大的应该是那个XX实验室里面用32束激光聚焦到同一
: 点搞核聚变的。科研上很少用到太强功率的激光，生物的更不可能了，直接把细胞气化
: 了。
: 其实只要有那个doughnut的激光，有很多手段可以达到超分辨的，stimulated
: emission只是其中一种，还未必是最好的一种。这个里面最重要的idea是用激光
: deplete你的on state。sunney xie好像就用类似的办法实现了raman的单分子探测。

f*u2012-03-17 07:03

38 楼

顺便问一句，light sheet microscopy有人了解吗？
这玩艺儿的硬件恐怕目前还得自己搭才行吧。

【在 p*****n 的大作中提到】

: zhuang给talk的时候说只需要对现有imaging设备稍作改造，软件也很容易。
: 我猜既然算法和界面已经有了，操作应该难不到那里去。

f*e2012-03-17 07:03

39 楼

ccd camera 是对被 objective 放大之后成像的检测，所以虽然 pixel size 不算太小
，但是算上放大倍数，使得单分子荧光出来的信号不是完全只占一个 pixel 的。基本
上还是能有几个 pixel 产生一个 distribution，这样 deconvolution 就有意义了。

【在 v*****s 的大作中提到】

: 只要你运气不是太差，多分子的光团很难恰好也能符合高斯拟合，换句话说，你单分子
: 的光团理论上讲只有一个亮度中心，其余地方的亮度在极坐标下应该和角度无关，只依
: 赖于到亮度中心的距离，多分子的光团（特别是两分子，三分子的时候）几乎做不到这
: 一点，所以去掉这个倒不难。
: 但我始终对这玩意的原理感到不安，他实质上就是一个deconvolution。你看到的东西
: 是你的真实信号（假设是dirac function）和你的Instrument response（一个200纳米
: 的gaussian function）的convolution。那么你把gaussian function从你看到的东西
: 里面deconvolute掉以后，就是真实信号了。他只不过为了降低deconvolution的难度，
: 加了一些限制条件（真实信号只是单个dirac function）。
: 按这个理论，任何仪器的时空精度都可以无限了。我觉得不靠谱的，随便想一下，这个

a*q2012-03-17 07:03

40 楼

德国的Ernst Stelzer在卖他们搭的仪器，

【在 f**u 的大作中提到】

: 顺便问一句，light sheet microscopy有人了解吗？
: 这玩艺儿的硬件恐怕目前还得自己搭才行吧。

z*62012-03-17 07:03

41 楼

嗯，顶一下这个，也想了解一下，老婆在做这个，但是也不太懂... 我只知道最后分析
要计算numbers and brightness... so called N&B analysis...

【在 b******s 的大作中提到】

: 搭车请教一下FCS. Fluorescence correlation spectroscopy (FCS). 这个是从另外的
: 角度来研究荧光分子的运动。不追求高分辨率，只是测fluctuations，普通共聚焦就够
: 了。原理看起来也不复杂，但是在搜集的数据分析阶段看起来很多需要经验，判断哪些
: 数据不好。而且很多时候得出跟传统方法（比如FRAP)很不一样的结论。很多时候可以
: 说FCS研究单个分子的波动，FRAP研究一个群体。但是对很多结果还是觉得半信半疑。
: 有没有高手给讲解一下。谢谢。

a*q2012-03-17 07:03

42 楼

FCS不是严格意义上的单分子技术，简单说，就是把观测体积降到特别小（比如用
confocal）。这样的话在可观测体积内的分子个数也会特别少。因为分子在不断扩散进
进出出，所以检测到的荧光信号随体积内分子个数的变化有涨落，分子个数越少，涨落
相对越大。这样从涨落的幅度可以得到平均分子个数，平均荧光信号强度除以这个分子
个数就得到每一个分子的平均亮度；从涨落的时间尺度可以得到分子扩散经过这个体积
的时间，也就可以得到扩散系数。跟FRAP比，FCS完全是在平衡态做实验的。

【在 z*******6 的大作中提到】

: 嗯，顶一下这个，也想了解一下，老婆在做这个，但是也不太懂... 我只知道最后分析
: 要计算numbers and brightness... so called N&B analysis...

s*y2012-03-17 07:03

43 楼

我怎么觉得这个方法。。。怎么看怎么让我觉得不舒服。。。
活细胞可是会动的，怎么把细胞运动带来的噪音消除掉？
而且细胞可不是只往一个方向跑，而经常是在那里抖来抖去的。

【在 a*q 的大作中提到】

: FCS不是严格意义上的单分子技术，简单说，就是把观测体积降到特别小（比如用
: confocal）。这样的话在可观测体积内的分子个数也会特别少。因为分子在不断扩散进
: 进出出，所以检测到的荧光信号随体积内分子个数的变化有涨落，分子个数越少，涨落
: 相对越大。这样从涨落的幅度可以得到平均分子个数，平均荧光信号强度除以这个分子
: 个数就得到每一个分子的平均亮度；从涨落的时间尺度可以得到分子扩散经过这个体积
: 的时间，也就可以得到扩散系数。跟FRAP比，FCS完全是在平衡态做实验的。

w*x2012-03-17 07:03

44 楼

庄的病毒-蛋白互作很多就是用smFRET的啊。。。和STORM好像关系不大
至少我去年JC看了几篇她的HIV逆转录起始方面的文章，都是FRET。。。
顺便，觉得庄姐姐的paper写作很不错，至少我看得那几篇逻辑非常清楚，读起来很舒服。。。

v*s2012-03-17 07:03

45 楼

我知道的这个方法就是测分子在溶液里面的diffusion constant，还是make sense的。
你这么想两个极端情况，分子完全不动，那你的time trace要么是0，要么是1，反正是
个constant，time correlation是1，分子动得特别快，time trace都是从0一下子跳到
1，或者从1一下子跳到0，time correlation是0。其他时候介于两者之间，分子扩散越
快，time correlation越小。其中还有一个参数是分子体积，如果分子体积已知，就可
以算diffusion constant，反过来如果diffusion constant已知，就可以算分子体积。
不知道怎么测细胞。

【在 s******y 的大作中提到】

: 我怎么觉得这个方法。。。怎么看怎么让我觉得不舒服。。。
: 活细胞可是会动的，怎么把细胞运动带来的噪音消除掉？
: 而且细胞可不是只往一个方向跑，而经常是在那里抖来抖去的。

b*s2012-03-17 07:03

46 楼

在数据分析中，他们会做一些correlation，据说可以去除移动带来的噪音。
我想知道楼上有人说FCS主要使用平衡态体系，如果这样，应当不适用活体细胞，更使
用溶液的环境。
细胞内有复杂的cytoplasmic streaming，并且有大量的cytoplasmic components导致
的运动延迟。

【在 s******y 的大作中提到】

: 我怎么觉得这个方法。。。怎么看怎么让我觉得不舒服。。。
: 活细胞可是会动的，怎么把细胞运动带来的噪音消除掉？
: 而且细胞可不是只往一个方向跑，而经常是在那里抖来抖去的。

v*s2012-03-17 07:03

47 楼

庄jj的presentation也是很好的，甩sunney xie院士几条街。

舒服。。。

【在 w***x 的大作中提到】

: 庄的病毒-蛋白互作很多就是用smFRET的啊。。。和STORM好像关系不大
: 至少我去年JC看了几篇她的HIV逆转录起始方面的文章，都是FRET。。。
: 顺便，觉得庄姐姐的paper写作很不错，至少我看得那几篇逻辑非常清楚，读起来很舒服。。。

a*q2012-03-17 07:03

48 楼

如果你关心的是扩散系数的精确值，在细胞里面做当然很困难，因为分子的行为可能根
本就不是随机扩散。但是如果想看的东西不依赖扩散的模型的话，比如扩散速度的相对
变化，或者是在细胞里面分子的行为偏离随机扩散有多远等等，FCS是没有任何问题的
。这些东西对于FRAP是同样适用的。
说平衡态体系主要指FCS是在一个没有被扰动的稳态（也就是细胞或者溶液的平常状态
）测的，而FRAP是先改变这个体系然后看它多快恢复稳态。

【在 b******s 的大作中提到】

: 在数据分析中，他们会做一些correlation，据说可以去除移动带来的噪音。
: 我想知道楼上有人说FCS主要使用平衡态体系，如果这样，应当不适用活体细胞，更使
: 用溶液的环境。
: 细胞内有复杂的cytoplasmic streaming，并且有大量的cytoplasmic components导致
: 的运动延迟。

a*q2012-03-17 07:03

49 楼

时间尺度不一样吧。分子扩散造成的涨落都在微秒到毫秒级的，细胞自己的运动可以很
容易分辨出来。

【在 s******y 的大作中提到】

: 我怎么觉得这个方法。。。怎么看怎么让我觉得不舒服。。。
: 活细胞可是会动的，怎么把细胞运动带来的噪音消除掉？
: 而且细胞可不是只往一个方向跑，而经常是在那里抖来抖去的。

s*y2012-03-17 07:03

50 楼

如果只能测溶液的话，那么对我们学cell biol的人就没有太多意思了。
而且也不可能代替FRAP.
其实如果只是想看在细胞里扩散的话，还不如直接用photo-activatable fluorescent
protein 吧？

【在 v*****s 的大作中提到】

: 我知道的这个方法就是测分子在溶液里面的diffusion constant，还是make sense的。
: 你这么想两个极端情况，分子完全不动，那你的time trace要么是0，要么是1，反正是
: 个constant，time correlation是1，分子动得特别快，time trace都是从0一下子跳到
: 1，或者从1一下子跳到0，time correlation是0。其他时候介于两者之间，分子扩散越
: 快，time correlation越小。其中还有一个参数是分子体积，如果分子体积已知，就可
: 以算diffusion constant，反过来如果diffusion constant已知，就可以算分子体积。
: 不知道怎么测细胞。

b*s2012-03-17 07:03

51 楼

我刚做过photo-convertible protein. 我觉得这种tag有时候不是很理想。他们
convert需要一定能量的laser，但是多于或者少于最佳能量的laser也能导致部分
convert。这就导致convert的区域并不精确。附近一定区域内的蛋白都会多少被
convert。尤其是想在胞内做convert，我觉得即使用双光子都不够理想。

fluorescent

【在 s******y 的大作中提到】

: 如果只能测溶液的话，那么对我们学cell biol的人就没有太多意思了。
: 而且也不可能代替FRAP.
: 其实如果只是想看在细胞里扩散的话，还不如直接用photo-activatable fluorescent
: protein 吧？

a*q2012-03-17 07:03

52 楼

最早的细胞里面的FCS实验差不多有十年了吧，一直都有人在做，很多时候可以代替
FRAP或者比FRAP更好，但是仪器和数据分析没有FRAP简单，而且一直没有特别突出的成
果就是了。

fluorescent

【在 s******y 的大作中提到】

: 如果只能测溶液的话，那么对我们学cell biol的人就没有太多意思了。
: 而且也不可能代替FRAP.
: 其实如果只是想看在细胞里扩散的话，还不如直接用photo-activatable fluorescent
: protein 吧？

b*s2012-03-17 07:03

53 楼

我很想知道的是，FCS理论上看比FRAP似乎更适合活体，不会有photo bleach，也没有
phototoxicity，对活体细胞干扰最小。为什么没有取得突出成果。FCS现在发展出了很
多不同的方法，像上文有人说到的N&B，RICS， PCF。看起来对研究活体蛋白很有用。
有什么比较大的局限导致应用不多，成果不大呢？

【在 a*q 的大作中提到】

: 最早的细胞里面的FCS实验差不多有十年了吧，一直都有人在做，很多时候可以代替
: FRAP或者比FRAP更好，但是仪器和数据分析没有FRAP简单，而且一直没有特别突出的成
: 果就是了。
:
: fluorescent

a*q2012-03-17 07:03

54 楼

我猜的话，FCS有条件用的人、用得好的人还是太少。毕竟不像FRAP那样，大多数显微
镜都可以凑合着做，找个Excel都可以分析数据，几乎每个生物实验室都可以去试一
试，虽然大部分时候也没有很怎么样的结果，但是总会撞到好运气的。

【在 b******s 的大作中提到】

: 我很想知道的是，FCS理论上看比FRAP似乎更适合活体，不会有photo bleach，也没有
: phototoxicity，对活体细胞干扰最小。为什么没有取得突出成果。FCS现在发展出了很
: 多不同的方法，像上文有人说到的N&B，RICS， PCF。看起来对研究活体蛋白很有用。
: 有什么比较大的局限导致应用不多，成果不大呢？

s*y2012-03-17 07:03

55 楼

啊？难道你们不能把激光束调到0.5 um 的一个点么？
这样的话还是能比较定点的。

【在 b******s 的大作中提到】

: 我刚做过photo-convertible protein. 我觉得这种tag有时候不是很理想。他们
: convert需要一定能量的laser，但是多于或者少于最佳能量的laser也能导致部分
: convert。这就导致convert的区域并不精确。附近一定区域内的蛋白都会多少被
: convert。尤其是想在胞内做convert，我觉得即使用双光子都不够理想。
:
: fluorescent

s*y2012-03-17 07:03

56 楼

哦，你这么一讲我就明白了。

【在 a*q 的大作中提到】

: 时间尺度不一样吧。分子扩散造成的涨落都在微秒到毫秒级的，细胞自己的运动可以很
: 容易分辨出来。

h*w2012-03-17 07:03

57 楼

SRS 在临床和基础生物学的用途会远超superres 。 Superres照完会被覆折射率材料高
调。
Sunny 高出superres SRS了，给个link 阿

f*u2012-03-17 07:03

58 楼

能给个连接吗？Google了一下没查到。他是开了个公司吗？
另外这个玩艺儿如果买来了以后维护升级什么的怎么办？

【在 a*q 的大作中提到】

: 德国的Ernst Stelzer在卖他们搭的仪器，

a*52012-03-17 07:03

59 楼

自己搭不贵，一个TIRF+激光器+低温CCD够了，当然，商业化了的就贵了，nikon一套全
配置要200k刀
分析有商业化的，也有免费的，当然最放心的还是自己写代码。目前用过的最好的是
nikon的软件（单独不卖似乎）和免费的rapidSTORM

【在 e***o 的大作中提到】

: 这套系统的硬件好像不是太贵，数据分析很难。据说现在有商业化的。不知道有谁在用
: 这套体系作实验没有，是不是需要train很长的时间才能玩得转？

a*52012-03-17 07:03

60 楼

单分子成像的分辨率又不是无限小的，目前技术条件只能到10nm左右，真的到了生物样
品，能接近20nm就很好很好了
拟合得到的位置不会只在某像素中心，取决于周围pixel。拟合的最终分辨率取决于CCD
分辨率，photon量和本底噪音水平。好几篇发表了的protocol都有详细讨论。

【在 v*****s 的大作中提到】

: 只要你运气不是太差，多分子的光团很难恰好也能符合高斯拟合，换句话说，你单分子
: 的光团理论上讲只有一个亮度中心，其余地方的亮度在极坐标下应该和角度无关，只依
: 赖于到亮度中心的距离，多分子的光团（特别是两分子，三分子的时候）几乎做不到这
: 一点，所以去掉这个倒不难。
: 但我始终对这玩意的原理感到不安，他实质上就是一个deconvolution。你看到的东西
: 是你的真实信号（假设是dirac function）和你的Instrument response（一个200纳米
: 的gaussian function）的convolution。那么你把gaussian function从你看到的东西
: 里面deconvolute掉以后，就是真实信号了。他只不过为了降低deconvolution的难度，
: 加了一些限制条件（真实信号只是单个dirac function）。
: 按这个理论，任何仪器的时空精度都可以无限了。我觉得不靠谱的，随便想一下，这个

m*o2012-03-17 07:03

61 楼

天啦，这么多牛人。我是彻底看不懂这些了。
可是综合看来，如果我有一个蛋白，想看看in vivo 是否由于miss folding 而失活
，那肯定不行，对吗？但是，可以in vitro 看看。
主要是，这么fancy 的东西，到底cell bology 上有没有用。

a*52012-03-17 07:03

62 楼

因为是stochastic的，当然不能排除个别情况下有多个相近的分子同时switch on的可
能。但后期处理时，这种事件很容易分辨。
你所说的“疑似”和“去掉”是通过一整套rejection criteria完成，包括photon数，
拟合精度，spatial profile（比如，width，椭圆率等），等等。其实，在相当大的区
间内，这个criteria的设置对最终分布影响不大。

off switching是个随机过程，也就是说即使能做到>99%的单分子都分得很开，也没人
能100％保证没有挤成一团发光的分子。疑似来自多分子的光团需要在图像处理中去掉
。我不是做这个的，具体方法我也不清楚，不过从“疑似”和“去掉”两词，大家可以
细心体会这里面水有多深。

【在 p*l 的大作中提到】

: STED对激光有些特殊要求，不是总功率大就行了。
: STED造doughnut的方法，早Hell几十年就有人知道怎么做了，可是一直只是
: 做光学的人自娱自乐的一个小东西。Hell从骨子上是个物理学家，他自己造激
: 光可以，但是做optical enigineering 的底子差点，所以走了好多弯路才发现
: 做doughnut方法已经在那里了。如果是专做imaging system engineering
: 的人，可能第一时间就想到了。不过我自己觉得想法比工程实现重要的多。
: 想法好，目标明确，工程上的难题不管花多久总能解决的。现在回头看Hell成
: 名前的文章，杂七杂八试了好多不靠谱的工程方案，个中心酸，恐怕只有同行
: 能感觉得到。

a*52012-03-17 07:03

63 楼

目前还没人做in vivo。
目前的应用主要在1）fixed cell/tissue的multi-color immuno 和 2）culture cell
的live imaging。
1的应用可以很广泛，因为STORM虽然分辨率不如EM，但有很多EM无法完成的功能。2的
例子比如细胞骨架dynamics以及某种蛋白的动态tracking等等。
要做in vivo，挑战在于：PALM的纵身太小，<10microns, 以及sample drifting等等。

【在 m***o 的大作中提到】

: 天啦，这么多牛人。我是彻底看不懂这些了。
: 可是综合看来，如果我有一个蛋白，想看看in vivo 是否由于miss folding 而失活
: ，那肯定不行，对吗？但是，可以in vitro 看看。
: 主要是，这么fancy 的东西，到底cell bology 上有没有用。

s*e2012-03-17 07:03

64 楼

光是看蛋白的高分辨空间分布也非常重要啊。比如最近的这篇看Focal Adhesion蛋白空
间分布的:
P. Kanchanawong, G. Shtengel, A. Pasapera-Limon, E. Ramko, M.W. Davidson, H.
F. Hess, C. M. Waterman. “Nanoscale Architecutre of Integrin-based
Adhesions”, Nature, 468(7323): 580-4, 2010.
以及Sunny Xie和Xiaowei Zhuang看E.Coli nucleoid associated protein分布的:
Science 9 September 2011:
Vol. 333 no. 6048 pp. 1445-1449
DOI: 10.1126/science.1204697
Chromosome Organization by a Nucleoid-Associated Protein in Live Bacteria

【在 m***o 的大作中提到】

: 天啦，这么多牛人。我是彻底看不懂这些了。
: 可是综合看来，如果我有一个蛋白，想看看in vivo 是否由于miss folding 而失活
: ，那肯定不行，对吗？但是，可以in vitro 看看。
: 主要是，这么fancy 的东西，到底cell bology 上有没有用。

p*l2012-03-17 07:03

65 楼

这个Focal Adhesion的文章是用iPALM做的。这个iPALM装置，不是一般的变态。

H.

【在 s***e 的大作中提到】

: 光是看蛋白的高分辨空间分布也非常重要啊。比如最近的这篇看Focal Adhesion蛋白空
: 间分布的:
: P. Kanchanawong, G. Shtengel, A. Pasapera-Limon, E. Ramko, M.W. Davidson, H.
: F. Hess, C. M. Waterman. “Nanoscale Architecutre of Integrin-based
: Adhesions”, Nature, 468(7323): 580-4, 2010.
: 以及Sunny Xie和Xiaowei Zhuang看E.Coli nucleoid associated protein分布的:
: Science 9 September 2011:
: Vol. 333 no. 6048 pp. 1445-1449
: DOI: 10.1126/science.1204697
: Chromosome Organization by a Nucleoid-Associated Protein in Live Bacteria

h*g2012-03-17 07:03

66 楼

还是你说的比较靠谱

【在 f**u 的大作中提到】

: 我知道你说的这个方法，也记得庄好像用的不是这个。
: 庄的方法我记得是用比较弱的激发光，然后样品里面只有很小部分的荧光分子被激发，
: 从概率上来说两个相邻很紧的荧光分子被同时激发的可能性就很小了。
: 每个被激发的荧光分子会产生一个信号斑，然后她就认为这个斑的中心就是荧光分子所
: 在。
: 这个过程可以重复很多次，然后就可以得到很高的分辨率。
: 我印象里Janelia农场也有个人在做这个技术。
: 这个技术的缺点可能就是很慢，因为要扫很多次。

v*s2012-03-17 07:03

67 楼

这个penetration depth的问题按说解决之道并不难，上near-IR laser，利用up-
conversion或者two-photon就好了，不知道为啥还没有应用到in vivo。

cell

【在 a****5 的大作中提到】

: 目前还没人做in vivo。
: 目前的应用主要在1）fixed cell/tissue的multi-color immuno 和 2）culture cell
: 的live imaging。
: 1的应用可以很广泛，因为STORM虽然分辨率不如EM，但有很多EM无法完成的功能。2的
: 例子比如细胞骨架dynamics以及某种蛋白的动态tracking等等。
: 要做in vivo，挑战在于：PALM的纵身太小，<10microns, 以及sample drifting等等。

h*w2012-03-17 07:03

68 楼

为什么全场TPF不行。
倒是用time spatial lens 是个办法。搭一个试试啊

【在 v*****s 的大作中提到】

: 这个penetration depth的问题按说解决之道并不难，上near-IR laser，利用up-
: conversion或者two-photon就好了，不知道为啥还没有应用到in vivo。
:
: cell

v*s2012-03-17 07:03

69 楼

wide-field two-photon fluorescence？激光强度肯定不够吧。TPF是非线性效应，和
intensity square成正比，一般都要求聚焦的。
time-spatial lens是什么？

【在 h*w 的大作中提到】

: 为什么全场TPF不行。
: 倒是用time spatial lens 是个办法。搭一个试试啊

m*22012-03-17 07:03

70 楼

mark.
最近做一个相关的东西，正在学习。
有没有高手来说说庄小姐跟谢童鞋做的东西不同再哪里。。。
多谢

v*s2012-03-17 07:03

71 楼

庄jj作的东西前面说的都很清楚了吧，简单来说就是利用FL实现超分辨。
谢院士对Fluorescence和SERS需要用的label深恶痛绝，所以独辟蹊径，利用
stimulated emission在vibrational state上实现了label-free imaging，号称
stimulated Raman scattering microscopy，在stimulated emission下观测Raman信号
的减少来定位分子。因为这个信号减少量很小（10^-4），所以需要用AOM调制去噪。

【在 m******2 的大作中提到】

: mark.
: 最近做一个相关的东西，正在学习。
: 有没有高手来说说庄小姐跟谢童鞋做的东西不同再哪里。。。
: 多谢

a*q2012-03-17 07:03

72 楼

指的是Spatial-temporal focusing吧？
Confined activation and subdiffractive localization enables whole-cell PALM
with genetically expressed probes
Andrew G York, Alireza Ghitani, Alipasha Vaziri, Michael W Davidson &
Hari Shroff
Nature Methods 8, 327-333 doi:10.1038/nmeth.1571
跟SPIM结合也可以
Live-cell 3D super-resolution imaging in thick biological samples
Francesca Cella Zanacchi, Zeno Lavagnino, Michela Perrone Donnorso,
Alessio Del Bue, Laura Furia, + et al
Nature Methods 8, 1047-1049 doi:10.1038/nmeth.1744

【在 v*****s 的大作中提到】

: wide-field two-photon fluorescence？激光强度肯定不够吧。TPF是非线性效应，和
: intensity square成正比，一般都要求聚焦的。
: time-spatial lens是什么？

z*g2012-03-17 07:03

73 楼

咳！看来没人把STED原理讲清楚，我就简单说一下吧。
因为任何可见光发光点都有半波长衍射极限，所以光学分辨的理论极限是可见光下限
400nm的一半。
STED（stimulated emission depletion），中文可译为受激发射损耗。
STED的核心思想是，用一束光斑象面包圈(Donut)的、波长比激发光略长的激光将荧光
分子的受激荧光强制损耗掉。
也就是用Donut laser强行让激发态的电子回到基态(stimulated emission)，这个过程
也会发出荧光，但与正常跃迁的荧光波长不一样，可被过滤。
于是只剩下如一根针似的荧光，在XY平面上的分辨率就大大提高了，据称可以达到50nm
以下，但在Z方向的分辨率仍没有改善。
地狱先生（Stefan W. Hell）在读博的时候狂热于超分辨显微技术，1990年博士毕业之
后在家待业一年，发明了4Pi显微镜。然后大概在93年做第二个博后时，某天看光学物
理书，突发灵感，发明了STED，原理就是利用了光学中的受激发射跃迁(Stimulated
emission)。
娃娃鱼拼错了stimulated。simulate是模拟。
ahvy (生命不息)属于干扰信息，可忽略。
发信人: pll (娃娃鱼), 信区: Biology
标题: Re: 哪位能科普一下ZHUANG的单分子荧光
发信站: BBS 未名空间站 (Mon Mar 19 02:05:03 2012, 美东)
Hell的STED传承于爱因斯坦。
当年爱因斯坦预言了simulated emission effect，几十年后，人们靠特殊物质的
stimulated emission effect造出了激光，激光出现几十年后，Hell靠着强大的激光在
生物样品中做出了simulated emission effect，在这个effect的基础上实现了超分辨
成像。
爱因斯坦才是真正的牛人，特别敢想，而且只想不做实验，把实验都留给了别人做，造
就好几个实验诺奖。

z*g2012-03-17 07:03

74 楼

咳！看来没人把STED原理讲清楚，我就简单说一下吧。
因为任何可见光发光点都有半波长衍射极限，所以光学分辨的理论极限是可见光下限
400nm的一半。
STED（stimulated emission depletion），中文可译为受激发射损耗。
STED的核心思想是，用一束光斑象面包圈(Donut)的、波长比激发光略长的激光将荧光
分子的受激荧光强制损耗掉。
也就是用Donut laser强行让激发态的电子回到基态(stimulated emission)，这个过程
也会发出荧光，但与正常跃迁的荧光波长不一样，可被过滤。
于是只剩下如一根针似的荧光，在XY平面上的分辨率就大大提高了，据称可以达到50nm
以下，但在Z方向的分辨率仍没有改善。
地狱先生（Stefan W. Hell）在读博的时候狂热于超分辨显微技术，1990年博士毕业之
后在家待业一年，发明了4Pi显微镜。然后大概在93年做第
二个博后时，某天看光学物理书，突发灵感，发明了STED，原理就是利用了光学中的受
激发射跃迁(Stimulated emission)。
荧光分子的标记问题一直存在，但如果不标记就无法看见，TRP/TYR/PHE的荧光目前还
不能做为研究工具。
化学染料有细胞毒性，要load，会leak，会淬灭漂白。Genetically encoded
indicators (like GFP/CFP/YFP/RFP) has also photobleach problem.
娃娃鱼拼错了stimulated。simulate是模拟。
ahvy (生命不息)属于干扰信息，请无视。

i*g2012-03-17 07:03

75 楼

面带表情地飘过

a*q2012-03-17 07:03

76 楼

Z方向上的分辨率比xy方向差是单个显微镜物镜会聚光线的本质决定的。把STED和4Pi结
合起来就可以做到xyz一样的30nm分辨率，iPALM也是一样的道理。只是这样的仪器全世
界也没有几个人有本事搭起来还用得起来。

50nm

【在 z********g 的大作中提到】

: 咳！看来没人把STED原理讲清楚，我就简单说一下吧。
: 因为任何可见光发光点都有半波长衍射极限，所以光学分辨的理论极限是可见光下限
: 400nm的一半。
: STED（stimulated emission depletion），中文可译为受激发射损耗。
: STED的核心思想是，用一束光斑象面包圈(Donut)的、波长比激发光略长的激光将荧光
: 分子的受激荧光强制损耗掉。
: 也就是用Donut laser强行让激发态的电子回到基态(stimulated emission)，这个过程
: 也会发出荧光，但与正常跃迁的荧光波长不一样，可被过滤。
: 于是只剩下如一根针似的荧光，在XY平面上的分辨率就大大提高了，据称可以达到50nm
: 以下，但在Z方向的分辨率仍没有改善。

a*q2012-03-17 07:03

77 楼

http://www.lmg.embl.de/home.html
据说已经卖了不少了。你可以联系他们试试。

【在 f**u 的大作中提到】

: 能给个连接吗？Google了一下没查到。他是开了个公司吗？
: 另外这个玩艺儿如果买来了以后维护升级什么的怎么办？

l*12012-03-17 07:03

78 楼

EMBL Grenoble ERSF Beamline X33
this World has only one unit.
ps:
//www.embl.de/aboutus/communication_outreach/publications/raag/raag12.pdf
or
//issuu.com/embl/docs/raag2012
//hasyweb.desy.de/science/annual_reports/2007_report/part2/contrib/73/21800.pdf
//erl.chess.cornell.edu/gatherings/2011_Workshops/talks/WS2Svergun.pdf

【在 a*q 的大作中提到】

: Z方向上的分辨率比xy方向差是单个显微镜物镜会聚光线的本质决定的。把STED和4Pi结
: 合起来就可以做到xyz一样的30nm分辨率，iPALM也是一样的道理。只是这样的仪器全世
: 界也没有几个人有本事搭起来还用得起来。
:
: 50nm

l*u2012-03-17 07:03

79 楼

hahaha,
in german, "hell" means bright

50nm

【在 z********g 的大作中提到】

: 咳！看来没人把STED原理讲清楚，我就简单说一下吧。
: 因为任何可见光发光点都有半波长衍射极限，所以光学分辨的理论极限是可见光下限
: 400nm的一半。
: STED（stimulated emission depletion），中文可译为受激发射损耗。
: STED的核心思想是，用一束光斑象面包圈(Donut)的、波长比激发光略长的激光将荧光
: 分子的受激荧光强制损耗掉。
: 也就是用Donut laser强行让激发态的电子回到基态(stimulated emission)，这个过程
: 也会发出荧光，但与正常跃迁的荧光波长不一样，可被过滤。
: 于是只剩下如一根针似的荧光，在XY平面上的分辨率就大大提高了，据称可以达到50nm
: 以下，但在Z方向的分辨率仍没有改善。

l*u2012-03-17 07:03

80 楼

he has moved to Frankfurt.

【在 a*q 的大作中提到】

: http://www.lmg.embl.de/home.html
: 据说已经卖了不少了。你可以联系他们试试。

f*u2012-03-17 07:03

81 楼

多谢了

【在 a*q 的大作中提到】

: http://www.lmg.embl.de/home.html
: 据说已经卖了不少了。你可以联系他们试试。

f*u2012-03-17 07:03

82 楼

所以德国人最近改进了light sheet microscopy。
最初的型号样品是上下移动的，他们现在有人把样品做成旋转的，
这样估计能改进Z的分辨率。

【在 a*q 的大作中提到】

: Z方向上的分辨率比xy方向差是单个显微镜物镜会聚光线的本质决定的。把STED和4Pi结
: 合起来就可以做到xyz一样的30nm分辨率，iPALM也是一样的道理。只是这样的仪器全世
: 界也没有几个人有本事搭起来还用得起来。
:
: 50nm

p*u2012-03-17 07:03

83 楼

庄姑娘长得挺好看的。

techniques

【在 m***o 的大作中提到】

: 不是生物领域，感觉Harvard 庄晓薇的这个方向作的好牛。她真的能够看见单分子的
: in vivo 的运动吗？还有， Nucleic Acid - Protein Interactions？
: Single-Molecule biology:
: Nucleic Acid - Protein Interactions
: We explore single-molecule fluorescence imaging and spectroscopy techniques
: to study complex biomolecular systems.

a*y2012-03-17 07:03

84 楼

I only had time to input two sentences. I don't understand that why do you
want to pick on me?
Frankly, even for the information you mentioned below, they are not accurate:
for example
学分辨的理论极限是可见光下限: 400nm的一半 -wrong
You comments on fluorescent dyes are also superficial.
You can go back to look at my previous two sentences. I don;t know why you
commented that I was distrubing?

50nm

【在 z********g 的大作中提到】

: 咳！看来没人把STED原理讲清楚，我就简单说一下吧。
: 因为任何可见光发光点都有半波长衍射极限，所以光学分辨的理论极限是可见光下限
: 400nm的一半。
: STED（stimulated emission depletion），中文可译为受激发射损耗。
: STED的核心思想是，用一束光斑象面包圈(Donut)的、波长比激发光略长的激光将荧光
: 分子的受激荧光强制损耗掉。
: 也就是用Donut laser强行让激发态的电子回到基态(stimulated emission)，这个过程
: 也会发出荧光，但与正常跃迁的荧光波长不一样，可被过滤。
: 于是只剩下如一根针似的荧光，在XY平面上的分辨率就大大提高了，据称可以达到50nm
: 以下，但在Z方向的分辨率仍没有改善。

i*g2012-03-17 07:03

85 楼

庄长得一般吧，谢倒是算帅哥，看他年轻时的照片，秒杀很多ws生物男吧：
http://www.pkuschool.edu.cn/article-gzb.aspx?menuid=1290&tab=ta

庄姑娘长得挺好看的。
techniques

【在 p****u 的大作中提到】

: 庄姑娘长得挺好看的。
:
: techniques

s*s2012-03-17 07:03

86 楼

谢上次来做报告，头发梳得根根顺，秒杀99%生物wsn。靠在前台角落里
拿着ipad假装忙，我觉得一定是在偷偷打鸟

【在 i****g 的大作中提到】

: 庄长得一般吧，谢倒是算帅哥，看他年轻时的照片，秒杀很多ws生物男吧：
: http://www.pkuschool.edu.cn/article-gzb.aspx?menuid=1290&tab=ta
:
: 庄姑娘长得挺好看的。
: techniques

p*l2012-03-17 07:03

87 楼

STED的原理，在物理版讲可以只说一句，共振荧光抑制自发荧光，在生
物版讲，就得比较科普了。
Stimulated emission现象是爱因斯坦预言的。一个荧光分子，在被激发
后，会把能量辐射发出去。发出去的这个emission的波长一定是比激发光
长的。这个是能量守恒决定的。但是具体emission的波长，是有个几率分
布的。这个分布，就是荧光分子的emission spectrum，或者，准确的说，
是荧光分子的spontanouse emission spectrum。这里的spontanouse是
指，荧光分子的emission过程是自发的，没有任何外界调控。把荧光样
品在显微镜下照照片子，看到的都是spontanouse emission。
爱因斯坦预言，如果在激发一个荧光分子的同时，还加上一个很强的光场，
这个附加光的波长，恰好在spontanouse emission spectrum之内，那么
你可以把所用的emission通过共振都调制到这个附加光的波长上。这时候，
整个fluorescence emission成了一个单波长的stimulated emission，荧光
在别的波长上都没了。这个预言是完全是空对空纸面上推出来的，没有一
点实验证据。其背后的原因是，要观测到spontanouse emission，需要高
强度单波长光源来做附加的stimulating light。在那个没有激光只有灯泡的
年代，这个实验是很难做。
可是stimulated emission恰好是制造高强度单波长光源的极佳机理。stimulated
emission不但把所用荧光都集中到了一个波长，由于这是个
共振过程，stimulated emission下所有的荧光发射方向也是一样的。也就
是说，一旦实现强stimulated emission，你会得到一个频谱奇纯，方向性
奇佳，特别好聚焦的光源。要证明爱因斯坦预言的这个现象，实际上是要
把鸡和蛋一起做出来。实验的结果，就是人们造出了激光。
如果做反向思维，既然荧光都跑到stimulating light的波长去了，如果在别
的波长下观测荧光，岂不是就看不到荧光了，这个现像就是Stimulated emission
depletion(STED)。STED现象在物理界其实不是什么新闻。但是
把它用到生物成像上，是非常大胆。原因两个，一个是荧光细胞实在不是
做stimulated emission现象的好样品，现象非常弱。一般物理做这个实验，
用的都是很浓很纯而且不易bleaching的荧光物质。二是，stimulated
emission现象需要极大的瞬时光强，当年的激光技术做这个很勉强，另一
方面，很难相信这么大光强不会把样品烧糊了。Hell开始做STED的时候，
two photon刚刚出炉。生物样品对极短的高强度的光脉冲照射，耐受到底
怎样，是个很大的问号。如果Hell当年有点生物背景，估计就不会敢去做这件
事了。

h*w2012-03-17 07:03

88 楼

Eric 同学不是搞了个twophoton axion beam scanning imaging 吗，比lightsheet
cool。

C*e2012-03-17 07:03

89 楼

大概看了一下，不太明白“Cryo”体现在哪里
就我一点粗浅的hands-on experience
SAXS是非常非常tricky的
而且一般都是溶液里测
不知道如果要cryo该怎么测

X-ray crystallography,
cross-validate structural models.
structures of biological macromolecules
small peptides to huge

【在 l**********1 的大作中提到】

: 庄只是徐福炼丹给秦始皇炼那个长生不老丹吧?
: Xiaoliang Sunney Xie
: Raman Scattering is King Route to 单分子Raman scattering 光 (possible)
: 1)
: Single DNA molecule detection in an optical trap using surface-enhanced Raman scattering
: //apl.aip.org/resource/1/applab/v96/i21/p213701_s1
: Abstract:
: Raman spectra from single DNA molecules in their natural aqueous environment are presented. A DNA molecule that is anchored between two optically trapped dielectric beads is suspended in a solution with nanosized silver colloid particles. The nonspecific binding of the metal to the DNA enhances the Raman scattering that is excited by a near-infrared beam. A Raman spectrum is first recorded followed by a force-extension curve that verifies the presence of a single DNA molecule.
: 2)
: Tip-enhanced Raman spectroscopy of single RNA strands: towards a novel direct-sequencing method.

p*l2012-03-17 07:03

90 楼

所有的super resolution技术，基本思路其实是一样的：既然200nm以内的多
个发光分子无法分辨，我只要能控制这些分子，不让他们全发光就好了。PALM
和STORM用随机switch达到目的，算是比较精巧的法子。Hell的思路比较猛，走
纯物理，用STED来把分子搞得不发光了。所有的super resolution方法中，STED
是最麻烦的，也是唯一不需要任何后期图像处理的，所有的麻烦事都在物理和硬
件上。
一束激发光聚焦到样品上，最理想的情况下，光斑也会有200～300nm直径。通常情况下，整个光斑中的荧光分子都会发光，你说不清楚光是从这个斑里哪部分来的。Hell的想法是，如果让光斑外圈的分子变得不发光了，那么成像分辨率就提高了。做这个只要是非线性的效应就行了，Hell也做过其他方法，但是总的看，还是STED效应最合适。

【在 p*l 的大作中提到】

: STED的原理，在物理版讲可以只说一句，共振荧光抑制自发荧光，在生
: 物版讲，就得比较科普了。
: Stimulated emission现象是爱因斯坦预言的。一个荧光分子，在被激发
: 后，会把能量辐射发出去。发出去的这个emission的波长一定是比激发光
: 长的。这个是能量守恒决定的。但是具体emission的波长，是有个几率分
: 布的。这个分布，就是荧光分子的emission spectrum，或者，准确的说，
: 是荧光分子的spontanouse emission spectrum。这里的spontanouse是
: 指，荧光分子的emission过程是自发的，没有任何外界调控。把荧光样
: 品在显微镜下照照片子，看到的都是spontanouse emission。
: 爱因斯坦预言，如果在激发一个荧光分子的同时，还加上一个很强的光场，

f*u2012-03-17 07:03

91 楼

谢谢科普。这个讲的透彻。

【在 p*l 的大作中提到】

: STED的原理，在物理版讲可以只说一句，共振荧光抑制自发荧光，在生
: 物版讲，就得比较科普了。
: Stimulated emission现象是爱因斯坦预言的。一个荧光分子，在被激发
: 后，会把能量辐射发出去。发出去的这个emission的波长一定是比激发光
: 长的。这个是能量守恒决定的。但是具体emission的波长，是有个几率分
: 布的。这个分布，就是荧光分子的emission spectrum，或者，准确的说，
: 是荧光分子的spontanouse emission spectrum。这里的spontanouse是
: 指，荧光分子的emission过程是自发的，没有任何外界调控。把荧光样
: 品在显微镜下照照片子，看到的都是spontanouse emission。
: 爱因斯坦预言，如果在激发一个荧光分子的同时，还加上一个很强的光场，

B*G2012-03-17 07:03

92 楼

zadehzhong对你第一页上发言的评论没什么问题，你说Sunnyday说的是STED，这个说法
显然是错误的，Sunnyday的最初描述更接近庄的STORM。另外我也没看出zadehzhong关
于分辨率和荧光染色剂的说法有什么错误。这个版面上专业搞成像的人多得是，上面提
到的几个老板组里的人也有，不确定的发言还是要谨慎。

accurate:

【在 a**y 的大作中提到】

: I only had time to input two sentences. I don't understand that why do you
: want to pick on me?
: Frankly, even for the information you mentioned below, they are not accurate:
: for example
: 学分辨的理论极限是可见光下限: 400nm的一半 -wrong
: You comments on fluorescent dyes are also superficial.
: You can go back to look at my previous two sentences. I don;t know why you
: commented that I was distrubing?
:
: 50nm

a*y2012-03-17 07:03

93 楼

If you refer to 专业搞成像的人, I think I am one of them.
If you look close to Sunnyday's description, it is close to one of the near-
field optical spectroscopy.
I don't think his description is for PALM/STORM. PALM can not precisely
determine where the light is delivered (to tens of nm). Mathematical
processing is the trick. Many previous post has explained this.

【在 B*G 的大作中提到】

: zadehzhong对你第一页上发言的评论没什么问题，你说Sunnyday说的是STED，这个说法
: 显然是错误的，Sunnyday的最初描述更接近庄的STORM。另外我也没看出zadehzhong关
: 于分辨率和荧光染色剂的说法有什么错误。这个版面上专业搞成像的人多得是，上面提
: 到的几个老板组里的人也有，不确定的发言还是要谨慎。
:
: accurate:

z*62012-03-17 07:03

94 楼

建议把娃娃鱼大牛的科普加精，连我这个物理一塌糊涂的人都基本看懂了...

【在 p*l 的大作中提到】

: STED的原理，在物理版讲可以只说一句，共振荧光抑制自发荧光，在生
: 物版讲，就得比较科普了。
: Stimulated emission现象是爱因斯坦预言的。一个荧光分子，在被激发
: 后，会把能量辐射发出去。发出去的这个emission的波长一定是比激发光
: 长的。这个是能量守恒决定的。但是具体emission的波长，是有个几率分
: 布的。这个分布，就是荧光分子的emission spectrum，或者，准确的说，
: 是荧光分子的spontanouse emission spectrum。这里的spontanouse是
: 指，荧光分子的emission过程是自发的，没有任何外界调控。把荧光样
: 品在显微镜下照照片子，看到的都是spontanouse emission。
: 爱因斯坦预言，如果在激发一个荧光分子的同时，还加上一个很强的光场，

a*y2012-03-17 07:03

95 楼

I went back to read the first page. I didn't see the bottom post by Sunnyday
. I only saw his post on 定位激发 (the 3rd in the row). So I said it is STED.
By combing his posts, Sunnyday basically described a mixture of STED and
PALM/STORM/FPALM.

【在 B*G 的大作中提到】

: zadehzhong对你第一页上发言的评论没什么问题，你说Sunnyday说的是STED，这个说法
: 显然是错误的，Sunnyday的最初描述更接近庄的STORM。另外我也没看出zadehzhong关
: 于分辨率和荧光染色剂的说法有什么错误。这个版面上专业搞成像的人多得是，上面提
: 到的几个老板组里的人也有，不确定的发言还是要谨慎。
:
: accurate:

s*y2012-03-17 07:03

96 楼

啊，你们不要吵了。我其实当时就是随便挑了一种我知道的最简单的方法来
举个例子而已，其实和STORM或者STED或者PALM到底有没有关系我根本不知道
（这个好像我一早就自己先招认了）。呵呵。
我其实根本就不是搞光学的，只不过看大牛们都不出声，只好硬着头皮来
抛砖引玉一下。这个版上难得有这么棒的学术帖，我也从中学到了很多，
所以大家也别太挑剔双方的语言了。

h*s2012-03-17 07:03

97 楼

The idea was originally initiated by Steven Chu.

h*s2012-03-17 07:03

98 楼

Dynamic resolution is different from static resolution.

下，整个光斑中的荧光分子都会发光，你说不清楚光是从这个斑里哪部分来的。Hell的
想法是，如果让光斑外圈的分子变得不发光了，那么成像分辨率就提高了。做这个只要
是非线性的效应就行了，Hell也做过其他方法，但是总的看，还是STED效应最合适。

【在 p*l 的大作中提到】

: 所有的super resolution技术，基本思路其实是一样的：既然200nm以内的多
: 个发光分子无法分辨，我只要能控制这些分子，不让他们全发光就好了。PALM
: 和STORM用随机switch达到目的，算是比较精巧的法子。Hell的思路比较猛，走
: 纯物理，用STED来把分子搞得不发光了。所有的super resolution方法中，STED
: 是最麻烦的，也是唯一不需要任何后期图像处理的，所有的麻烦事都在物理和硬
: 件上。
: 一束激发光聚焦到样品上，最理想的情况下，光斑也会有200～300nm直径。通常情况下，整个光斑中的荧光分子都会发光，你说不清楚光是从这个斑里哪部分来的。Hell的想法是，如果让光斑外圈的分子变得不发光了，那么成像分辨率就提高了。做这个只要是非线性的效应就行了，Hell也做过其他方法，但是总的看，还是STED效应最合适。

z*g2012-03-17 07:03

99 楼

4Pi是用两个相对的物镜变相地把数值孔径变大了，其在Z轴上的分辨率在100nm左右。
而且两个直接相对、距离很近的物镜，把样品的厚度也限制了，大概在数十微米以下。
在此基础上加入STED，难度不是一般的大啊！
旋转样品的方法倒是不错，如果用油镜或水镜就麻烦了。
我知道 Yale 的年轻AP Dr. Joerg Bewersdorf，把STED与TIRF结合起来，这样可以把Z
轴的分辨率做到50nm以下。
这也是一种结合型的创新，但这种方法也受制于TIRF的局限，只能用于观察细胞表面的
活动，不能观察到细胞内部生物大分子的活动。
娃娃鱼同学给我们解释了很多光学物理的原理，让大伙受益非浅。
西瓜同学的解卷积想法很有启发。
学化学的同学，对于分子的概念很强。
学生物的同学，对于biological events很熟悉。
多来点学光学、学物理的同行，大家一起交流，共同进步。
第一页中，Sunnyday说的荧光强度呈现某种非线性分布（如高斯分布），可用数学或光
学方法进行过滤优化分辨率，但我怀疑这种处理可能不能使分辨率远小于200nm。专家
指点一下吧。
ahvy, don't take it personal.
如果你的专业跟你的表现一样强硬，为何要把第一页中你的前两条乱shoot的comments
删掉呢？可惜别人回复中还是能看到的。
年轻人，谦虚点! 无论你将来是在学术界还是工业界混，记得要先留意自己的破绽。等
你到了我这把年纪，就会知道越尖锐的东西越容易折断，除非你够硬。
我也不是行家，只希望能在交流中多学习成长。

发信人: sunnyday (飞鱼), 信区: Biology
标题: Re: 哪位能科普一下ZHUANG的单分子荧光
发信站: BBS 未名空间站 (Sun Mar 18 21:09:29 2012, 美东)
在我的理解里，一种最简单的方法，就是用机械的方式，把激光的激发头
对准某个点，对准的精度可以达到纳米。当然，激光对得再准，也有一个
发出的光的光斑问题，因为因为激光也是光，也有一个0.2um的问题，但是通过计算，
可以知道激光点的那个光斑里面的最高强度的峰的位置在哪里，然后再经过计算，就知
道应该是什么什么范围里面能受到最大的激发（这个范围就会远小于0.2um）。然后一
条线上扫描过去后，再经过计算，把那些因为是受到非光峰的
散光而被激发的点的信号给抹去，剩下的点大概应该就是精确的点了。

【在 f**u 的大作中提到】

: 所以德国人最近改进了light sheet microscopy。
: 最初的型号样品是上下移动的，他们现在有人把样品做成旋转的，
: 这样估计能改进Z的分辨率。

s*y2012-03-17 07:03

100 楼

我汗一下，看来是因为我引起的，所以我还是再澄清一下吧，
因为我本身其实不是做光学的，仅仅是用户而已，所以对那些原理的问题一向
都是一知半懂。我说的那个定点激发，其实是以前别人向我解释某某显微镜的
时候这么简单的告诉我的。
但是后来有人追着问我到底怎么个定点激发，我只好乱举了一种我知道的貌似
可以用的技术而已。正如后来的人指出的那样，我那个例子在机械上貌似
比较贴近STED或者near-field spec （需要准确定点然后进行扫描，所以
在这个角度上ahvy其实也不算说错了）, 但是在光学上又貌似不是（比方说
没有指出需要donut，所以在这个角度上你是对的)。但是我作为一个用户，
真的知道不了那么深（比方说那个donut），所以只是比较浅的谈了一个
理论上貌似可以的例子而已，我在原贴中一开头就指出了，必须由俺师姐
娃娃鱼说的为准。所以大家也别再为这个我信口扯出来的例子伤脑筋和伤和气了。
呵呵。
至于near-field spec，据说也是可以突破200um 的（貌似在探头那里
动些手脚就可以了？）。原理貌似和扫描电镜差不多。不过没有什么人用，
因为要把探头弄得和样品特别近才行，估计顶多勉勉强强能扫个表面或者
断面吧，可能不太适合大部分生物样品。

把Z

【在 z********g 的大作中提到】

: 4Pi是用两个相对的物镜变相地把数值孔径变大了，其在Z轴上的分辨率在100nm左右。
: 而且两个直接相对、距离很近的物镜，把样品的厚度也限制了，大概在数十微米以下。
: 在此基础上加入STED，难度不是一般的大啊！
: 旋转样品的方法倒是不错，如果用油镜或水镜就麻烦了。
: 我知道 Yale 的年轻AP Dr. Joerg Bewersdorf，把STED与TIRF结合起来，这样可以把Z
: 轴的分辨率做到50nm以下。
: 这也是一种结合型的创新，但这种方法也受制于TIRF的局限，只能用于观察细胞表面的
: 活动，不能观察到细胞内部生物大分子的活动。
: 娃娃鱼同学给我们解释了很多光学物理的原理，让大伙受益非浅。
: 西瓜同学的解卷积想法很有启发。

z*g2012-03-17 07:03

101 楼

门外汉瞎猜一下.
Cryo是不是指溶液样品滴到液氮里冻一下，就象Cryo-EM的样品前处理似的？
不知道现在的SAXS分辨率能到1nm，以前有个同学测，看到的蛋白结构就是个大概轮廓
，细节什么的都不清楚，还不如做电镜呢。现在膜蛋白的Cryo-EM也有办法做了。

【在 C*******e 的大作中提到】

: 大概看了一下，不太明白“Cryo”体现在哪里
: 就我一点粗浅的hands-on experience
: SAXS是非常非常tricky的
: 而且一般都是溶液里测
: 不知道如果要cryo该怎么测
:
: X-ray crystallography,
: cross-validate structural models.
: structures of biological macromolecules
: small peptides to huge

l*12012-03-17 07:03

102 楼

Please refer figure:
cited from PDF document of EMBL and ESRF Geneva/Grenoble
link:
//erl.chess.cornell.edu/gatherings/2011_Workshops/talks/WS2Svergun.pdf

【在 z********g 的大作中提到】

: 门外汉瞎猜一下.
: Cryo是不是指溶液样品滴到液氮里冻一下，就象Cryo-EM的样品前处理似的？
: 不知道现在的SAXS分辨率能到1nm，以前有个同学测，看到的蛋白结构就是个大概轮廓
: ，细节什么的都不清楚，还不如做电镜呢。现在膜蛋白的Cryo-EM也有办法做了。

l*12012-03-17 07:03

103 楼

if without Cryo then do solution SAXS below 1.0 nm scale that particle
signal might be read as wave
signal, then your CNS or N sub manuscript wrote that your group got a new
structure might belong to Wave patterns?
德布罗意
主条目：德布罗意波
1924年，路易·德布罗意构造了德布罗意假说，声称所有的物质都有类波的属性。他将
这个波长λ和动量p联系为：
这是对爱因斯坦等式的一般化，因为光子的动量为p = E / c（c为真空中的光速），而
λ = c / ν。
德布罗意的方程三年后通过两个独立的电子散射实验被证实于电子（具有静止质量）身
上。在阿伯丁大学，乔治·佩吉特·汤姆孙将一束电子穿过薄金属片，并且观察到了预
期中的干涉样式。在贝尔实验室，克林頓·戴維森和雷斯特·革末将他们的实验电子束
穿过一个晶体。
德布罗意于1929年因为这个假设获得了诺贝尔物理学奖。汤姆孙和戴維森因为他们的实
验工作共享了1937年诺贝尔物理学奖。
//zh.wikipedia.org/wiki/波粒二象性
Ps:
//www.emeraldbiosystems.com/blog/author/Peter-Nollert.aspx
Crystal structure of small protein crambin at 0.48 Å resolution
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21505232

【在 C*******e 的大作中提到】

: 大概看了一下，不太明白“Cryo”体现在哪里
: 就我一点粗浅的hands-on experience
: SAXS是非常非常tricky的
: 而且一般都是溶液里测
: 不知道如果要cryo该怎么测
:
: X-ray crystallography,
: cross-validate structural models.
: structures of biological macromolecules
: small peptides to huge

C*e2012-03-17 07:03

104 楼

不可能冻一下再测的
因为是溶液
要给注射到一个固定的小cell里
只有十几到二十微升
这个小cell还要反复用
而且如果要cryo的话就要解决有冰的问题
就要加cryo protactant
所谓分辨率达到1nm我觉得是个极限
应该还是有别的补充信息才行
我看到的SAXS做出来的也就是个轮廓
没有细节
而且SAXS的数据处理非常tricky
另外做shape reconstruction的时候同样的数据，
输入的对称性不一样
会产生完全不同的模型

【在 z********g 的大作中提到】

: 门外汉瞎猜一下.
: Cryo是不是指溶液样品滴到液氮里冻一下，就象Cryo-EM的样品前处理似的？
: 不知道现在的SAXS分辨率能到1nm，以前有个同学测，看到的蛋白结构就是个大概轮廓
: ，细节什么的都不清楚，还不如做电镜呢。现在膜蛋白的Cryo-EM也有办法做了。

C*e2012-03-17 07:03

105 楼

回头再详细拜读一下
如果真有cryo条件下做SAXS那学习了！
上面贴的那个图很有意思
所谓1 nm的分辨率是在q^-1 6－8 nm左右的地方
而做过 SAXS的人都知道SAXS数据最最重要最最有价值的是在q^-1 0-0.1 (A^-1)的这个区间
也就是10 nm分辨率
当然这个区间重要不代表q^-1 0.1以上都不重要
不过很多fix distance beam line测量的区间在0－0.3 A^1 (0-3 nm^-1)
我个人感觉SAXS这个领域还在方法、工具建立的阶段

new

【在 l**********1 的大作中提到】

: if without Cryo then do solution SAXS below 1.0 nm scale that particle
: signal might be read as wave
: signal, then your CNS or N sub manuscript wrote that your group got a new
: structure might belong to Wave patterns?
: 德布罗意
: 主条目：德布罗意波
: 1924年，路易·德布罗意构造了德布罗意假说，声称所有的物质都有类波的属性。他将
: 这个波长λ和动量p联系为：
: 这是对爱因斯坦等式的一般化，因为光子的动量为p = E / c（c为真空中的光速），而
: λ = c / ν。

l*12012-03-17 07:03

106 楼

STORM 10nm is tricker for living imaging now
so SAXS optimized Beamline even world only had three or four : Geneva/Kobe/
Stanford/Jia-Ding Shanghai
then is better than STORM iPALM etc for 10nm scale living structure discovery.

个区间

【在 C*******e 的大作中提到】

: 回头再详细拜读一下
: 如果真有cryo条件下做SAXS那学习了！
: 上面贴的那个图很有意思
: 所谓1 nm的分辨率是在q^-1 6－8 nm左右的地方
: 而做过 SAXS的人都知道SAXS数据最最重要最最有价值的是在q^-1 0-0.1 (A^-1)的这个区间
: 也就是10 nm分辨率
: 当然这个区间重要不代表q^-1 0.1以上都不重要
: 不过很多fix distance beam line测量的区间在0－0.3 A^1 (0-3 nm^-1)
: 我个人感觉SAXS这个领域还在方法、工具建立的阶段
:

C*e2012-03-17 07:03

107 楼

SAXS可以做“living structure”的么？
学习了
你指的是切片->微结构，还是蛋白、蛋白/核酸复合物？

discovery.

【在 l**********1 的大作中提到】

: STORM 10nm is tricker for living imaging now
: so SAXS optimized Beamline even world only had three or four : Geneva/Kobe/
: Stanford/Jia-Ding Shanghai
: then is better than STORM iPALM etc for 10nm scale living structure discovery.
:
: 个区间

i*g2012-03-17 07:03

108 楼

行家趁此机会再科普一下Sunney Xie的工作吧～～

不是生物领域，感觉Harvard 庄晓薇的这个方向作的好牛。她真的能够看见单分子的
in vivo 的运动吗？还有， Nucleic Acid - Protein Interactions？
Single-Molecule biology:
Nucleic Acid - Protein Interactions
We explore single-molecule fluorescence imaging and spectroscopy techniques
to study complex biomolecular systems.

【在 m***o 的大作中提到】

: 不是生物领域，感觉Harvard 庄晓薇的这个方向作的好牛。她真的能够看见单分子的
: in vivo 的运动吗？还有， Nucleic Acid - Protein Interactions？
: Single-Molecule biology:
: Nucleic Acid - Protein Interactions
: We explore single-molecule fluorescence imaging and spectroscopy techniques
: to study complex biomolecular systems.

l*12012-03-17 07:03

109 楼

Hybrid methods:
combining synchrotron ERSF beamline X33 SAXS/CryoSAXS with X-ray
crystallography,
NMR spectroscopy, and electron microscopy
To improve the resolution and cross-validate structural models.
Small-angle X-ray scattering (SAXS) reveals low resolution (1-2 nm)
structures of biological macromolecules
in close-to-native solutions for an extremely broad range of sizes from
small peptides to huge
macromolecular machines and at variable conditions.
cited from
//www.embl-hamburg.de/research/unit/svergun/

【在 C*******e 的大作中提到】

: SAXS可以做“living structure”的么？
: 学习了
: 你指的是切片->微结构，还是蛋白、蛋白/核酸复合物？
:
: discovery.

s*y2012-03-17 07:03

110 楼

这几个技术是针对不同的场合的吧？
SAXS貌似是针对纯化了的蛋白溶液，需要对有序的样品进行叠加运算之后
倒推出结构。在我的理解中类似于一个不需要结晶的x-ray解构技术，
这个在近期内貌似没有任何希望能够用到细胞上吧？
如果要说细胞结构的话，冷冻电镜用的是类似的思路（对有序的样品进行
叠加运算），但是可以用到细胞上。
但是不管是冷冻电镜还是SAXS, 都有这个需要对象结构有序的前提，否则
就无从下手解结构了。所以在这个意义上，这两个技术和STORM/PALM/STED
是针对于不同的应用的，不太适合厚此薄彼吧。

discovery.

【在 l**********1 的大作中提到】

: STORM 10nm is tricker for living imaging now
: so SAXS optimized Beamline even world only had three or four : Geneva/Kobe/
: Stanford/Jia-Ding Shanghai
: then is better than STORM iPALM etc for 10nm scale living structure discovery.
:
: 个区间

a*q2012-03-17 07:03

111 楼

另一个关键的区别在于SAXS和冷冻电镜都需要纯化的样品。如果电镜在细胞里面的话，
至少需要能够从形貌上分辨出要看什么分子。大的结构比如说核糖体、微管可以认出来
，如果随便挑一个分子就很难说了，一大堆长的差不多的。荧光的方法就不一样，信号
的来源是知道的。
当然就分辨率而言，荧光还是比不过电镜，毕竟波长的区别在那里。

【在 s******y 的大作中提到】

: 这几个技术是针对不同的场合的吧？
: SAXS貌似是针对纯化了的蛋白溶液，需要对有序的样品进行叠加运算之后
: 倒推出结构。在我的理解中类似于一个不需要结晶的x-ray解构技术，
: 这个在近期内貌似没有任何希望能够用到细胞上吧？
: 如果要说细胞结构的话，冷冻电镜用的是类似的思路（对有序的样品进行
: 叠加运算），但是可以用到细胞上。
: 但是不管是冷冻电镜还是SAXS, 都有这个需要对象结构有序的前提，否则
: 就无从下手解结构了。所以在这个意义上，这两个技术和STORM/PALM/STED
: 是针对于不同的应用的，不太适合厚此薄彼吧。
:

l*12012-03-17 07:03

112 楼

STORM Stochastic not deterministic
even Zhuang her SHI-XIONG/SHI-DI Taekjip Ha now want to try other ways:
//physics.illinois.edu/people/profile.asp?tjha
//zhuang.harvard.edu/pi.html
please refer:
In the field of microscopy development there was again a strong emphasis on
high resolution techniques (Hess, Sauer, Hell) and on combined microscopy
techniques to manipulate the sample for example with an AFM or optical
tweezers under optical inspection (Taekjip Ha, Jan Vogelsang, Gopal
Balasubramanian)
link:
//www.picoquant.com/events/sms/images/summary_ws15.pdf
BTW, is there one medical doctor said to his/her tumor patient: by STORM
analysis
your brain tumor tissue its p53 and Mdm2 have been checked and that it is no
problem...
Do you believe that words?
or by Taekjip Ha his new optical tweezers under optical inspection
deterministic check.
You believe which side?

【在 s******y 的大作中提到】

: 这几个技术是针对不同的场合的吧？
: SAXS貌似是针对纯化了的蛋白溶液，需要对有序的样品进行叠加运算之后
: 倒推出结构。在我的理解中类似于一个不需要结晶的x-ray解构技术，
: 这个在近期内貌似没有任何希望能够用到细胞上吧？
: 如果要说细胞结构的话，冷冻电镜用的是类似的思路（对有序的样品进行
: 叠加运算），但是可以用到细胞上。
: 但是不管是冷冻电镜还是SAXS, 都有这个需要对象结构有序的前提，否则
: 就无从下手解结构了。所以在这个意义上，这两个技术和STORM/PALM/STED
: 是针对于不同的应用的，不太适合厚此薄彼吧。
:

s*y2012-03-17 07:03

113 楼

我汗一下，我没有弄明白你在问什么问题。。。

on

【在 l**********1 的大作中提到】

: STORM Stochastic not deterministic
: even Zhuang her SHI-XIONG/SHI-DI Taekjip Ha now want to try other ways:
: //physics.illinois.edu/people/profile.asp?tjha
: //zhuang.harvard.edu/pi.html
: please refer:
: In the field of microscopy development there was again a strong emphasis on
: high resolution techniques (Hess, Sauer, Hell) and on combined microscopy
: techniques to manipulate the sample for example with an AFM or optical
: tweezers under optical inspection (Taekjip Ha, Jan Vogelsang, Gopal
: Balasubramanian)

l*12012-03-17 07:03

114 楼

STORM Stochastic
is similar to below soft used in Stochastic Population Genetics:
LAMARC - Likelihood Analysis with Metropolis Algorithm using Random
Coalescence
//evolution.genetics.washington.edu/lamarc/index.html
俄罗斯外高加索人的百岁长寿因子的发掘的话不会用这类super resolution microscopy的
relative papers:
1)
/www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16618935
2)
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19737113
3)
//info-centre.jenage.de/assets/pdfs/library/williams_EVOLUTION_1957.pdf

【在 s******y 的大作中提到】

: 我汗一下，我没有弄明白你在问什么问题。。。
:
: on

C*e2012-03-17 07:03

115 楼

我的理解也是这样

【在 s******y 的大作中提到】

: 这几个技术是针对不同的场合的吧？
: SAXS貌似是针对纯化了的蛋白溶液，需要对有序的样品进行叠加运算之后
: 倒推出结构。在我的理解中类似于一个不需要结晶的x-ray解构技术，
: 这个在近期内貌似没有任何希望能够用到细胞上吧？
: 如果要说细胞结构的话，冷冻电镜用的是类似的思路（对有序的样品进行
: 叠加运算），但是可以用到细胞上。
: 但是不管是冷冻电镜还是SAXS, 都有这个需要对象结构有序的前提，否则
: 就无从下手解结构了。所以在这个意义上，这两个技术和STORM/PALM/STED
: 是针对于不同的应用的，不太适合厚此薄彼吧。
:

a*q2012-03-17 07:03

116 楼

STORM每一帧的采样是Stochastic的，但是最后很多帧的数据加起来得到的图像是完全
Deterministic的，因为是由样品里面的所有荧光标记的位置决定的，所以没有什么问
题啊。
Taekjip Ha做的AFM以及Optical Tweezer跟我们讨论的光学显微完全不是一回事。一个是跟
SAXS一样做提纯分子的研究的，一个是做细胞成像的，而且Taekjip Ha现在也在做
PALM/STORM。

ways:
emphasis
on
microscopy

【在 l**********1 的大作中提到】

: STORM Stochastic not deterministic
: even Zhuang her SHI-XIONG/SHI-DI Taekjip Ha now want to try other ways:
: //physics.illinois.edu/people/profile.asp?tjha
: //zhuang.harvard.edu/pi.html
: please refer:
: In the field of microscopy development there was again a strong emphasis on
: high resolution techniques (Hess, Sauer, Hell) and on combined microscopy
: techniques to manipulate the sample for example with an AFM or optical
: tweezers under optical inspection (Taekjip Ha, Jan Vogelsang, Gopal
: Balasubramanian)

s*y2012-03-17 07:03

117 楼

我倒。。。我还是没有理解你的问题。
你是试图在说STORM microscopy的逻辑思路不对么？
还是说super resolution microscopy不能用于某些科研场合？
如果是前者，其实那个仪器的逻辑是没有问题的。因为需要成像的对象
要么就是用抗体特异的标记了(STORM)，要么就是用荧光蛋白融合表达了(PALM)。
所以仅仅是瞬时成像的时候被激发的荧光点有随机性而已，但是总体对象是
不随机的，所以叠加起来之后应该就是一个总体的图了。
如果你是说后者，那么谁也没有指望光学显微镜能够什么问题都能回答呀，
仅仅对于某些特定样品特定用途有用而已。

microscopy的

【在 l**********1 的大作中提到】

: STORM Stochastic
: is similar to below soft used in Stochastic Population Genetics:
: LAMARC - Likelihood Analysis with Metropolis Algorithm using Random
: Coalescence
: //evolution.genetics.washington.edu/lamarc/index.html
: 俄罗斯外高加索人的百岁长寿因子的发掘的话不会用这类super resolution microscopy的
: relative papers:
: 1)
: /www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16618935
: 2)

z*g2012-03-17 07:03

118 楼

如果STORM必须拍很多照片，然后进行图像处理才能得到高分辨的图像，是不是意味着
STORM不能监测动态过程？它的时间分辨常数又是在什么量级上？
对于生物样品（如蛋白二维晶体或密集表达的膜蛋白），AFM能在XY平面做出分辨率达
到1nm的表面形貌图像(topography)，Z方向的分辨率理论上能达到0.1nm，但要在较硬
表面（如半体导样品）。AFM除能成像之外，还能做力谱，这是它独特的地方，很多实
验室用它来做蛋白的折叠与去折叠。
Optical tweezer是另一做力谱的方法。做线性分子较多，如DNA与蛋白相互作用，mRNA
转录等。

个是跟

【在 a*q 的大作中提到】

: STORM每一帧的采样是Stochastic的，但是最后很多帧的数据加起来得到的图像是完全
: Deterministic的，因为是由样品里面的所有荧光标记的位置决定的，所以没有什么问
: 题啊。
: Taekjip Ha做的AFM以及Optical Tweezer跟我们讨论的光学显微完全不是一回事。一个是跟
: SAXS一样做提纯分子的研究的，一个是做细胞成像的，而且Taekjip Ha现在也在做
: PALM/STORM。
:
: ways:
: emphasis
: on

z*g2012-03-17 07:03

119 楼

抛砖引玉先。
十年前听过Sunney Xie的报告，讲近场拉曼成像，就是CARS。不久前的年会上，他又讲
了最新的进展，已经能做到实时成像了，能看到血红细胞在血管里的流动，能区分皮肤
表面组织的大致成分，还能区分出动物脑中的癌变部位。主要是用拉曼谱的两个波长，
lipid 2845 cm-1, protein 2950 cm-1.
我的粗浅理解是，只要能得到可解析的信噪比，成像就是激光扫描和后续处理的事了，
至于精度可能不能要求太高，但贵在不用标记，完全Non-invasive。只是近场拉曼成像
，要求样品紧贴物镜，对于其应用稍有限制，或许将来可以用手持式光纤的方法直接用
到临床，这样手术中主刀医生就不用等病理切片的结果出来就可以判断哪些是病变组织
需要切除的。
听过钱永健的一次报告，他是做GFP起家的，所以他的方法是用免疫或转基因的方法将
癌变组织标记上荧光，这样医生直接切除有荧光的组织即可。
Sunney Xie是实验方法创新的大牛。对于研究工具与研究方法的改进和创新，是中国学
术界需要大力改进思维定势的地方，老是用已商业化的机器，只能跟在别人后面跑，做
不到最前沿。
其他同学再介绍下Xie的其它方面的工作吧。

techniques

【在 i****g 的大作中提到】

: 行家趁此机会再科普一下Sunney Xie的工作吧～～
:
: 不是生物领域，感觉Harvard 庄晓薇的这个方向作的好牛。她真的能够看见单分子的
: in vivo 的运动吗？还有， Nucleic Acid - Protein Interactions？
: Single-Molecule biology:
: Nucleic Acid - Protein Interactions
: We explore single-molecule fluorescence imaging and spectroscopy techniques
: to study complex biomolecular systems.

a*q2012-03-17 07:03

120 楼

动态过程还是可以的，时间分辨常数大概在几秒到几十秒量级，跟具体实验参数还有要
看什么东西有关，已经有好几篇文章讲这个的。这方面确实比不上SIM；如果要看的东
西小的话，也比不上STED，不过Commercial的STED太不争气了。
关于AFM，可以参考Toshio Ando的High-speed AFM：
http://www.s.kanazawa-u.ac.jp/phys/biophys/index.htm
很有意思的，蛋白质构象变化，马达蛋白的运动都可以直接录像了。

mRNA

【在 z********g 的大作中提到】

: 如果STORM必须拍很多照片，然后进行图像处理才能得到高分辨的图像，是不是意味着
: STORM不能监测动态过程？它的时间分辨常数又是在什么量级上？
: 对于生物样品（如蛋白二维晶体或密集表达的膜蛋白），AFM能在XY平面做出分辨率达
: 到1nm的表面形貌图像(topography)，Z方向的分辨率理论上能达到0.1nm，但要在较硬
: 表面（如半体导样品）。AFM除能成像之外，还能做力谱，这是它独特的地方，很多实
: 验室用它来做蛋白的折叠与去折叠。
: Optical tweezer是另一做力谱的方法。做线性分子较多，如DNA与蛋白相互作用，mRNA
: 转录等。
:
: 个是跟

a*q2012-03-17 07:03

121 楼

CARS的好处确实是不用标记，在临床上最大用处我想应该是做内窥镜和noninvasive的病理学分析；
缺点是灵敏度和特异性不如荧光，所以在细胞生物学上的应用有限，比如做脂肪代谢（谢晓亮发了这方
面的文章的）。

【在 z********g 的大作中提到】

: 抛砖引玉先。
: 十年前听过Sunney Xie的报告，讲近场拉曼成像，就是CARS。不久前的年会上，他又讲
: 了最新的进展，已经能做到实时成像了，能看到血红细胞在血管里的流动，能区分皮肤
: 表面组织的大致成分，还能区分出动物脑中的癌变部位。主要是用拉曼谱的两个波长，
: lipid 2845 cm-1, protein 2950 cm-1.
: 我的粗浅理解是，只要能得到可解析的信噪比，成像就是激光扫描和后续处理的事了，
: 至于精度可能不能要求太高，但贵在不用标记，完全Non-invasive。只是近场拉曼成像
: ，要求样品紧贴物镜，对于其应用稍有限制，或许将来可以用手持式光纤的方法直接用
: 到临床，这样手术中主刀医生就不用等病理切片的结果出来就可以判断哪些是病变组织
: 需要切除的。

t*n2012-03-17 07:03

122 楼

Thanks a lot for explaining...

照，成像的分辨率差没关系，只要信号足够亮，定位精确度可以比成像分辨率高很多。
打个比方，我和个朋友约个地方碰头，出门忘了带眼镜，看啥都不太清楚，不过运气好
，碰头的地方就只一个人站在那里，不是我那朋友会是谁。如果运气不好，碰头的地方
人山人海，就找不着人在哪了。
，但是如果事先知道这肯定是个单分子，那么这个模糊光团的中心肯定是这个分子的位
置。这个中心定位的准确性，决定于我拍到的光团的亮度，越亮的光团，中心定位越准
。但是，如果我事先不知道这个光团是从一个单分子来的，这个光团其实是有可能从两
个甚至更多的单分子来的，可能分子之间间距很小，在图像上糊成了一团。那么光团的
中心即使找到了，也没什么意义。也就是说，这种超分辨定位方法，只在每个单分子之
间的间距大于200nm的时候才有用。
位的方法很简单，可是没法直接用在生物成像上。PALM和STORM的创新在于，找到了方
法，能随机把荧光分子来来回回在不发光的状态和发光状态之间调制。每次曝光之前，
他们把大多数分子调到off state，只留下少数分子发光。这样处理之后，就能大体满
足图像内全是互相分得很开的单分子。拍成的图像可以用来精确定位每个分子。因为一
张图像，只是看见了很小一部分散立的分子，要看见样品的全貌，PALM 和STROM必须反
复对样品分子的调制操作，每次曝光只随机观测很少�: 徊糠址肿樱詈蟀鸭甘
踔辽习僬啪范ㄎ坏牡シ肿油嫉悠鹄矗铣勺詈蟮耐枷瘛�
off switching是个随机过程，也就是说即使能做到>99%的单分子都分得很开，也没人
能100％保证没有挤成一团发光的分子。疑似来自多分子的光团需要在图像处理中去掉
。我不是做这个的，具体方法我也不清楚，不过从“疑似”和“去掉”两词，大家可以
细心体会这里面水有多深。

【在 p*l 的大作中提到】

: 庄的STORM和Betzig的PALM，基本原理一样。一句话说，如果你是在独立的单分子拍照，成像的分辨率差没关系，只要信号足够亮，定位精确度可以比成像分辨率高很多。打个比方，我和个朋友约个地方碰头，出门忘了带眼镜，看啥都不太清楚，不过运气好，碰头的地方就只一个人站在那里，不是我那朋友会是谁。如果运气不好，碰头的地方人山人海，就找不着人在哪了。
: 显微镜的光学分辨极限是200nm,，一个单分子会成像成一个约200nm直径的模糊光团，但是如果事先知道这肯定是个单分子，那么这个模糊光团的中心肯定是这个分子的位置。这个中心定位的准确性，决定于我拍到的光团的亮度，越亮的光团，中心定位越准。但是，如果我事先不知道这个光团是从一个单分子来的，这个光团其实是有可能从两个甚至更多的单分子来的，可能分子之间间距很小，在图像上糊成了一团。那么光团的中心即使找到了，也没什么意义。也就是说，这种超分辨定位方法，只在每个单分子之间的间距大于200nm的时候才有用。
: 一个荧光的细胞，上帝都没法保证这里面每个荧光分子间距足够开，所以尽管这个定位的方法很简单，可是没法直接用在生物成像上。PALM和STORM的创新在于，找到了方法，能随机把荧光分子来来回回在不发光的状态和发光状态之间调制。每次曝光之前，他们把大多数分子调到off state，只留下少数分子发光。这样处理之后，就能大体满足图像内全是互相分得很开的单分子。拍成的图像可以用来精确定位每个分子。因为一张图像，只是看见了很小一部分散立的分子，要看见样品的全貌，PALM 和STROM必须反复对样品分子的调制操作，每次曝光只随机观测很少一部分分子，最后把几十甚至上百张精确定位的单分子图叠加起来，合成最后的图像。
: PALM和STORM比较关键的地方，在于怎么保证所有的信号都是从独立单分子来的。on-off switching是个随机过程，也就是说即使能做到>99%的单分子都分得很开，也没人能100％保证没有挤成一团发光的分子。疑似来自多分子的光团需要在图像处理中去掉。我不是做这个的，具体方法我也不清楚，不过从“疑似”和“去掉”两词，大家可以细心体会这里面水有多深。
:
: pioneered

p*l2012-03-17 07:03

123 楼

呵呵！我听说国内有地方也买了leica的STED。一般买这种第一代的大型仪器，都是当
冤大头的命。
STED需要接近完美的alignment。就算是做光学的，要搭个STED出来也不是容易的事，
基本所有想自己搭STED的人，如果不是Hell的嫡系，折腾来折腾去都得找Hell讨教秘方。

【在 a*q 的大作中提到】

: 动态过程还是可以的，时间分辨常数大概在几秒到几十秒量级，跟具体实验参数还有要
: 看什么东西有关，已经有好几篇文章讲这个的。这方面确实比不上SIM；如果要看的东
: 西小的话，也比不上STED，不过Commercial的STED太不争气了。
: 关于AFM，可以参考Toshio Ando的High-speed AFM：
: http://www.s.kanazawa-u.ac.jp/phys/biophys/index.htm
: 很有意思的，蛋白质构象变化，马达蛋白的运动都可以直接录像了。
:
: mRNA

a*q2012-03-17 07:03

124 楼

就我所知道的谢晓亮的工作，特别早期的时候（94、95年左右）是用近场光学显微镜做
单分子检测，算是单分子荧光检测这一行最早的一批人。当年他跟Eric Betzig是直接
竞争对手，不过两个人现在都不做这个了。其实他到Harvard之后还做过一阵近场显微
镜，想看光合作用那些蛋白质的空间分布，后来放弃了，然后STORM之类的方法就出来
了。
96、97年前后开始做单分子酶学，就是用跟踪分析单个酶分子的反应过程。一大发现是
同一个酶分子的活性随时间在不断变化。这个方向做了几乎有10年，文章无数。
差不多那个时候开始的还有CARS，一直到现在都在做，前面都讨论过了。最近一个大的
突破是SRS，08年发的。其实这已经不是CARS了，光谱有很大的不同。SRS看的是由于拉
曼散射造成一束激光的能量被转移到另一束激光，这需要检测到激光能量大概10^-7的
变化，但最终灵敏度比CARS高很多。用跟SRS同样的手段还可以对有吸收但是不发荧光
的东西成像（比方说血红素）。
在Harvard开始的方向是在单细胞+单分子水平上观察细菌基因的表达和调控，主要是分
析Transcription和Translation的随机性。有一个结果特别有意思，就是在大肠杆菌里
面，任何一个时刻mRNA的copy number和对应蛋白质的copy number完全没有任何相关性
。这个方向成就了好几个现在转做系统生物学的人。
以上描述不见得完全准确，而且其它还有一些小的方向或者不太成功的方向，就不一一
列出来了。现在还有一个新方向是DNA测序。至于他们组里面还有没有未公开的秘密新
方向，我当然无从得知。

【在 z********g 的大作中提到】

: 抛砖引玉先。
: 十年前听过Sunney Xie的报告，讲近场拉曼成像，就是CARS。不久前的年会上，他又讲
: 了最新的进展，已经能做到实时成像了，能看到血红细胞在血管里的流动，能区分皮肤
: 表面组织的大致成分，还能区分出动物脑中的癌变部位。主要是用拉曼谱的两个波长，
: lipid 2845 cm-1, protein 2950 cm-1.
: 我的粗浅理解是，只要能得到可解析的信噪比，成像就是激光扫描和后续处理的事了，
: 至于精度可能不能要求太高，但贵在不用标记，完全Non-invasive。只是近场拉曼成像
: ，要求样品紧贴物镜，对于其应用稍有限制，或许将来可以用手持式光纤的方法直接用
: 到临床，这样手术中主刀医生就不用等病理切片的结果出来就可以判断哪些是病变组织
: 需要切除的。

l*12012-03-17 07:03

125 楼

11th♂的细菌膜蛋白
>时间分辨常数大概在几秒到几十秒量级
那就是说细菌膜蛋白的铁离子通道如果变化短于几秒 STORM无用武之地了吧?
打个比方用照相机拍刘翔百米跨栏的细节想找到技术弱点如可能改进后伦敦奥运夺金牌
用傻瓜机的话是南柯一梦吧还得用D700 or MARKII 5D 吧
用电显的电子波长看不明白膜蛋白分子上的亚原子级别的实时动态变化的话
夸克微显系统就有考虑的必要了吧
2014-15
人造太阳可能达到临界点的话
//www.iter.org/fr/accueil
2055 夸克微显系统？
[回复]
[ 117 ]
发信人: abq (NM), 信区: Biology
标题: Re: 哪位能科普一下ZHUANG的单分子荧光
发信站: BBS 未名空间站 (Thu Mar 22 00:16:11 2012, 美东)
动态过程还是可以的，时间分辨常数大概在几秒到几十秒量级，跟具体实验参数还有要
看什么东西有关，已经有好几篇文章讲这个的。这方面确实比不上SIM；如果要看的东
西小的话，也比不上STED，不过Commercial的STED太不争气了。

【在 s******y 的大作中提到】

: 我倒。。。我还是没有理解你的问题。
: 你是试图在说STORM microscopy的逻辑思路不对么？
: 还是说super resolution microscopy不能用于某些科研场合？
: 如果是前者，其实那个仪器的逻辑是没有问题的。因为需要成像的对象
: 要么就是用抗体特异的标记了(STORM)，要么就是用荧光蛋白融合表达了(PALM)。
: 所以仅仅是瞬时成像的时候被激发的荧光点有随机性而已，但是总体对象是
: 不随机的，所以叠加起来之后应该就是一个总体的图了。
: 如果你是说后者，那么谁也没有指望光学显微镜能够什么问题都能回答呀，
: 仅仅对于某些特定样品特定用途有用而已。
:

i*g2012-03-17 07:03

126 楼

介绍的很全面，谢涵盖的方向还真广。他最突出的贡献还是发明CARS和SRS吧？

就我所知道的谢晓亮的工作，特别早期的时候（94、95年左右）是用近场光学显微镜做
单分子检测，算是单分子荧光检测这一行最早的一批人。当年他跟Eric Betzig是直接
竞争对手，不过两个人现在都不做这个了。其实他到Harvard之后还做过一阵近场显微
镜，想看光合作用那些蛋白质的空间分布，后来放弃了，然后STORM之类的方法就出来
了。
96、97年前后开始做单分子酶学，就是用跟踪分析单个酶分子的反应过程。一大发现是
同一个酶分子的活性随时间在不断变化。这个方向做了几乎有10年，文章无数。
差不多那个时候开始的还有CARS，一直到现在都在做，前面都讨论过了。最近一个大的
突破是SRS，08年发的。其实这已经不是CARS了，光谱有很大的不同。SRS看的是由于拉
曼散射造成一束激光的能量被转移到另一束激光，这需要检测到激光能量大概10^-7的
变化，但最终灵敏度比CARS高很多。用跟SRS同样的手段还可以对有吸收但是不发荧光
的东西成像（比方说血红素）。
在Harvard开始的方向是在单细胞+单分子水平上观察细菌基因的表达和调控，主要是分
析Transcription和Translation的随机性。有一个结果特别有意思，就是在大肠杆菌里
面，任何一个时刻mRNA的copy number和对应蛋白质的copy number完全没有任何相关性
。这个方向成就了好几个现在转做系统生物学的人。
以上描述不见得完全准确，而且其它还有一些小的方向或者不太成功的方向，就不一一
列出来了。现在还有一个新方向是DNA测序。至于他们组里面还有没有未公开的秘密新
方向，我当然无从得知。

【在 a*q 的大作中提到】

: 就我所知道的谢晓亮的工作，特别早期的时候（94、95年左右）是用近场光学显微镜做
: 单分子检测，算是单分子荧光检测这一行最早的一批人。当年他跟Eric Betzig是直接
: 竞争对手，不过两个人现在都不做这个了。其实他到Harvard之后还做过一阵近场显微
: 镜，想看光合作用那些蛋白质的空间分布，后来放弃了，然后STORM之类的方法就出来
: 了。
: 96、97年前后开始做单分子酶学，就是用跟踪分析单个酶分子的反应过程。一大发现是
: 同一个酶分子的活性随时间在不断变化。这个方向做了几乎有10年，文章无数。
: 差不多那个时候开始的还有CARS，一直到现在都在做，前面都讨论过了。最近一个大的
: 突破是SRS，08年发的。其实这已经不是CARS了，光谱有很大的不同。SRS看的是由于拉
: 曼散射造成一束激光的能量被转移到另一束激光，这需要检测到激光能量大概10^-7的

z*g2012-03-17 07:03

127 楼

有做激光的牛人能解释一下如何做到高质量的Donut激光吗？
非常想知道技术细节。That's the juicy meal.

【在 v*****s 的大作中提到】

: STED的分辨率直接取决于doughnut中间那个空心的大小，这个对一个超分辨技术来说当
: 然是最重要的因素。他要多强功率的激光，我倒没印象了。我个人觉得一般强功率激光
: 都是军事用途的，硬烧伤或者模拟核试验的，米帝境内功率最强的激光应该是波音搞得
: 那个反导弹系统，单位面积强度最大的应该是那个XX实验室里面用32束激光聚焦到同一
: 点搞核聚变的。科研上很少用到太强功率的激光，生物的更不可能了，直接把细胞气化
: 了。
: 其实只要有那个doughnut的激光，有很多手段可以达到超分辨的，stimulated
: emission只是其中一种，还未必是最好的一种。这个里面最重要的idea是用激光
: deplete你的on state。sunney xie好像就用类似的办法实现了raman的单分子探测。

i*g2012-03-17 07:03

128 楼

觉得这种非标记的检测方法虽然有一定应用价值，但是对追求精度的实验检测而言还是
有点太粗糙了，如果能发现新的可标记但对蛋白结构功能影响很小的的荧光或其他小分
子，不仅分辨率可以提高几个级别，还能实时观测细胞内动态，那就很牛逼了。

抛砖引玉先。
十年前听过Sunney Xie的报告，讲近场拉曼成像，就是CARS。不久前的年会上，他又讲
了最新的进展，已经能做到实时成像了，能看到血红细胞在血管里的流动，能区分皮肤
表面组织的大致成分，还能区分出动物脑中的癌变部位。主要是用拉曼谱的两个波长，
lipid 2845 cm-1, protein 2950 cm-1.
我的粗浅理解是，只要能得到可解析的信噪比，成像就是激光扫描和后续处理的事了，
至于精度可能不能要求太高，但贵在不用标记，完全Non-invasive。只是近场拉曼成像
，要求样品紧贴物镜，对于其应用稍有限制，或许将来可以用手持式光纤的方法直接用
到临床，这样手术中主刀医生就不用等病理切片的结果出来就可以判断哪些是病变组织
需要切除的。
听过钱永健的一次报告，他是做GFP起家的，所以他的方法是用免疫或转基因的方法将
癌变组织标记上荧光，这样医生直接切除有荧光的组织即可。
Sunney Xie是实验方法创新的大牛。对于研究工具与研究方法的改进和创新，是中国学
术界需要大力改进思维定势的地方，老是用已商业化的机器，只能跟在别人后面跑，做
不到最前沿。
其他同学再介绍下Xie的其它方面的工作吧。
techniques

【在 z********g 的大作中提到】

: 抛砖引玉先。
: 十年前听过Sunney Xie的报告，讲近场拉曼成像，就是CARS。不久前的年会上，他又讲
: 了最新的进展，已经能做到实时成像了，能看到血红细胞在血管里的流动，能区分皮肤
: 表面组织的大致成分，还能区分出动物脑中的癌变部位。主要是用拉曼谱的两个波长，
: lipid 2845 cm-1, protein 2950 cm-1.
: 我的粗浅理解是，只要能得到可解析的信噪比，成像就是激光扫描和后续处理的事了，
: 至于精度可能不能要求太高，但贵在不用标记，完全Non-invasive。只是近场拉曼成像
: ，要求样品紧贴物镜，对于其应用稍有限制，或许将来可以用手持式光纤的方法直接用
: 到临床，这样手术中主刀医生就不用等病理切片的结果出来就可以判断哪些是病变组织
: 需要切除的。

v*s2012-03-17 07:03

129 楼

我只知道一般性的思路就是把激光聚焦以后，它在焦平面上的像实际等效于对激光的
profile作了傅立叶变换，那么在那个平面上进行beam shaping就可以做到精确的phase
control。这个现在应该算成熟技术了，物理化学里面的quantum control实验都是这
么做的，通过精确控制激光能量和形状，可以把分子激发到任意高能态。
具体说donut的话，我去看了一下paper，用的是spiral phase plate，比较精巧和特殊的一个方法。底下第一个链接上有一个比较好看的图，第二个链接讲清楚了为什么spiral phase plate可以形成donut。
http://en.wikipedia.org/wiki/Angular_momentum_of_light
http://www.st-andrews.ac.uk/~jcgl/Scots_Guide/MMWave/QO/compone

【在 z********g 的大作中提到】

: 有做激光的牛人能解释一下如何做到高质量的Donut激光吗？
: 非常想知道技术细节。That's the juicy meal.

v*s2012-03-17 07:03

130 楼

哈哈，我碰巧就认识一个不是hell的嫡系，自己搭了STED出来，用的还是2photon。可
惜没拼过hell，最后还是hell先搭出来的。

方。

【在 p*l 的大作中提到】

: 呵呵！我听说国内有地方也买了leica的STED。一般买这种第一代的大型仪器，都是当
: 冤大头的命。
: STED需要接近完美的alignment。就算是做光学的，要搭个STED出来也不是容易的事，
: 基本所有想自己搭STED的人，如果不是Hell的嫡系，折腾来折腾去都得找Hell讨教秘方。

z*g2012-03-17 07:03

131 楼

关于 High-speed AFM imaging, 还有个法国人叫Simon Scheuring. 有兴趣的同学可以
搜搜他的文章。
但AFM成像是触觉式的，只能看到表面形貌，而且加在针尖上的力、针尖与样品相互作
用力都会直接影响成像质量，所以我觉得观察一些很明显的构象变化，如myosin 走动
等是可以的，但对于蛋白内部或Helix倾斜角度变化等较小构象变化，这种方法可能还
需要进一步改进才行。

【在 a*q 的大作中提到】

: 动态过程还是可以的，时间分辨常数大概在几秒到几十秒量级，跟具体实验参数还有要
: 看什么东西有关，已经有好几篇文章讲这个的。这方面确实比不上SIM；如果要看的东
: 西小的话，也比不上STED，不过Commercial的STED太不争气了。
: 关于AFM，可以参考Toshio Ando的High-speed AFM：
: http://www.s.kanazawa-u.ac.jp/phys/biophys/index.htm
: 很有意思的，蛋白质构象变化，马达蛋白的运动都可以直接录像了。
:
: mRNA

v*s2012-03-17 07:03

132 楼

他最近还有一个比较成功的方向，是利用SRS和STED类似的思路看单分子的absorption。
他的网页上说SRS变化是10^-4的量级，10^-7太小了，激光本身都很难做到那么稳。
SRS最大的问题是分子Raman峰的特异性。因为毕竟生物体内的分子就是C，H，O，N这些
东西拼积木拼起来的，不同分子之间的Raman峰有多大区别，能不能找到癌变分子的特
异峰（fingerprint），这个很难说。Van Duyne这批打算把SERS用到生物体的人，可以
观测整个频谱，然后通过不同峰之间的相对比例来区别分子，SRS做不到这一点，它必
须针对事先某已知频率的振动能级来调谐激光波长。如果再考虑到激光波长的限制，它
能观测的特定的峰就更少了。

【在 a*q 的大作中提到】

: 就我所知道的谢晓亮的工作，特别早期的时候（94、95年左右）是用近场光学显微镜做
: 单分子检测，算是单分子荧光检测这一行最早的一批人。当年他跟Eric Betzig是直接
: 竞争对手，不过两个人现在都不做这个了。其实他到Harvard之后还做过一阵近场显微
: 镜，想看光合作用那些蛋白质的空间分布，后来放弃了，然后STORM之类的方法就出来
: 了。
: 96、97年前后开始做单分子酶学，就是用跟踪分析单个酶分子的反应过程。一大发现是
: 同一个酶分子的活性随时间在不断变化。这个方向做了几乎有10年，文章无数。
: 差不多那个时候开始的还有CARS，一直到现在都在做，前面都讨论过了。最近一个大的
: 突破是SRS，08年发的。其实这已经不是CARS了，光谱有很大的不同。SRS看的是由于拉
: 曼散射造成一束激光的能量被转移到另一束激光，这需要检测到激光能量大概10^-7的

p*l2012-03-17 07:03

133 楼

Donut是通过在STED光束中加一个votex phase plate形成的。这样处理后的光，聚焦是
就形成了个donut，学名叫optical votex。votex phase plate不是one size fit all
的，得根据STED光的波长订做。你也可以买到一大块plate，上面不同的区域适用于不
同波长。好的donut需要完美圆对称的STED光束，和精确对心的phase plate。道理很简
单的，但是要调好，很需要手巧心细，要很动脑子想怎么根据现象去判断光路往哪边偏
了，无的放矢的调是一辈子都调不出来的。其实生物里也有很多这样的实验艺术，如果
没人带着教，自己摸索方法会很痛苦。所以想复制Hell的STED，实验基本功差的组，得
好好掂量掂量。

【在 z********g 的大作中提到】

: 有做激光的牛人能解释一下如何做到高质量的Donut激光吗？
: 非常想知道技术细节。That's the juicy meal.

p*l2012-03-17 07:03

134 楼

我还听过一个灰头土脸的报告，台湾来的，说我们的STED depletion到不了底,
donut中间太亮，号称是激光不好。我私下里觉得他们是点子低，那个激光Hell
用的挺欢的。
Hell在STED这上面优势太明显了，非嫡系的跟着他的思路混，肯定拼不过的。

【在 v*****s 的大作中提到】

: 哈哈，我碰巧就认识一个不是hell的嫡系，自己搭了STED出来，用的还是2photon。可
: 惜没拼过hell，最后还是hell先搭出来的。
:
: 方。

v*s2012-03-17 07:03

135 楼

不知道我们俩说的是不是同一个人，我说的也是个台湾人，现在在加拿大。他的仪器主
要是他自己和一个大陆千老一起搭的，千老现在回国了，我估计他自己有点抓瞎。

【在 p*l 的大作中提到】

: 我还听过一个灰头土脸的报告，台湾来的，说我们的STED depletion到不了底,
: donut中间太亮，号称是激光不好。我私下里觉得他们是点子低，那个激光Hell
: 用的挺欢的。
: Hell在STED这上面优势太明显了，非嫡系的跟着他的思路混，肯定拼不过的。

p*l2012-03-17 07:03

136 楼

我说的是个在台湾的组，号称想用STED做极小体积上的FCS。这个Hell也在做，不
过Hell对这方面兴趣好像不是那么大。

【在 v*****s 的大作中提到】

: 不知道我们俩说的是不是同一个人，我说的也是个台湾人，现在在加拿大。他的仪器主
: 要是他自己和一个大陆千老一起搭的，千老现在回国了，我估计他自己有点抓瞎。

l*12012-03-17 07:03

137 楼

you mean if do that STED at the edge of Black Hole, i mean by light speed
Spaceship to there
from AC 3000 or similar.
there it should work best compare to do it on the Earth.
Sorry just watched National Geography Channel “Einstein and his Time and
Space Theories” documentary movie recently.

【在 p*l 的大作中提到】

: STED的原理，在物理版讲可以只说一句，共振荧光抑制自发荧光，在生
: 物版讲，就得比较科普了。
: Stimulated emission现象是爱因斯坦预言的。一个荧光分子，在被激发
: 后，会把能量辐射发出去。发出去的这个emission的波长一定是比激发光
: 长的。这个是能量守恒决定的。但是具体emission的波长，是有个几率分
: 布的。这个分布，就是荧光分子的emission spectrum，或者，准确的说，
: 是荧光分子的spontanouse emission spectrum。这里的spontanouse是
: 指，荧光分子的emission过程是自发的，没有任何外界调控。把荧光样
: 品在显微镜下照照片子，看到的都是spontanouse emission。
: 爱因斯坦预言，如果在激发一个荧光分子的同时，还加上一个很强的光场，

l*12012-03-17 07:03

138 楼

Cryo-Electron Tomography
Cryo-ET is a very accurate way to determine the three-dimensional structure
of a specimen because the rapid freezing of the object and cryogenic
temperatures gives a good preservation of the structure and good time
resolution of certain processes. For example, the rapid freezing of cells
and tissues at a certain point in cellular processes can give a good
understanding of the structure and activity of those cells and tissues at a
certain point in time during that particular cellular process. This type of
tomography aids in the learning of cells and their organelles at a more
dynamic level. Each organelle of a cell is produced in a different color, in
order to facilitate the viewing process.
//en.wikibooks.org/wiki/Structural_Biochemistry/Proteins/Cryo-Electron_
Microscopy

【在 i****g 的大作中提到】

: 觉得这种非标记的检测方法虽然有一定应用价值，但是对追求精度的实验检测而言还是
: 有点太粗糙了，如果能发现新的可标记但对蛋白结构功能影响很小的的荧光或其他小分
: 子，不仅分辨率可以提高几个级别，还能实时观测细胞内动态，那就很牛逼了。
:
: 抛砖引玉先。
: 十年前听过Sunney Xie的报告，讲近场拉曼成像，就是CARS。不久前的年会上，他又讲
: 了最新的进展，已经能做到实时成像了，能看到血红细胞在血管里的流动，能区分皮肤
: 表面组织的大致成分，还能区分出动物脑中的癌变部位。主要是用拉曼谱的两个波长，
: lipid 2845 cm-1, protein 2950 cm-1.
: 我的粗浅理解是，只要能得到可解析的信噪比，成像就是激光扫描和后续处理的事了，

h*w2012-03-17 07:03

139 楼

这个很难吗，可以买到商业的spiral phase plate

【在 z********g 的大作中提到】

: 有做激光的牛人能解释一下如何做到高质量的Donut激光吗？
: 非常想知道技术细节。That's the juicy meal.

h*w2012-03-17 07:03

140 楼

其实SRS不是xie组第一个做出来的。 SRS spectrometer 在物理上已经用了很久。几
乎同一年可能是2009，欧洲的一个group就用fs激光器实现了SRSimaging，但是慢。
你仔细的看那片science文章，Sunny 只是用ps替代了fs，然后加了个phase lock。他
们也应用那片文章。
欧洲那帮真憋屈啊，因为他们没有两个locked ps lasers. 当然即使有，人也不一定让
发science。谁都自导用ps啊， cars那么久了

absorption。

【在 v*****s 的大作中提到】

: 他最近还有一个比较成功的方向，是利用SRS和STED类似的思路看单分子的absorption。
: 他的网页上说SRS变化是10^-4的量级，10^-7太小了，激光本身都很难做到那么稳。
: SRS最大的问题是分子Raman峰的特异性。因为毕竟生物体内的分子就是C，H，O，N这些
: 东西拼积木拼起来的，不同分子之间的Raman峰有多大区别，能不能找到癌变分子的特
: 异峰（fingerprint），这个很难说。Van Duyne这批打算把SERS用到生物体的人，可以
: 观测整个频谱，然后通过不同峰之间的相对比例来区别分子，SRS做不到这一点，它必
: 须针对事先某已知频率的振动能级来调谐激光波长。如果再考虑到激光波长的限制，它
: 能观测的特定的峰就更少了。

p*l2012-03-17 07:03

141 楼

第一次读SRS的文章的时候，感觉真是银子堆出来的文章。没银子的组，只能望洋兴叹
。不过如果不是水平高有实力，也弄不到那么多钱。

【在 h*w 的大作中提到】

: 其实SRS不是xie组第一个做出来的。 SRS spectrometer 在物理上已经用了很久。几
: 乎同一年可能是2009，欧洲的一个group就用fs激光器实现了SRSimaging，但是慢。
: 你仔细的看那片science文章，Sunny 只是用ps替代了fs，然后加了个phase lock。他
: 们也应用那片文章。
: 欧洲那帮真憋屈啊，因为他们没有两个locked ps lasers. 当然即使有，人也不一定让
: 发science。谁都自导用ps啊， cars那么久了
:
: absorption。

a*q2012-03-17 07:03

142 楼

他成名的应该是单分子酶学，CARS在华人圈里面比较有名，不过我个人最喜欢的还是单
分子基因表达的那些东西。

【在 i****g 的大作中提到】

: 介绍的很全面，谢涵盖的方向还真广。他最突出的贡献还是发明CARS和SRS吧？
:
: 就我所知道的谢晓亮的工作，特别早期的时候（94、95年左右）是用近场光学显微镜做
: 单分子检测，算是单分子荧光检测这一行最早的一批人。当年他跟Eric Betzig是直接
: 竞争对手，不过两个人现在都不做这个了。其实他到Harvard之后还做过一阵近场显微
: 镜，想看光合作用那些蛋白质的空间分布，后来放弃了，然后STORM之类的方法就出来
: 了。
: 96、97年前后开始做单分子酶学，就是用跟踪分析单个酶分子的反应过程。一大发现是
: 同一个酶分子的活性随时间在不断变化。这个方向做了几乎有10年，文章无数。
: 差不多那个时候开始的还有CARS，一直到现在都在做，前面都讨论过了。最近一个大的

h*w2012-03-17 07:03

143 楼

其实optics alignment 不太难，只要你找到calibration的方法。我最讨厌那个脉冲延
时，每次要重合他们，我都要上low coherence spectrometer 去验证。
哪位有简单的办法？

【在 a*q 的大作中提到】

: 他成名的应该是单分子酶学，CARS在华人圈里面比较有名，不过我个人最喜欢的还是单
: 分子基因表达的那些东西。

p*l2012-03-17 07:03

144 楼

做个一般质量的donut不难，但是STED的donut要中心完全黑，否则的话
加大STED力度的时候，会把中间的信号也给deplete了。据Hell手下的人
说，donut的中心和环，对比度要好过95%才可以去成像，如果想做顶级
分辨率，对比度要更高。

【在 h*w 的大作中提到】

: 这个很难吗，可以买到商业的spiral phase plate

h*w2012-03-17 07:03

145 楼

其实这个就是一个wavefront change。几种方法：
比如有多模光纤的高模
液晶或deformable mirror 做客调的

【在 p*l 的大作中提到】

: 做个一般质量的donut不难，但是STED的donut要中心完全黑，否则的话
: 加大STED力度的时候，会把中间的信号也给deplete了。据Hell手下的人
: 说，donut的中心和环，对比度要好过95%才可以去成像，如果想做顶级
: 分辨率，对比度要更高。

a*q2012-03-17 07:03

146 楼

原理并不复杂，只是实际要实现如此高的对比度，不是随便什么方法都能做得出来的。

【在 h*w 的大作中提到】

: 其实这个就是一个wavefront change。几种方法：
: 比如有多模光纤的高模
: 液晶或deformable mirror 做客调的

p*l2012-03-17 07:03

147 楼

实现时还需要考虑能量损失，做出个完美但是不亮的donut也没什么用。

【在 a*q 的大作中提到】

: 原理并不复杂，只是实际要实现如此高的对比度，不是随便什么方法都能做得出来的。

v*s2012-03-17 07:03

148 楼

time domain的overlap一般是用非线性的方法去找的。根据光的波长不同，可以使用不
同的Nonlinear powder或者crystal，然后找合频信号。
low coherence spectrometer是什么东西？没听说过啊。

【在 h*w 的大作中提到】

: 其实optics alignment 不太难，只要你找到calibration的方法。我最讨厌那个脉冲延
: 时，每次要重合他们，我都要上low coherence spectrometer 去验证。
: 哪位有简单的办法？

v*s2012-03-17 07:03

149 楼

SRS还好吧，两台超快激光器对物化lab来说，不算什么大事。振荡器加CPA，最多也就
三四十万，不算什么大钱。几乎独立PI起手都要至少一台，不然怎么做实验啊。

【在 p*l 的大作中提到】

: 第一次读SRS的文章的时候，感觉真是银子堆出来的文章。没银子的组，只能望洋兴叹
: 。不过如果不是水平高有实力，也弄不到那么多钱。

z*g2012-03-17 07:03

150 楼

能不能解释一下Votex phase plate?
是不是在原有激光上叠加一下相位变化？
谢谢！

all

【在 p*l 的大作中提到】

: Donut是通过在STED光束中加一个votex phase plate形成的。这样处理后的光，聚焦是
: 就形成了个donut，学名叫optical votex。votex phase plate不是one size fit all
: 的，得根据STED光的波长订做。你也可以买到一大块plate，上面不同的区域适用于不
: 同波长。好的donut需要完美圆对称的STED光束，和精确对心的phase plate。道理很简
: 单的，但是要调好，很需要手巧心细，要很动脑子想怎么根据现象去判断光路往哪边偏
: 了，无的放矢的调是一辈子都调不出来的。其实生物里也有很多这样的实验艺术，如果
: 没人带着教，自己摸索方法会很痛苦。所以想复制Hell的STED，实验基本功差的组，得
: 好好掂量掂量。

z*g2012-03-17 07:03

151 楼

有个想法，能不能用two-photon做蛋白自带的PHE/TRP/TYR的荧光？这样不是省了标记
分子的尾大不掉的干扰作用吗？
280nm的吸收，two-photon波长加倍，560nm应该不难做到。而且氨基酸处于不同的化学
环境，其中的吸收发射谱可能会有细微差别，如果能把这些差别定性定量化，就可成为
一种新的方法。
当然，带的芳香族残基比较多的话，解谱是个麻烦事。

l*12012-03-17 07:03

152 楼

Sure!
alternatively
News From the Field
A New Tool to Reveal Structure of Proteins
March 19, 2012
//www.nsf.gov/news/news_summ.jsp?cntn_id=123593&org=MCB&from=news
Solid state nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy+ X-ray
crystallography
//researchnews.osu.edu/archive/paramagtag.htm

【在 a*q 的大作中提到】

: 他成名的应该是单分子酶学，CARS在华人圈里面比较有名，不过我个人最喜欢的还是单
: 分子基因表达的那些东西。

l*12012-03-17 07:03

153 楼

STORM living cell video recording barrier might be fixed by nonlinear
quantum
spectroscopy after 2017 AC (possible)
Alán Aspuru-Guzik Harvard Univ
his team one PNAS paper:
Quantum state and process tomography of energy transfer systems via
ultrafast spectroscopy.
Yuen-Zhou J et al. (2011)
PNAS 108:17615-17620.
key words:
processing ∣ open quantum systems ∣ quantum biology>
link:
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21997214
more pls go to
links:
//aspuru.chem.harvard.edu/about-alan/
//aspuru.chem.harvard.edu/research/
//aspuru.chem.harvard.edu/quantum-simulation/
Ps: ZXW 一个实验物理的PhD from Cal 在理论量子生物物理光学上和Cal物理系本
科毕业的红脖子在同一水平吧 Lol
那个STORM original thought was from Steven Chu
//www.popsci.com/science/article/2010-07/research-team-including-energy-sec-
steven-chu-breaks-record-highest-resolution-optical-imaging
>
07/15/10 at 12:50 pm
The FPALM system of microscopy developed by Sam Hess at the University of
Maine can image single molecules, and has been around for years. This isn't
new technology, and therefore really isn't a breakthrough. Chu isn't the
first one to come up with this, as Hess and a few other independent
researchers developed their own systems. Another system very similar to
FPALM (Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy) is STORM (
Stochastic Optical Reconstruction Microscopy), which uses the same ideas.
From a paper I've written:
Hess, Girirajan, and Mason demonstrated excitation using photoactivatable
green fluoroescent protein (PA-GFP) molecules which are initially “dark,”
meaning they are weakly fluoresced. It is at this point that fluorescence
and visualization take place at first one, then another excitation
wavelength. Once this is done, a small number of randomly photoactivated
molecules are localized using methods for single-molecule detection. To
improve the result, the randomly photoactivated molecules are separated from
each other by several times the resolution, as determined by the Rayleigh
criterion (Hess et al.4259).
Once a randomly-determined number of photons are retrieved from the
molecules, each of the molecules used is then photobleached. This process of
photobleaching causes the individual molecules to proceed to a state of non
-fluorescence, at which point they are “dark” and will no longer fluoresce
. Because the molecules that have been photobleached can no longer be
excited to fluoresce, a very accurate image can be assembled without fear of
overlapping molecules. Photoactivation times for the fluorophores used by
Hess et al. with FPALM were not significant due to the fact that the entire
field was being imaged at once. However, this photoactivation time is
significant in other methods, as it becomes more difficult to increase the
activation rate (Hess et al.4269).
Source: Hess, Samuel T., Thanu P K Girirajan, and Michael D. Mason. "Ultra-
High Resolution Imaging by Fluorescence Photoactivation Localization
Microscopy." Biophysical Journal 91.11 (2006): 4258-272.
---
07/15/10 at 4:03 pm
@chaseea0
What Dr Chu is stating that they have done is quite a bit higher resolution
than the 20 nM that the method you are describing can do.
----
发信人: abq (NM), 信区: Biology
标题: Re: 哪位能科普一下ZHUANG的单分子荧光
发信站: BBS 未名空间站 (Thu Mar 22 00:16:11 2012, 美东)
动态过程还是可以的，时间分辨常数大概在几秒到几十秒量级，跟具体实验参数还有要
看什么东西有关，已经有好几篇文章讲这个的。这方面确实比不上SIM；如果要看的东
西小的话，也比不上STED，不过Commercial的STED太不争气了。
关于AFM，可以参考Toshio Ando的High-speed AFM：
http://www.s.kanazawa-u.ac.jp/phys/biophys/index.htm
很有意思的，蛋白质构象变化，马达蛋白的运动都可以直接录像了。

mRNA

【在 z********g 的大作中提到】

: 如果STORM必须拍很多照片，然后进行图像处理才能得到高分辨的图像，是不是意味着
: STORM不能监测动态过程？它的时间分辨常数又是在什么量级上？
: 对于生物样品（如蛋白二维晶体或密集表达的膜蛋白），AFM能在XY平面做出分辨率达
: 到1nm的表面形貌图像(topography)，Z方向的分辨率理论上能达到0.1nm，但要在较硬
: 表面（如半体导样品）。AFM除能成像之外，还能做力谱，这是它独特的地方，很多实
: 验室用它来做蛋白的折叠与去折叠。
: Optical tweezer是另一做力谱的方法。做线性分子较多，如DNA与蛋白相互作用，mRNA
: 转录等。
:
: 个是跟

l*12012-03-17 07:03

154 楼

Sure
plus one review:
Campos LA et al (2009)
The importance of being quantitative.
PNAS 106:E139; author reply E140. Epub Dec 15.
Direct observation of barrier-limited folding of BBL by single-molecule
fluorescence resonance energy transfer.
link:
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20018769

舒服。。。

【在 w***x 的大作中提到】

: 庄的病毒-蛋白互作很多就是用smFRET的啊。。。和STORM好像关系不大
: 至少我去年JC看了几篇她的HIV逆转录起始方面的文章，都是FRET。。。
: 顺便，觉得庄姐姐的paper写作很不错，至少我看得那几篇逻辑非常清楚，读起来很舒服。。。

r*r2012-03-17 07:03

155 楼

昨天也刚好在看类似的paper 说说我的感觉
单分子成像技术是很不错但是受限于dye的种类能看的分子也受到很大的限制
不能像是抗体一样想看什么就看什么想看一的分子还得先找到可以用的dye才行
这在成像技术上或许是突破但是要说应用..我想还差得很远
在有兴趣的protein上面接GFP 或许是一个方法但不是每个蛋白质都可以随意的接GFP
比如某些膜蛋白你插一个GFP行为就天差地远了

l*12012-03-17 07:03

156 楼

学习了
BTW
无论哪一个 Raman scatter or Stimulated emission
德国哥廷根大斯图加特大都有牛人啊除了法兰克福的Hell 以外
links:
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15884061
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?db=pubmed&cmd=link&linkname=pubmed_pubmed_
citedin&uid=15884061
//www.pi3.uni-stuttgart.de/ags/volkmer/andreas.html

【在 p*l 的大作中提到】

: Raman scatter和Stimulated emission是两码事。

l*12012-03-17 07:03

157 楼

so 庄院士只靠STORM 是拿不上炸药奖哪怕是提名的
而同一化学系的老墨
Alán Aspuru-Guzik
//aspuru.chem.harvard.edu/research/
他的非线性量子光学显微镜能量分析系统实用10年后就可能是炸药奖喽
Assistant Professor, Harvard University (2006-2010)
Postdoctoral Researcher, UC Berkeley (2005-2006)
Ph.D., UC Berkeley (2004)
B.Sc., Universidad Nacional Autónoma de México (1999)
Major Honors and Awards
2012 Ulam Fellow, Los Alamos National Laboratories
2011 Big Think Delphi Fellow
2010 MIT Technology Review Young Innovator Under 35 (TR35)
cited from link:
//aspuru.chem.harvard.edu/about-alan/

GFP

【在 r****r 的大作中提到】

: 昨天也刚好在看类似的paper 说说我的感觉
: 单分子成像技术是很不错但是受限于dye的种类能看的分子也受到很大的限制
: 不能像是抗体一样想看什么就看什么想看一的分子还得先找到可以用的dye才行
: 这在成像技术上或许是突破但是要说应用..我想还差得很远
: 在有兴趣的protein上面接GFP 或许是一个方法但不是每个蛋白质都可以随意的接GFP
: 比如某些膜蛋白你插一个GFP行为就天差地远了

Y*62012-03-17 07:03

158 楼

Anyone who works in field want to have a part time or full time jobs. Please
let me know. We just started a new company in Suzhou and would like to
invite people in this field to give lecture, write books, or build
instrument for us.

techniques

【在 m***o 的大作中提到】

: 不是生物领域，感觉Harvard 庄晓薇的这个方向作的好牛。她真的能够看见单分子的
: in vivo 的运动吗？还有， Nucleic Acid - Protein Interactions？
: Single-Molecule biology:
: Nucleic Acid - Protein Interactions
: We explore single-molecule fluorescence imaging and spectroscopy techniques
: to study complex biomolecular systems.

w*s2012-03-17 07:03

159 楼

看得我惊心动魄。

b*r2012-03-17 07:03

160 楼

有个比较弱的问题
这些激光会不会导致局部温度过高，影响细胞活性？

【在 a*q 的大作中提到】

: 实际的instrument response应该是pixel和gaussian function的convolution。稍微算
: 一下就可以发现，只要pixel的大小小于gaussian的standard deviation，pixel对定位
: 精度的影响是很小的。影响定位精度最大的因素是噪音，跟检测到的光子个数和背景强
: 度直接相关。所以信号无限的情况下，时空精度真的是可以无限的，只是实际实验中单
: 分子的信号当然不可能是无限的。
:
: 。

m*o2012-03-17 07:03

161 楼

不是生物领域，感觉Harvard 庄晓薇的这个方向作的好牛。她真的能够看见单分子的
in vivo 的运动吗？还有， Nucleic Acid - Protein Interactions？
Single-Molecule biology:
Nucleic Acid - Protein Interactions
We explore single-molecule fluorescence imaging and spectroscopy techniques
to study complex biomolecular systems.

g*02012-03-17 07:03

162 楼

这个帖子没人回答表明很多庄粉其实是叶公好龙。

s*y2012-03-17 07:03

163 楼

首先，庄看的是生物大分子，所以不像你想象中的那么小。
第二，看见的其实是分子上标记的荧光基团的信号，只要背景足够低，感光元件
足够敏感，荧光基团足够强，就能看见单个分子的荧光基团的信号。
但是如果直接用光学成像作定位的话会出问题，因为普通光学显微镜的
分辨率在0.2微米，这个大于大部分生物分子的尺寸，所以会无法准确定位。
庄的方法是倒过来推算，就是用定位激发的方式来确定该荧光分子的位置，
因为现代的物理机械定位的精度已经达到了纳米级别，所以可以比光学成像
的精度高。
至于说看蛋白和核酸的作用，其实就是在蛋白和核酸上放上不同的荧光集团，
然后看两者的作用。或者是看其中一个的结合和另外一个分子上标记的荧光
信号的影响，来倒过来推测他们的作用。
所以，看到的，都是信号的变化，并不是你想象的那么真的看到了一个DNA
链条扭来扭去的然后结合到了一个圆鼓鼓的蛋白上去那么的写实。

techniques

【在 m***o 的大作中提到】

: 不是生物领域，感觉Harvard 庄晓薇的这个方向作的好牛。她真的能够看见单分子的
: in vivo 的运动吗？还有， Nucleic Acid - Protein Interactions？
: Single-Molecule biology:
: Nucleic Acid - Protein Interactions
: We explore single-molecule fluorescence imaging and spectroscopy techniques
: to study complex biomolecular systems.

h*n2012-03-17 07:03

164 楼

求定位激发原理

【在 s******y 的大作中提到】

: 首先，庄看的是生物大分子，所以不像你想象中的那么小。
: 第二，看见的其实是分子上标记的荧光基团的信号，只要背景足够低，感光元件
: 足够敏感，荧光基团足够强，就能看见单个分子的荧光基团的信号。
: 但是如果直接用光学成像作定位的话会出问题，因为普通光学显微镜的
: 分辨率在0.2微米，这个大于大部分生物分子的尺寸，所以会无法准确定位。
: 庄的方法是倒过来推算，就是用定位激发的方式来确定该荧光分子的位置，
: 因为现代的物理机械定位的精度已经达到了纳米级别，所以可以比光学成像
: 的精度高。
: 至于说看蛋白和核酸的作用，其实就是在蛋白和核酸上放上不同的荧光集团，
: 然后看两者的作用。或者是看其中一个的结合和另外一个分子上标记的荧光

s*y2012-03-17 07:03

165 楼

在我的理解里，一种最简单的方法，就是用机械的方式，把激光的激发头
对准某个点，对准的精度可以达到纳米。当然，激光对得再准，也有一个
发出的光的光斑问题，因为因为激光也是光，也有一个0.2um的问题，但是通过计算，
可以知道激光点的那个光斑里面的最高强度的峰的位置在哪里，然后再经过计算，就知
道应该是什么什么范围里面能受到最大的激发（这个范围就会远小于0.2um）。然后一
条线上扫描过去后，再经过计算，把那些因为是受到非光峰的
散光而被激发的点的信号给抹去，剩下的点大概应该就是精确的点了。

【在 h****n 的大作中提到】

: 求定位激发原理

s*y2012-03-17 07:03

166 楼

具体是不是这样，可以等我师姐有空了上来科普（当然，我不是说庄师姐，
虽然她也算是我师姐。呵呵呵）

【在 s******y 的大作中提到】

: 在我的理解里，一种最简单的方法，就是用机械的方式，把激光的激发头
: 对准某个点，对准的精度可以达到纳米。当然，激光对得再准，也有一个
: 发出的光的光斑问题，因为因为激光也是光，也有一个0.2um的问题，但是通过计算，
: 可以知道激光点的那个光斑里面的最高强度的峰的位置在哪里，然后再经过计算，就知
: 道应该是什么什么范围里面能受到最大的激发（这个范围就会远小于0.2um）。然后一
: 条线上扫描过去后，再经过计算，把那些因为是受到非光峰的
: 散光而被激发的点的信号给抹去，剩下的点大概应该就是精确的点了。

g*f2012-03-17 07:03

167 楼

其实我最想看到的就是DNA链条扭来扭去的然后结合到了一个圆鼓鼓的蛋白上。那样的
话什么基因调控等等的分子生物学问题都迎刃而解了

s*y2012-03-17 07:03

168 楼

呵呵，我只知道这种最简单的方法，庄具体用什么方法定位的我还真的不知道。
你能不能说说？

pioneered

【在 a**y 的大作中提到】

: this is not Zhuang's principle. The method you mentioned is STED, pioneered
: by Stefan Hell (Zhuang's competitor).

m*o2012-03-17 07:03

169 楼

谢谢SUNNYDAY。可是，如果标上了荧光基团，那in vivo 的试验还真实吗？我是
说，不管DNA， RNA或蛋白质，加上一个额外的基团，它们的生物行为会改变的，
比如， DNA和蛋白质的相互作用，就可能不是真正的相互作用了。

m*o2012-03-17 07:03

170 楼

可能很多庄粉像我一样，并不真正懂得她做的东西。呵呵，也就是叶公好龙。

【在 g********0 的大作中提到】

: 这个帖子没人回答表明很多庄粉其实是叶公好龙。

s*y2012-03-17 07:03

171 楼

这个不好说，加了的确会有这个改变分子行为的风险，但是你不加那个基团，
就会什么都看不到。所以有时候不同实验室用不同方法标记作出来的实验
的结果不能吻合。这个就是一个风险问题。
比较严格的时候，会把那个标记过的东西来测一下它的活性，看看和原始的
未标记的是否差不多，如果差不多的话，说明应该没有改变太多。

【在 m***o 的大作中提到】

: 谢谢SUNNYDAY。可是，如果标上了荧光基团，那in vivo 的试验还真实吗？我是
: 说，不管DNA， RNA或蛋白质，加上一个额外的基团，它们的生物行为会改变的，
: 比如， DNA和蛋白质的相互作用，就可能不是真正的相互作用了。

J*a2012-03-17 07:03

172 楼

that is not STED.

pioneered

【在 a**y 的大作中提到】

: this is not Zhuang's principle. The method you mentioned is STED, pioneered
: by Stefan Hell (Zhuang's competitor).

f*u2012-03-17 07:03

173 楼

我知道你说的这个方法，也记得庄好像用的不是这个。
庄的方法我记得是用比较弱的激发光，然后样品里面只有很小部分的荧光分子被激发，
从概率上来说两个相邻很紧的荧光分子被同时激发的可能性就很小了。
每个被激发的荧光分子会产生一个信号斑，然后她就认为这个斑的中心就是荧光分子所
在。
这个过程可以重复很多次，然后就可以得到很高的分辨率。
我印象里Janelia农场也有个人在做这个技术。
这个技术的缺点可能就是很慢，因为要扫很多次。

【在 s******y 的大作中提到】

: 呵呵，我只知道这种最简单的方法，庄具体用什么方法定位的我还真的不知道。
: 你能不能说说？
:
: pioneered

p*l2012-03-17 07:03

174 楼

庄的STORM和Betzig的PALM，基本原理一样。一句话说，如果你是在独立的单分子拍照，成像的分辨率差没关系，只要信号足够亮，定位精确度可以比成像分辨率高很多。打个比方，我和个朋友约个地方碰头，出门忘了带眼镜，看啥都不太清楚，不过运气好，碰头的地方就只一个人站在那里，不是我那朋友会是谁。如果运气不好，碰头的地方人山人海，就找不着人在哪了。
显微镜的光学分辨极限是200nm,，一个单分子会成像成一个约200nm直径的模糊光团，但是如果事先知道这肯定是个单分子，那么这个模糊光团的中心肯定是这个分子的位置。这个中心定位的准确性，决定于我拍到的光团的亮度，越亮的光团，中心定位越准。但是，如果我事先不知道这个光团是从一个单分子来的，这个光团其实是有可能从两个甚至更多的单分子来的，可能分子之间间距很小，在图像上糊成了一团。那么光团的中心即使找到了，也没什么意义。也就是说，这种超分辨定位方法，只在每个单分子之间的间距大于200nm的时候才有用。
一个荧光的细胞，上帝都没法保证这里面每个荧光分子间距足够开，所以尽管这个定位的方法很简单，可是没法直接用在生物成像上。PALM和STORM的创新在于，找到了方法，能随机把荧光分子来来回回在不发光的状态和发光状态之间调制。每次曝光之前，他们把大多数分子调到off state，只留下少数分子发光。这样处理之后，就能大体满足图像内全是互相分得很开的单分子。拍成的图像可以用来精确定位每个分子。因为一张图像，只是看见了很小一部分散立的分子，要看见样品的全貌，PALM 和STROM必须反复对样品分子的调制操作，每次曝光只随机观测很少一部分分子，最后把几十甚至上百张精确定位的单分子图叠加起来，合成最后的图像。
PALM和STORM比较关键的地方，在于怎么保证所有的信号都是从独立单分子来的。on-off switching是个随机过程，也就是说即使能做到>99%的单分子都分得很开，也没人能100％保证没有挤成一团发光的分子。疑似来自多分子的光团需要在图像处理中去掉。我不是做这个的，具体方法我也不清楚，不过从“疑似”和“去掉”两词，大家可以细心体会这里面水有多深。

pioneered

【在 a**y 的大作中提到】

: this is not Zhuang's principle. The method you mentioned is STED, pioneered
: by Stefan Hell (Zhuang's competitor).

p*l2012-03-17 07:03

175 楼

理论上讲，只有在大分子上特定的位置上直接加小分子的荧光团，做出来的定位结果才可信。可是这个是不可能in vivo的。in vitro做，蛋白上site specific 加
fluorescent conjugation，据我所知也是很难的事。

【在 m***o 的大作中提到】

: 谢谢SUNNYDAY。可是，如果标上了荧光基团，那in vivo 的试验还真实吗？我是
: 说，不管DNA， RNA或蛋白质，加上一个额外的基团，它们的生物行为会改变的，
: 比如， DNA和蛋白质的相互作用，就可能不是真正的相互作用了。

p*l2012-03-17 07:03

176 楼

Hell的STED传承于爱因斯坦。
当年爱因斯坦预言了simulated emission effect，几十年后，人们靠特殊物质的
stimulated emission effect造出了激光，激光出现几十年后，Hell靠着强大的激光在
生物样品中做出了simulated emission effect，在这个effect的基础上实现了超分辨
成像。
爱因斯坦才是真正的牛人，特别敢想，而且只想不做实验，把实验都留给了别人做，造就好几个实验诺奖。

【在 s******y 的大作中提到】

: 呵呵，我只知道这种最简单的方法，庄具体用什么方法定位的我还真的不知道。
: 你能不能说说？
:
: pioneered

a*y2012-03-17 07:03

177 楼

From his description, I also agree that it is more close to near-field
techniques.
But I guess that he really meant STED, since STED is more useful for
biological studies?

【在 J**a 的大作中提到】

: that is not STED.
:
: pioneered

a*e2012-03-17 07:03

178 楼

这个讲的不错。

照，成像的分辨率差没关系，只要信号足够亮，定位精确度可以比成像分辨率高很多。
打个比方，我和个朋友约个地方碰头，出门忘了带眼镜，看啥都不太清楚，不过运气好
，碰头的地方就只一个人站在那里，不是我那朋友会是谁。如果运气不好，碰头的地方
人山人海，就找不着人在哪了。
，但是如果事先知道这肯定是个单分子，那么这个模糊光团的中心肯定是这个分子的位
置。这个中心定位的准确性，决定于我拍到的光团的亮度，越亮的光团，中心定位越准
。但是，如果我事先不知道这个光团是从一个单分子来的，这个光团其实是有可能从两
个甚至更多的单分子来的，可能分子之间间距很小，在图像上糊成了一团。那么光团的
中心即使找到了，也没什么意义。也就是说，这种超分辨定位方法，只在每个单分子之
间的间距大于200nm的时候才有用。
位的方法很简单，可是没法直接用在生物成像上。PALM和STORM的创新在于，找到了方
法，能随机把荧光分子来来回回在不发光的状态和发光状态之间调制。每次曝光之前，
他们把大多数分子调到off state，只留下少数分子发光。这样处理之后，就能大体满
足图像内全是互相分得很开的单分子。拍成的图像可以用来精确定位每个分子。因为一
张图像，只是看见了很小一部分散立的分子，要看见样品的全貌，PALM 和STROM必须反
复对样品分子的调制操作，每次曝光只随机观测很少�: 徊糠址肿樱詈蟀鸭甘
踔辽习僬啪范ㄎ坏牡シ肿油嫉悠鹄矗铣勺詈蟮耐枷瘛�
off switching是个随机过程，也就是说即使能做到>99%的单分子都分得很开，也没人
能100％保证没有挤成一团发光的分子。疑似来自多分子的光团需要在图像处理中去掉
。我不是做这个的，具体方法我也不清楚，不过从“疑似”和“去掉”两词，大家可以
细心体会这里面水有多深。

【在 p*l 的大作中提到】

: 庄的STORM和Betzig的PALM，基本原理一样。一句话说，如果你是在独立的单分子拍照，成像的分辨率差没关系，只要信号足够亮，定位精确度可以比成像分辨率高很多。打个比方，我和个朋友约个地方碰头，出门忘了带眼镜，看啥都不太清楚，不过运气好，碰头的地方就只一个人站在那里，不是我那朋友会是谁。如果运气不好，碰头的地方人山人海，就找不着人在哪了。
: 显微镜的光学分辨极限是200nm,，一个单分子会成像成一个约200nm直径的模糊光团，但是如果事先知道这肯定是个单分子，那么这个模糊光团的中心肯定是这个分子的位置。这个中心定位的准确性，决定于我拍到的光团的亮度，越亮的光团，中心定位越准。但是，如果我事先不知道这个光团是从一个单分子来的，这个光团其实是有可能从两个甚至更多的单分子来的，可能分子之间间距很小，在图像上糊成了一团。那么光团的中心即使找到了，也没什么意义。也就是说，这种超分辨定位方法，只在每个单分子之间的间距大于200nm的时候才有用。
: 一个荧光的细胞，上帝都没法保证这里面每个荧光分子间距足够开，所以尽管这个定位的方法很简单，可是没法直接用在生物成像上。PALM和STORM的创新在于，找到了方法，能随机把荧光分子来来回回在不发光的状态和发光状态之间调制。每次曝光之前，他们把大多数分子调到off state，只留下少数分子发光。这样处理之后，就能大体满足图像内全是互相分得很开的单分子。拍成的图像可以用来精确定位每个分子。因为一张图像，只是看见了很小一部分散立的分子，要看见样品的全貌，PALM 和STROM必须反复对样品分子的调制操作，每次曝光只随机观测很少一部分分子，最后把几十甚至上百张精确定位的单分子图叠加起来，合成最后的图像。
: PALM和STORM比较关键的地方，在于怎么保证所有的信号都是从独立单分子来的。on-off switching是个随机过程，也就是说即使能做到>99%的单分子都分得很开，也没人能100％保证没有挤成一团发光的分子。疑似来自多分子的光团需要在图像处理中去掉。我不是做这个的，具体方法我也不清楚，不过从“疑似”和“去掉”两词，大家可以细心体会这里面水有多深。
:
: pioneered

l*12012-03-17 07:03

179 楼

Please go to
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20643879
Schermelleh L, Heintzmann R, Leonhardt H.
A guide to super-resolution fluorescence microscopy. (2010)
J Cell Biol.190(2):165-.
you will know more:
PALM or STORM both are restricted in living cell imaing...

【在 a****e 的大作中提到】

: 这个讲的不错。
:
: 照，成像的分辨率差没关系，只要信号足够亮，定位精确度可以比成像分辨率高很多。
: 打个比方，我和个朋友约个地方碰头，出门忘了带眼镜，看啥都不太清楚，不过运气好
: ，碰头的地方就只一个人站在那里，不是我那朋友会是谁。如果运气不好，碰头的地方
: 人山人海，就找不着人在哪了。
: ，但是如果事先知道这肯定是个单分子，那么这个模糊光团的中心肯定是这个分子的位
: 置。这个中心定位的准确性，决定于我拍到的光团的亮度，越亮的光团，中心定位越准
: 。但是，如果我事先不知道这个光团是从一个单分子来的，这个光团其实是有可能从两
: 个甚至更多的单分子来的，可能分子之间间距很小，在图像上糊成了一团。那么光团的

a*e2012-03-17 07:03

180 楼

very helpful. thanks

【在 l**********1 的大作中提到】

: Please go to
: //www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20643879
: Schermelleh L, Heintzmann R, Leonhardt H.
: A guide to super-resolution fluorescence microscopy. (2010)
: J Cell Biol.190(2):165-.
: you will know more:
: PALM or STORM both are restricted in living cell imaing...

l*12012-03-17 07:03

181 楼

De rien.

【在 a****e 的大作中提到】

: very helpful. thanks

p*e2012-03-17 07:03

182 楼

讲个很清楚，门外汉学习了

照，成像的分辨率差没关系，只要信号足够亮，定位精确度可以比成像分辨率高很多。
打个比方，我和个朋友约个地方碰头，出门忘了带眼镜，看啥都不太清楚，不过运气好
，碰头的地方就只一个人站br />
一个约200nm直径的模糊光团，但是如果事先知道这肯定是个单分子，那么这个模糊光
团的中心肯定是这个分子的位置。这个中心定位的准确性，决定于我拍到的光团的亮度
，越亮的光团，中心定位越准。但是，如果我事先不知道br />
没法保证这里面每个荧光分子间距足够开，所以尽管这个定位的方法很简单，可是没法
直接用在生物成像上。PALM和STORM的创新在于，找到了方法，能随机把荧光分子来来
回回在不发光的状态和发光状态之间调制。每次曝光之前，他们把大多数分子调到off
s
off switching是个随机过程，也就是说即使能做到>99%的单分子都分得很开，也没人
能100％保证没有挤成一团发光的分子。疑似来自多分子的光团需要在图像处理中去掉
。我不是做这个的，具体方法

【在 p*l 的大作中提到】

: 庄的STORM和Betzig的PALM，基本原理一样。一句话说，如果你是在独立的单分子拍照，成像的分辨率差没关系，只要信号足够亮，定位精确度可以比成像分辨率高很多。打个比方，我和个朋友约个地方碰头，出门忘了带眼镜，看啥都不太清楚，不过运气好，碰头的地方就只一个人站在那里，不是我那朋友会是谁。如果运气不好，碰头的地方人山人海，就找不着人在哪了。
: 显微镜的光学分辨极限是200nm,，一个单分子会成像成一个约200nm直径的模糊光团，但是如果事先知道这肯定是个单分子，那么这个模糊光团的中心肯定是这个分子的位置。这个中心定位的准确性，决定于我拍到的光团的亮度，越亮的光团，中心定位越准。但是，如果我事先不知道这个光团是从一个单分子来的，这个光团其实是有可能从两个甚至更多的单分子来的，可能分子之间间距很小，在图像上糊成了一团。那么光团的中心即使找到了，也没什么意义。也就是说，这种超分辨定位方法，只在每个单分子之间的间距大于200nm的时候才有用。
: 一个荧光的细胞，上帝都没法保证这里面每个荧光分子间距足够开，所以尽管这个定位的方法很简单，可是没法直接用在生物成像上。PALM和STORM的创新在于，找到了方法，能随机把荧光分子来来回回在不发光的状态和发光状态之间调制。每次曝光之前，他们把大多数分子调到off state，只留下少数分子发光。这样处理之后，就能大体满足图像内全是互相分得很开的单分子。拍成的图像可以用来精确定位每个分子。因为一张图像，只是看见了很小一部分散立的分子，要看见样品的全貌，PALM 和STROM必须反复对样品分子的调制操作，每次曝光只随机观测很少一部分分子，最后把几十甚至上百张精确定位的单分子图叠加起来，合成最后的图像。
: PALM和STORM比较关键的地方，在于怎么保证所有的信号都是从独立单分子来的。on-off switching是个随机过程，也就是说即使能做到>99%的单分子都分得很开，也没人能100％保证没有挤成一团发光的分子。疑似来自多分子的光团需要在图像处理中去掉。我不是做这个的，具体方法我也不清楚，不过从“疑似”和“去掉”两词，大家可以细心体会这里面水有多深。
:
: pioneered

e*o2012-03-17 07:03

183 楼

这套系统的硬件好像不是太贵，数据分析很难。据说现在有商业化的。不知道有谁在用
这套体系作实验没有，是不是需要train很长的时间才能玩得转？

p*n2012-03-17 07:03

184 楼

zhuang给talk的时候说只需要对现有imaging设备稍作改造，软件也很容易。
我猜既然算法和界面已经有了，操作应该难不到那里去。

【在 e***o 的大作中提到】

: 这套系统的硬件好像不是太贵，数据分析很难。据说现在有商业化的。不知道有谁在用
: 这套体系作实验没有，是不是需要train很长的时间才能玩得转？

p*l2012-03-17 07:03

185 楼

Raman scatter和Stimulated emission是两码事。

【在 l**********1 的大作中提到】

: CARS from Maxwell Equation.
: please go to paper link:
: //www.math.jussieu.fr/~texier/bbcnt.pdf
:
: 造就好几个实验诺奖。

v*s2012-03-17 07:03

186 楼

只要你运气不是太差，多分子的光团很难恰好也能符合高斯拟合，换句话说，你单分子
的光团理论上讲只有一个亮度中心，其余地方的亮度在极坐标下应该和角度无关，只依
赖于到亮度中心的距离，多分子的光团（特别是两分子，三分子的时候）几乎做不到这
一点，所以去掉这个倒不难。
但我始终对这玩意的原理感到不安，他实质上就是一个deconvolution。你看到的东西
是你的真实信号（假设是dirac function）和你的Instrument response（一个200纳米
的gaussian function）的convolution。那么你把gaussian function从你看到的东西
里面deconvolute掉以后，就是真实信号了。他只不过为了降低deconvolution的难度，
加了一些限制条件（真实信号只是单个dirac function）。
按这个理论，任何仪器的时空精度都可以无限了。我觉得不靠谱的，随便想一下，这个
肯定也要依赖于你的detection system的分辨率有多高，比如你CCD的pixel size是多
少。如果你一个pixel对应过去就是200纳米大小的一个方块，那你拟合出来的结果十有
八九都是在这个方块的中心，显然就不对了。再打个比方，你要测压强，先测了力，再
测了面积，然后一按计算器，搞出个七八位有效数字，这是忽悠人啊。

照，成像的分辨率差没关系，只要信号足够亮，定位精确度可以比成像分辨率高很多。
打个比方，我和个朋友约个地方碰头，出门忘了带眼镜，看啥都不太清楚，不过运气好
，碰头的地方就只一个人站在那里，不是我那朋友会是谁。如果运气不好，碰头的地方
人山人海，就找不着人在哪了。
，但是如果事先知道这肯定是个单分子，那么这个模糊光团的中心肯定是这个分子的位
置。这个中心定位的准确性，决定于我拍到的光团的亮度，越亮的光团，中心定位越准
。但是，如果我事先不知道这个光团是从一个单分子来的，这个光团其实是有可能从两
个甚至更多的单分子来的，可能分子之间间距很小，在图像上糊成了一团。那么光团的
中心即使找到了，也没什么意义。也就是说，这种超分辨定位方法，只在每个单分子之
间的间距大于200nm的时候才有用。
位的方法很简单，可是没法直接用在生物成像上。PALM和STORM的创新在于，找到了方
法，能随机把荧光分子来来回回在不发光的状态和发光状态之间调制。每次曝光之前，
他们把大多数分子调到off state，只留下少数分子发光。这样处理之后，就能大体满
足图像内全是互相分得很开的单分子。拍成的图像可以用来精确定位每个分子。因为一
张图像，只是看见了很小一部分散立的分子，要看见样品的全貌，PALM 和STROM必须反
复对样品分子的调制操作，每次曝光只随机观测很少�: 徊糠址肿樱詈蟀鸭甘
踔辽习僬啪范ㄎ坏牡シ肿油嫉悠鹄矗铣勺詈蟮耐枷瘛�
off switching是个随机过程，也就是说即使能做到>99%的单分子都分得很开，也没人
能100％保证没有挤成一团发光的分子。疑似来自多分子的光团需要在图像处理中去掉
。我不是做这个的，具体方法我也不清楚，不过从“疑似”和“去掉”两词，大家可以
细心体会这里面水有多深。

【在 p*l 的大作中提到】

: 庄的STORM和Betzig的PALM，基本原理一样。一句话说，如果你是在独立的单分子拍照，成像的分辨率差没关系，只要信号足够亮，定位精确度可以比成像分辨率高很多。打个比方，我和个朋友约个地方碰头，出门忘了带眼镜，看啥都不太清楚，不过运气好，碰头的地方就只一个人站在那里，不是我那朋友会是谁。如果运气不好，碰头的地方人山人海，就找不着人在哪了。
: 显微镜的光学分辨极限是200nm,，一个单分子会成像成一个约200nm直径的模糊光团，但是如果事先知道这肯定是个单分子，那么这个模糊光团的中心肯定是这个分子的位置。这个中心定位的准确性，决定于我拍到的光团的亮度，越亮的光团，中心定位越准。但是，如果我事先不知道这个光团是从一个单分子来的，这个光团其实是有可能从两个甚至更多的单分子来的，可能分子之间间距很小，在图像上糊成了一团。那么光团的中心即使找到了，也没什么意义。也就是说，这种超分辨定位方法，只在每个单分子之间的间距大于200nm的时候才有用。
: 一个荧光的细胞，上帝都没法保证这里面每个荧光分子间距足够开，所以尽管这个定位的方法很简单，可是没法直接用在生物成像上。PALM和STORM的创新在于，找到了方法，能随机把荧光分子来来回回在不发光的状态和发光状态之间调制。每次曝光之前，他们把大多数分子调到off state，只留下少数分子发光。这样处理之后，就能大体满足图像内全是互相分得很开的单分子。拍成的图像可以用来精确定位每个分子。因为一张图像，只是看见了很小一部分散立的分子，要看见样品的全貌，PALM 和STROM必须反复对样品分子的调制操作，每次曝光只随机观测很少一部分分子，最后把几十甚至上百张精确定位的单分子图叠加起来，合成最后的图像。
: PALM和STORM比较关键的地方，在于怎么保证所有的信号都是从独立单分子来的。on-off switching是个随机过程，也就是说即使能做到>99%的单分子都分得很开，也没人能100％保证没有挤成一团发光的分子。疑似来自多分子的光团需要在图像处理中去掉。我不是做这个的，具体方法我也不清楚，不过从“疑似”和“去掉”两词，大家可以细心体会这里面水有多深。
:
: pioneered

v*s2012-03-17 07:03

187 楼

这个话也不能这么说吧。这要都能算传承，那估计直到18世纪，所有的物理学家都是传
承牛顿的。
我觉得STED能搞出来，最重要的不是stimulated emission，这个大家都知道，而是对
波前的精确控制，能有doughnut-shaped laser beam。

造就好几个实验诺奖。

【在 p*l 的大作中提到】

: Hell的STED传承于爱因斯坦。
: 当年爱因斯坦预言了simulated emission effect，几十年后，人们靠特殊物质的
: stimulated emission effect造出了激光，激光出现几十年后，Hell靠着强大的激光在
: 生物样品中做出了simulated emission effect，在这个effect的基础上实现了超分辨
: 成像。
: 爱因斯坦才是真正的牛人，特别敢想，而且只想不做实验，把实验都留给了别人做，造就好几个实验诺奖。

p*l2012-03-17 07:03

188 楼

Hell关于STED的第一篇文章，是93年发在optics letters上的。文章核心的公式就是当
年爱因斯坦写下的。
doughnut好不好确实很重要，但是没有强功率的激光，什么都白搭。从93年的第一篇文
章，到后来的nature method，Hell花了十年实现这个想法。这十年，恰好是高功率激
光研制制造技术腾飞的十年。早期Hell的实验，很多时候受激光功率波长的限制，常常
要自己搭激光。现在，Hell已经牛到有公司愿意为STED专门去研制激光了。

【在 v*****s 的大作中提到】

: 这个话也不能这么说吧。这要都能算传承，那估计直到18世纪，所有的物理学家都是传
: 承牛顿的。
: 我觉得STED能搞出来，最重要的不是stimulated emission，这个大家都知道，而是对
: 波前的精确控制，能有doughnut-shaped laser beam。
:
: 造就好几个实验诺奖。

v*s2012-03-17 07:03

189 楼

STED的分辨率直接取决于doughnut中间那个空心的大小，这个对一个超分辨技术来说当
然是最重要的因素。他要多强功率的激光，我倒没印象了。我个人觉得一般强功率激光
都是军事用途的，硬烧伤或者模拟核试验的，米帝境内功率最强的激光应该是波音搞得
那个反导弹系统，单位面积强度最大的应该是那个XX实验室里面用32束激光聚焦到同一
点搞核聚变的。科研上很少用到太强功率的激光，生物的更不可能了，直接把细胞气化
了。
其实只要有那个doughnut的激光，有很多手段可以达到超分辨的，stimulated
emission只是其中一种，还未必是最好的一种。这个里面最重要的idea是用激光
deplete你的on state。sunney xie好像就用类似的办法实现了raman的单分子探测。

【在 p*l 的大作中提到】

: Hell关于STED的第一篇文章，是93年发在optics letters上的。文章核心的公式就是当
: 年爱因斯坦写下的。
: doughnut好不好确实很重要，但是没有强功率的激光，什么都白搭。从93年的第一篇文
: 章，到后来的nature method，Hell花了十年实现这个想法。这十年，恰好是高功率激
: 光研制制造技术腾飞的十年。早期Hell的实验，很多时候受激光功率波长的限制，常常
: 要自己搭激光。现在，Hell已经牛到有公司愿意为STED专门去研制激光了。

p*l2012-03-17 07:03

190 楼

STED对激光有些特殊要求，不是总功率大就行了。
STED造doughnut的方法，早Hell几十年就有人知道怎么做了，可是一直只是
做光学的人自娱自乐的一个小东西。Hell从骨子上是个物理学家，他自己造激
光可以，但是做optical enigineering 的底子差点，所以走了好多弯路才发现
做doughnut方法已经在那里了。如果是专做imaging system engineering
的人，可能第一时间就想到了。不过我自己觉得想法比工程实现重要的多。
想法好，目标明确，工程上的难题不管花多久总能解决的。现在回头看Hell成
名前的文章，杂七杂八试了好多不靠谱的工程方案，个中心酸，恐怕只有同行
能感觉得到。

【在 v*****s 的大作中提到】

: STED的分辨率直接取决于doughnut中间那个空心的大小，这个对一个超分辨技术来说当
: 然是最重要的因素。他要多强功率的激光，我倒没印象了。我个人觉得一般强功率激光
: 都是军事用途的，硬烧伤或者模拟核试验的，米帝境内功率最强的激光应该是波音搞得
: 那个反导弹系统，单位面积强度最大的应该是那个XX实验室里面用32束激光聚焦到同一
: 点搞核聚变的。科研上很少用到太强功率的激光，生物的更不可能了，直接把细胞气化
: 了。
: 其实只要有那个doughnut的激光，有很多手段可以达到超分辨的，stimulated
: emission只是其中一种，还未必是最好的一种。这个里面最重要的idea是用激光
: deplete你的on state。sunney xie好像就用类似的办法实现了raman的单分子探测。

b*s2012-03-17 07:03

191 楼

搭车请教一下FCS. Fluorescence correlation spectroscopy (FCS). 这个是从另外的
角度来研究荧光分子的运动。不追求高分辨率，只是测fluctuations，普通共聚焦就够
了。原理看起来也不复杂，但是在搜集的数据分析阶段看起来很多需要经验，判断哪些
数据不好。而且很多时候得出跟传统方法（比如FRAP)很不一样的结论。很多时候可以
说FCS研究单个分子的波动，FRAP研究一个群体。但是对很多结果还是觉得半信半疑。
有没有高手给讲解一下。谢谢。

【在 p*l 的大作中提到】

: STED对激光有些特殊要求，不是总功率大就行了。
: STED造doughnut的方法，早Hell几十年就有人知道怎么做了，可是一直只是
: 做光学的人自娱自乐的一个小东西。Hell从骨子上是个物理学家，他自己造激
: 光可以，但是做optical enigineering 的底子差点，所以走了好多弯路才发现
: 做doughnut方法已经在那里了。如果是专做imaging system engineering
: 的人，可能第一时间就想到了。不过我自己觉得想法比工程实现重要的多。
: 想法好，目标明确，工程上的难题不管花多久总能解决的。现在回头看Hell成
: 名前的文章，杂七杂八试了好多不靠谱的工程方案，个中心酸，恐怕只有同行
: 能感觉得到。

b*s2012-03-17 07:03

192 楼

搭车请教一下FCS. Fluorescence correlation spectroscopy (FCS). 这个是从另外的
角度来研究荧光分子的运动。不追求高分辨率，只是测fluctuations，普通共聚焦就够
了。原理看起来也不复杂，但是在搜集的数据分析阶段看起来很多需要经验，判断哪些
数据不好。而且很多时候得出跟传统方法（比如FRAP)很不一样的结论。很多时候可以
说FCS研究单个分子的波动，FRAP研究一个群体。但是对很多结果还是觉得半信半疑。
有没有高手给讲解一下。谢谢。

【在 p*l 的大作中提到】

: STED对激光有些特殊要求，不是总功率大就行了。
: STED造doughnut的方法，早Hell几十年就有人知道怎么做了，可是一直只是
: 做光学的人自娱自乐的一个小东西。Hell从骨子上是个物理学家，他自己造激
: 光可以，但是做optical enigineering 的底子差点，所以走了好多弯路才发现
: 做doughnut方法已经在那里了。如果是专做imaging system engineering
: 的人，可能第一时间就想到了。不过我自己觉得想法比工程实现重要的多。
: 想法好，目标明确，工程上的难题不管花多久总能解决的。现在回头看Hell成
: 名前的文章，杂七杂八试了好多不靠谱的工程方案，个中心酸，恐怕只有同行
: 能感觉得到。

a*q2012-03-17 07:03

193 楼

实际的instrument response应该是pixel和gaussian function的convolution。稍微算
一下就可以发现，只要pixel的大小小于gaussian的standard deviation，pixel对定位
精度的影响是很小的。影响定位精度最大的因素是噪音，跟检测到的光子个数和背景强
度直接相关。所以信号无限的情况下，时空精度真的是可以无限的，只是实际实验中单
分子的信号当然不可能是无限的。

。

【在 v*****s 的大作中提到】

: STED的分辨率直接取决于doughnut中间那个空心的大小，这个对一个超分辨技术来说当
: 然是最重要的因素。他要多强功率的激光，我倒没印象了。我个人觉得一般强功率激光
: 都是军事用途的，硬烧伤或者模拟核试验的，米帝境内功率最强的激光应该是波音搞得
: 那个反导弹系统，单位面积强度最大的应该是那个XX实验室里面用32束激光聚焦到同一
: 点搞核聚变的。科研上很少用到太强功率的激光，生物的更不可能了，直接把细胞气化
: 了。
: 其实只要有那个doughnut的激光，有很多手段可以达到超分辨的，stimulated
: emission只是其中一种，还未必是最好的一种。这个里面最重要的idea是用激光
: deplete你的on state。sunney xie好像就用类似的办法实现了raman的单分子探测。

f*u2012-03-17 07:03

194 楼

顺便问一句，light sheet microscopy有人了解吗？
这玩艺儿的硬件恐怕目前还得自己搭才行吧。

【在 p*****n 的大作中提到】

: zhuang给talk的时候说只需要对现有imaging设备稍作改造，软件也很容易。
: 我猜既然算法和界面已经有了，操作应该难不到那里去。

f*e2012-03-17 07:03

195 楼

ccd camera 是对被 objective 放大之后成像的检测，所以虽然 pixel size 不算太小
，但是算上放大倍数，使得单分子荧光出来的信号不是完全只占一个 pixel 的。基本
上还是能有几个 pixel 产生一个 distribution，这样 deconvolution 就有意义了。

【在 v*****s 的大作中提到】

: 只要你运气不是太差，多分子的光团很难恰好也能符合高斯拟合，换句话说，你单分子
: 的光团理论上讲只有一个亮度中心，其余地方的亮度在极坐标下应该和角度无关，只依
: 赖于到亮度中心的距离，多分子的光团（特别是两分子，三分子的时候）几乎做不到这
: 一点，所以去掉这个倒不难。
: 但我始终对这玩意的原理感到不安，他实质上就是一个deconvolution。你看到的东西
: 是你的真实信号（假设是dirac function）和你的Instrument response（一个200纳米
: 的gaussian function）的convolution。那么你把gaussian function从你看到的东西
: 里面deconvolute掉以后，就是真实信号了。他只不过为了降低deconvolution的难度，
: 加了一些限制条件（真实信号只是单个dirac function）。
: 按这个理论，任何仪器的时空精度都可以无限了。我觉得不靠谱的，随便想一下，这个

a*q2012-03-17 07:03

196 楼

德国的Ernst Stelzer在卖他们搭的仪器，

【在 f**u 的大作中提到】

: 顺便问一句，light sheet microscopy有人了解吗？
: 这玩艺儿的硬件恐怕目前还得自己搭才行吧。

z*62012-03-17 07:03

197 楼

嗯，顶一下这个，也想了解一下，老婆在做这个，但是也不太懂... 我只知道最后分析
要计算numbers and brightness... so called N&B analysis...

【在 b******s 的大作中提到】

: 搭车请教一下FCS. Fluorescence correlation spectroscopy (FCS). 这个是从另外的
: 角度来研究荧光分子的运动。不追求高分辨率，只是测fluctuations，普通共聚焦就够
: 了。原理看起来也不复杂，但是在搜集的数据分析阶段看起来很多需要经验，判断哪些
: 数据不好。而且很多时候得出跟传统方法（比如FRAP)很不一样的结论。很多时候可以
: 说FCS研究单个分子的波动，FRAP研究一个群体。但是对很多结果还是觉得半信半疑。
: 有没有高手给讲解一下。谢谢。

a*q2012-03-17 07:03

198 楼

FCS不是严格意义上的单分子技术，简单说，就是把观测体积降到特别小（比如用
confocal）。这样的话在可观测体积内的分子个数也会特别少。因为分子在不断扩散进
进出出，所以检测到的荧光信号随体积内分子个数的变化有涨落，分子个数越少，涨落
相对越大。这样从涨落的幅度可以得到平均分子个数，平均荧光信号强度除以这个分子
个数就得到每一个分子的平均亮度；从涨落的时间尺度可以得到分子扩散经过这个体积
的时间，也就可以得到扩散系数。跟FRAP比，FCS完全是在平衡态做实验的。

【在 z*******6 的大作中提到】

: 嗯，顶一下这个，也想了解一下，老婆在做这个，但是也不太懂... 我只知道最后分析
: 要计算numbers and brightness... so called N&B analysis...

s*y2012-03-17 07:03

199 楼

我怎么觉得这个方法。。。怎么看怎么让我觉得不舒服。。。
活细胞可是会动的，怎么把细胞运动带来的噪音消除掉？
而且细胞可不是只往一个方向跑，而经常是在那里抖来抖去的。

【在 a*q 的大作中提到】

: FCS不是严格意义上的单分子技术，简单说，就是把观测体积降到特别小（比如用
: confocal）。这样的话在可观测体积内的分子个数也会特别少。因为分子在不断扩散进
: 进出出，所以检测到的荧光信号随体积内分子个数的变化有涨落，分子个数越少，涨落
: 相对越大。这样从涨落的幅度可以得到平均分子个数，平均荧光信号强度除以这个分子
: 个数就得到每一个分子的平均亮度；从涨落的时间尺度可以得到分子扩散经过这个体积
: 的时间，也就可以得到扩散系数。跟FRAP比，FCS完全是在平衡态做实验的。

w*x2012-03-17 07:03

200 楼

庄的病毒-蛋白互作很多就是用smFRET的啊。。。和STORM好像关系不大
至少我去年JC看了几篇她的HIV逆转录起始方面的文章，都是FRET。。。
顺便，觉得庄姐姐的paper写作很不错，至少我看得那几篇逻辑非常清楚，读起来很舒服。。。

v*s2012-03-17 07:03

201 楼

我知道的这个方法就是测分子在溶液里面的diffusion constant，还是make sense的。
你这么想两个极端情况，分子完全不动，那你的time trace要么是0，要么是1，反正是
个constant，time correlation是1，分子动得特别快，time trace都是从0一下子跳到
1，或者从1一下子跳到0，time correlation是0。其他时候介于两者之间，分子扩散越
快，time correlation越小。其中还有一个参数是分子体积，如果分子体积已知，就可
以算diffusion constant，反过来如果diffusion constant已知，就可以算分子体积。
不知道怎么测细胞。

【在 s******y 的大作中提到】

: 我怎么觉得这个方法。。。怎么看怎么让我觉得不舒服。。。
: 活细胞可是会动的，怎么把细胞运动带来的噪音消除掉？
: 而且细胞可不是只往一个方向跑，而经常是在那里抖来抖去的。

b*s2012-03-17 07:03

202 楼

在数据分析中，他们会做一些correlation，据说可以去除移动带来的噪音。
我想知道楼上有人说FCS主要使用平衡态体系，如果这样，应当不适用活体细胞，更使
用溶液的环境。
细胞内有复杂的cytoplasmic streaming，并且有大量的cytoplasmic components导致
的运动延迟。

【在 s******y 的大作中提到】

: 我怎么觉得这个方法。。。怎么看怎么让我觉得不舒服。。。
: 活细胞可是会动的，怎么把细胞运动带来的噪音消除掉？
: 而且细胞可不是只往一个方向跑，而经常是在那里抖来抖去的。

v*s2012-03-17 07:03

203 楼

庄jj的presentation也是很好的，甩sunney xie院士几条街。

舒服。。。

【在 w***x 的大作中提到】

: 庄的病毒-蛋白互作很多就是用smFRET的啊。。。和STORM好像关系不大
: 至少我去年JC看了几篇她的HIV逆转录起始方面的文章，都是FRET。。。
: 顺便，觉得庄姐姐的paper写作很不错，至少我看得那几篇逻辑非常清楚，读起来很舒服。。。

a*q2012-03-17 07:03

204 楼

如果你关心的是扩散系数的精确值，在细胞里面做当然很困难，因为分子的行为可能根
本就不是随机扩散。但是如果想看的东西不依赖扩散的模型的话，比如扩散速度的相对
变化，或者是在细胞里面分子的行为偏离随机扩散有多远等等，FCS是没有任何问题的
。这些东西对于FRAP是同样适用的。
说平衡态体系主要指FCS是在一个没有被扰动的稳态（也就是细胞或者溶液的平常状态
）测的，而FRAP是先改变这个体系然后看它多快恢复稳态。

【在 b******s 的大作中提到】

: 在数据分析中，他们会做一些correlation，据说可以去除移动带来的噪音。
: 我想知道楼上有人说FCS主要使用平衡态体系，如果这样，应当不适用活体细胞，更使
: 用溶液的环境。
: 细胞内有复杂的cytoplasmic streaming，并且有大量的cytoplasmic components导致
: 的运动延迟。

a*q2012-03-17 07:03

205 楼

时间尺度不一样吧。分子扩散造成的涨落都在微秒到毫秒级的，细胞自己的运动可以很
容易分辨出来。

【在 s******y 的大作中提到】

: 我怎么觉得这个方法。。。怎么看怎么让我觉得不舒服。。。
: 活细胞可是会动的，怎么把细胞运动带来的噪音消除掉？
: 而且细胞可不是只往一个方向跑，而经常是在那里抖来抖去的。

s*y2012-03-17 07:03

206 楼

如果只能测溶液的话，那么对我们学cell biol的人就没有太多意思了。
而且也不可能代替FRAP.
其实如果只是想看在细胞里扩散的话，还不如直接用photo-activatable fluorescent
protein 吧？

【在 v*****s 的大作中提到】

: 我知道的这个方法就是测分子在溶液里面的diffusion constant，还是make sense的。
: 你这么想两个极端情况，分子完全不动，那你的time trace要么是0，要么是1，反正是
: 个constant，time correlation是1，分子动得特别快，time trace都是从0一下子跳到
: 1，或者从1一下子跳到0，time correlation是0。其他时候介于两者之间，分子扩散越
: 快，time correlation越小。其中还有一个参数是分子体积，如果分子体积已知，就可
: 以算diffusion constant，反过来如果diffusion constant已知，就可以算分子体积。
: 不知道怎么测细胞。

b*s2012-03-17 07:03

207 楼

我刚做过photo-convertible protein. 我觉得这种tag有时候不是很理想。他们
convert需要一定能量的laser，但是多于或者少于最佳能量的laser也能导致部分
convert。这就导致convert的区域并不精确。附近一定区域内的蛋白都会多少被
convert。尤其是想在胞内做convert，我觉得即使用双光子都不够理想。

fluorescent

【在 s******y 的大作中提到】

: 如果只能测溶液的话，那么对我们学cell biol的人就没有太多意思了。
: 而且也不可能代替FRAP.
: 其实如果只是想看在细胞里扩散的话，还不如直接用photo-activatable fluorescent
: protein 吧？

a*q2012-03-17 07:03

208 楼

最早的细胞里面的FCS实验差不多有十年了吧，一直都有人在做，很多时候可以代替
FRAP或者比FRAP更好，但是仪器和数据分析没有FRAP简单，而且一直没有特别突出的成
果就是了。

fluorescent

【在 s******y 的大作中提到】

: 如果只能测溶液的话，那么对我们学cell biol的人就没有太多意思了。
: 而且也不可能代替FRAP.
: 其实如果只是想看在细胞里扩散的话，还不如直接用photo-activatable fluorescent
: protein 吧？

b*s2012-03-17 07:03

209 楼

我很想知道的是，FCS理论上看比FRAP似乎更适合活体，不会有photo bleach，也没有
phototoxicity，对活体细胞干扰最小。为什么没有取得突出成果。FCS现在发展出了很
多不同的方法，像上文有人说到的N&B，RICS， PCF。看起来对研究活体蛋白很有用。
有什么比较大的局限导致应用不多，成果不大呢？

【在 a*q 的大作中提到】

: 最早的细胞里面的FCS实验差不多有十年了吧，一直都有人在做，很多时候可以代替
: FRAP或者比FRAP更好，但是仪器和数据分析没有FRAP简单，而且一直没有特别突出的成
: 果就是了。
:
: fluorescent

a*q2012-03-17 07:03

210 楼

我猜的话，FCS有条件用的人、用得好的人还是太少。毕竟不像FRAP那样，大多数显微
镜都可以凑合着做，找个Excel都可以分析数据，几乎每个生物实验室都可以去试一
试，虽然大部分时候也没有很怎么样的结果，但是总会撞到好运气的。

【在 b******s 的大作中提到】

: 我很想知道的是，FCS理论上看比FRAP似乎更适合活体，不会有photo bleach，也没有
: phototoxicity，对活体细胞干扰最小。为什么没有取得突出成果。FCS现在发展出了很
: 多不同的方法，像上文有人说到的N&B，RICS， PCF。看起来对研究活体蛋白很有用。
: 有什么比较大的局限导致应用不多，成果不大呢？

s*y2012-03-17 07:03

211 楼

啊？难道你们不能把激光束调到0.5 um 的一个点么？
这样的话还是能比较定点的。

【在 b******s 的大作中提到】

: 我刚做过photo-convertible protein. 我觉得这种tag有时候不是很理想。他们
: convert需要一定能量的laser，但是多于或者少于最佳能量的laser也能导致部分
: convert。这就导致convert的区域并不精确。附近一定区域内的蛋白都会多少被
: convert。尤其是想在胞内做convert，我觉得即使用双光子都不够理想。
:
: fluorescent

s*y2012-03-17 07:03

212 楼

哦，你这么一讲我就明白了。

【在 a*q 的大作中提到】

: 时间尺度不一样吧。分子扩散造成的涨落都在微秒到毫秒级的，细胞自己的运动可以很
: 容易分辨出来。

h*w2012-03-17 07:03

213 楼

SRS 在临床和基础生物学的用途会远超superres 。 Superres照完会被覆折射率材料高
调。
Sunny 高出superres SRS了，给个link 阿

f*u2012-03-17 07:03

214 楼

能给个连接吗？Google了一下没查到。他是开了个公司吗？
另外这个玩艺儿如果买来了以后维护升级什么的怎么办？

【在 a*q 的大作中提到】

: 德国的Ernst Stelzer在卖他们搭的仪器，

a*52012-03-17 07:03

215 楼

自己搭不贵，一个TIRF+激光器+低温CCD够了，当然，商业化了的就贵了，nikon一套全
配置要200k刀
分析有商业化的，也有免费的，当然最放心的还是自己写代码。目前用过的最好的是
nikon的软件（单独不卖似乎）和免费的rapidSTORM

【在 e***o 的大作中提到】

: 这套系统的硬件好像不是太贵，数据分析很难。据说现在有商业化的。不知道有谁在用
: 这套体系作实验没有，是不是需要train很长的时间才能玩得转？

a*52012-03-17 07:03

216 楼

单分子成像的分辨率又不是无限小的，目前技术条件只能到10nm左右，真的到了生物样
品，能接近20nm就很好很好了
拟合得到的位置不会只在某像素中心，取决于周围pixel。拟合的最终分辨率取决于CCD
分辨率，photon量和本底噪音水平。好几篇发表了的protocol都有详细讨论。

【在 v*****s 的大作中提到】

: 只要你运气不是太差，多分子的光团很难恰好也能符合高斯拟合，换句话说，你单分子
: 的光团理论上讲只有一个亮度中心，其余地方的亮度在极坐标下应该和角度无关，只依
: 赖于到亮度中心的距离，多分子的光团（特别是两分子，三分子的时候）几乎做不到这
: 一点，所以去掉这个倒不难。
: 但我始终对这玩意的原理感到不安，他实质上就是一个deconvolution。你看到的东西
: 是你的真实信号（假设是dirac function）和你的Instrument response（一个200纳米
: 的gaussian function）的convolution。那么你把gaussian function从你看到的东西
: 里面deconvolute掉以后，就是真实信号了。他只不过为了降低deconvolution的难度，
: 加了一些限制条件（真实信号只是单个dirac function）。
: 按这个理论，任何仪器的时空精度都可以无限了。我觉得不靠谱的，随便想一下，这个

m*o2012-03-17 07:03

217 楼

天啦，这么多牛人。我是彻底看不懂这些了。
可是综合看来，如果我有一个蛋白，想看看in vivo 是否由于miss folding 而失活
，那肯定不行，对吗？但是，可以in vitro 看看。
主要是，这么fancy 的东西，到底cell bology 上有没有用。

a*52012-03-17 07:03

218 楼

因为是stochastic的，当然不能排除个别情况下有多个相近的分子同时switch on的可
能。但后期处理时，这种事件很容易分辨。
你所说的“疑似”和“去掉”是通过一整套rejection criteria完成，包括photon数，
拟合精度，spatial profile（比如，width，椭圆率等），等等。其实，在相当大的区
间内，这个criteria的设置对最终分布影响不大。

off switching是个随机过程，也就是说即使能做到>99%的单分子都分得很开，也没人
能100％保证没有挤成一团发光的分子。疑似来自多分子的光团需要在图像处理中去掉
。我不是做这个的，具体方法我也不清楚，不过从“疑似”和“去掉”两词，大家可以
细心体会这里面水有多深。

【在 p*l 的大作中提到】

: STED对激光有些特殊要求，不是总功率大就行了。
: STED造doughnut的方法，早Hell几十年就有人知道怎么做了，可是一直只是
: 做光学的人自娱自乐的一个小东西。Hell从骨子上是个物理学家，他自己造激
: 光可以，但是做optical enigineering 的底子差点，所以走了好多弯路才发现
: 做doughnut方法已经在那里了。如果是专做imaging system engineering
: 的人，可能第一时间就想到了。不过我自己觉得想法比工程实现重要的多。
: 想法好，目标明确，工程上的难题不管花多久总能解决的。现在回头看Hell成
: 名前的文章，杂七杂八试了好多不靠谱的工程方案，个中心酸，恐怕只有同行
: 能感觉得到。

a*52012-03-17 07:03

219 楼

目前还没人做in vivo。
目前的应用主要在1）fixed cell/tissue的multi-color immuno 和 2）culture cell
的live imaging。
1的应用可以很广泛，因为STORM虽然分辨率不如EM，但有很多EM无法完成的功能。2的
例子比如细胞骨架dynamics以及某种蛋白的动态tracking等等。
要做in vivo，挑战在于：PALM的纵身太小，<10microns, 以及sample drifting等等。

【在 m***o 的大作中提到】

: 天啦，这么多牛人。我是彻底看不懂这些了。
: 可是综合看来，如果我有一个蛋白，想看看in vivo 是否由于miss folding 而失活
: ，那肯定不行，对吗？但是，可以in vitro 看看。
: 主要是，这么fancy 的东西，到底cell bology 上有没有用。

s*e2012-03-17 07:03

220 楼

光是看蛋白的高分辨空间分布也非常重要啊。比如最近的这篇看Focal Adhesion蛋白空
间分布的:
P. Kanchanawong, G. Shtengel, A. Pasapera-Limon, E. Ramko, M.W. Davidson, H.
F. Hess, C. M. Waterman. “Nanoscale Architecutre of Integrin-based
Adhesions”, Nature, 468(7323): 580-4, 2010.
以及Sunny Xie和Xiaowei Zhuang看E.Coli nucleoid associated protein分布的:
Science 9 September 2011:
Vol. 333 no. 6048 pp. 1445-1449
DOI: 10.1126/science.1204697
Chromosome Organization by a Nucleoid-Associated Protein in Live Bacteria

【在 m***o 的大作中提到】

: 天啦，这么多牛人。我是彻底看不懂这些了。
: 可是综合看来，如果我有一个蛋白，想看看in vivo 是否由于miss folding 而失活
: ，那肯定不行，对吗？但是，可以in vitro 看看。
: 主要是，这么fancy 的东西，到底cell bology 上有没有用。

p*l2012-03-17 07:03

221 楼

这个Focal Adhesion的文章是用iPALM做的。这个iPALM装置，不是一般的变态。

H.

【在 s***e 的大作中提到】

: 光是看蛋白的高分辨空间分布也非常重要啊。比如最近的这篇看Focal Adhesion蛋白空
: 间分布的:
: P. Kanchanawong, G. Shtengel, A. Pasapera-Limon, E. Ramko, M.W. Davidson, H.
: F. Hess, C. M. Waterman. “Nanoscale Architecutre of Integrin-based
: Adhesions”, Nature, 468(7323): 580-4, 2010.
: 以及Sunny Xie和Xiaowei Zhuang看E.Coli nucleoid associated protein分布的:
: Science 9 September 2011:
: Vol. 333 no. 6048 pp. 1445-1449
: DOI: 10.1126/science.1204697
: Chromosome Organization by a Nucleoid-Associated Protein in Live Bacteria

h*g2012-03-17 07:03

222 楼

还是你说的比较靠谱

【在 f**u 的大作中提到】

: 我知道你说的这个方法，也记得庄好像用的不是这个。
: 庄的方法我记得是用比较弱的激发光，然后样品里面只有很小部分的荧光分子被激发，
: 从概率上来说两个相邻很紧的荧光分子被同时激发的可能性就很小了。
: 每个被激发的荧光分子会产生一个信号斑，然后她就认为这个斑的中心就是荧光分子所
: 在。
: 这个过程可以重复很多次，然后就可以得到很高的分辨率。
: 我印象里Janelia农场也有个人在做这个技术。
: 这个技术的缺点可能就是很慢，因为要扫很多次。

v*s2012-03-17 07:03

223 楼

这个penetration depth的问题按说解决之道并不难，上near-IR laser，利用up-
conversion或者two-photon就好了，不知道为啥还没有应用到in vivo。

cell

【在 a****5 的大作中提到】

: 目前还没人做in vivo。
: 目前的应用主要在1）fixed cell/tissue的multi-color immuno 和 2）culture cell
: 的live imaging。
: 1的应用可以很广泛，因为STORM虽然分辨率不如EM，但有很多EM无法完成的功能。2的
: 例子比如细胞骨架dynamics以及某种蛋白的动态tracking等等。
: 要做in vivo，挑战在于：PALM的纵身太小，<10microns, 以及sample drifting等等。

h*w2012-03-17 07:03

224 楼

为什么全场TPF不行。
倒是用time spatial lens 是个办法。搭一个试试啊

【在 v*****s 的大作中提到】

: 这个penetration depth的问题按说解决之道并不难，上near-IR laser，利用up-
: conversion或者two-photon就好了，不知道为啥还没有应用到in vivo。
:
: cell

v*s2012-03-17 07:03

225 楼

wide-field two-photon fluorescence？激光强度肯定不够吧。TPF是非线性效应，和
intensity square成正比，一般都要求聚焦的。
time-spatial lens是什么？

【在 h*w 的大作中提到】

: 为什么全场TPF不行。
: 倒是用time spatial lens 是个办法。搭一个试试啊

m*22012-03-17 07:03

226 楼

mark.
最近做一个相关的东西，正在学习。
有没有高手来说说庄小姐跟谢童鞋做的东西不同再哪里。。。
多谢

v*s2012-03-17 07:03

227 楼

庄jj作的东西前面说的都很清楚了吧，简单来说就是利用FL实现超分辨。
谢院士对Fluorescence和SERS需要用的label深恶痛绝，所以独辟蹊径，利用
stimulated emission在vibrational state上实现了label-free imaging，号称
stimulated Raman scattering microscopy，在stimulated emission下观测Raman信号
的减少来定位分子。因为这个信号减少量很小（10^-4），所以需要用AOM调制去噪。

【在 m******2 的大作中提到】

: mark.
: 最近做一个相关的东西，正在学习。
: 有没有高手来说说庄小姐跟谢童鞋做的东西不同再哪里。。。
: 多谢

a*q2012-03-17 07:03

228 楼

指的是Spatial-temporal focusing吧？
Confined activation and subdiffractive localization enables whole-cell PALM
with genetically expressed probes
Andrew G York, Alireza Ghitani, Alipasha Vaziri, Michael W Davidson &
Hari Shroff
Nature Methods 8, 327-333 doi:10.1038/nmeth.1571
跟SPIM结合也可以
Live-cell 3D super-resolution imaging in thick biological samples
Francesca Cella Zanacchi, Zeno Lavagnino, Michela Perrone Donnorso,
Alessio Del Bue, Laura Furia, + et al
Nature Methods 8, 1047-1049 doi:10.1038/nmeth.1744

【在 v*****s 的大作中提到】

: wide-field two-photon fluorescence？激光强度肯定不够吧。TPF是非线性效应，和
: intensity square成正比，一般都要求聚焦的。
: time-spatial lens是什么？

z*g2012-03-17 07:03

229 楼

咳！看来没人把STED原理讲清楚，我就简单说一下吧。
因为任何可见光发光点都有半波长衍射极限，所以光学分辨的理论极限是可见光下限
400nm的一半。
STED（stimulated emission depletion），中文可译为受激发射损耗。
STED的核心思想是，用一束光斑象面包圈(Donut)的、波长比激发光略长的激光将荧光
分子的受激荧光强制损耗掉。
也就是用Donut laser强行让激发态的电子回到基态(stimulated emission)，这个过程
也会发出荧光，但与正常跃迁的荧光波长不一样，可被过滤。
于是只剩下如一根针似的荧光，在XY平面上的分辨率就大大提高了，据称可以达到50nm
以下，但在Z方向的分辨率仍没有改善。
地狱先生（Stefan W. Hell）在读博的时候狂热于超分辨显微技术，1990年博士毕业之
后在家待业一年，发明了4Pi显微镜。然后大概在93年做第二个博后时，某天看光学物
理书，突发灵感，发明了STED，原理就是利用了光学中的受激发射跃迁(Stimulated
emission)。
娃娃鱼拼错了stimulated。simulate是模拟。
ahvy (生命不息)属于干扰信息，可忽略。
发信人: pll (娃娃鱼), 信区: Biology
标题: Re: 哪位能科普一下ZHUANG的单分子荧光
发信站: BBS 未名空间站 (Mon Mar 19 02:05:03 2012, 美东)
Hell的STED传承于爱因斯坦。
当年爱因斯坦预言了simulated emission effect，几十年后，人们靠特殊物质的
stimulated emission effect造出了激光，激光出现几十年后，Hell靠着强大的激光在
生物样品中做出了simulated emission effect，在这个effect的基础上实现了超分辨
成像。
爱因斯坦才是真正的牛人，特别敢想，而且只想不做实验，把实验都留给了别人做，造
就好几个实验诺奖。

z*g2012-03-17 07:03

230 楼

咳！看来没人把STED原理讲清楚，我就简单说一下吧。
因为任何可见光发光点都有半波长衍射极限，所以光学分辨的理论极限是可见光下限
400nm的一半。
STED（stimulated emission depletion），中文可译为受激发射损耗。
STED的核心思想是，用一束光斑象面包圈(Donut)的、波长比激发光略长的激光将荧光
分子的受激荧光强制损耗掉。
也就是用Donut laser强行让激发态的电子回到基态(stimulated emission)，这个过程
也会发出荧光，但与正常跃迁的荧光波长不一样，可被过滤。
于是只剩下如一根针似的荧光，在XY平面上的分辨率就大大提高了，据称可以达到50nm
以下，但在Z方向的分辨率仍没有改善。
地狱先生（Stefan W. Hell）在读博的时候狂热于超分辨显微技术，1990年博士毕业之
后在家待业一年，发明了4Pi显微镜。然后大概在93年做第
二个博后时，某天看光学物理书，突发灵感，发明了STED，原理就是利用了光学中的受
激发射跃迁(Stimulated emission)。
荧光分子的标记问题一直存在，但如果不标记就无法看见，TRP/TYR/PHE的荧光目前还
不能做为研究工具。
化学染料有细胞毒性，要load，会leak，会淬灭漂白。Genetically encoded
indicators (like GFP/CFP/YFP/RFP) has also photobleach problem.
娃娃鱼拼错了stimulated。simulate是模拟。
ahvy (生命不息)属于干扰信息，请无视。

i*g2012-03-17 07:03

231 楼

面带表情地飘过

a*q2012-03-17 07:03

232 楼

Z方向上的分辨率比xy方向差是单个显微镜物镜会聚光线的本质决定的。把STED和4Pi结
合起来就可以做到xyz一样的30nm分辨率，iPALM也是一样的道理。只是这样的仪器全世
界也没有几个人有本事搭起来还用得起来。

50nm

【在 z********g 的大作中提到】

: 咳！看来没人把STED原理讲清楚，我就简单说一下吧。
: 因为任何可见光发光点都有半波长衍射极限，所以光学分辨的理论极限是可见光下限
: 400nm的一半。
: STED（stimulated emission depletion），中文可译为受激发射损耗。
: STED的核心思想是，用一束光斑象面包圈(Donut)的、波长比激发光略长的激光将荧光
: 分子的受激荧光强制损耗掉。
: 也就是用Donut laser强行让激发态的电子回到基态(stimulated emission)，这个过程
: 也会发出荧光，但与正常跃迁的荧光波长不一样，可被过滤。
: 于是只剩下如一根针似的荧光，在XY平面上的分辨率就大大提高了，据称可以达到50nm
: 以下，但在Z方向的分辨率仍没有改善。

a*q2012-03-17 07:03

233 楼

http://www.lmg.embl.de/home.html
据说已经卖了不少了。你可以联系他们试试。

【在 f**u 的大作中提到】

: 能给个连接吗？Google了一下没查到。他是开了个公司吗？
: 另外这个玩艺儿如果买来了以后维护升级什么的怎么办？

l*u2012-03-17 07:03

234 楼

hahaha,
in german, "hell" means bright

50nm

【在 z********g 的大作中提到】

: 咳！看来没人把STED原理讲清楚，我就简单说一下吧。
: 因为任何可见光发光点都有半波长衍射极限，所以光学分辨的理论极限是可见光下限
: 400nm的一半。
: STED（stimulated emission depletion），中文可译为受激发射损耗。
: STED的核心思想是，用一束光斑象面包圈(Donut)的、波长比激发光略长的激光将荧光
: 分子的受激荧光强制损耗掉。
: 也就是用Donut laser强行让激发态的电子回到基态(stimulated emission)，这个过程
: 也会发出荧光，但与正常跃迁的荧光波长不一样，可被过滤。
: 于是只剩下如一根针似的荧光，在XY平面上的分辨率就大大提高了，据称可以达到50nm
: 以下，但在Z方向的分辨率仍没有改善。

l*u2012-03-17 07:03

235 楼

he has moved to Frankfurt.

【在 a*q 的大作中提到】

: http://www.lmg.embl.de/home.html
: 据说已经卖了不少了。你可以联系他们试试。

f*u2012-03-17 07:03

236 楼

多谢了

【在 a*q 的大作中提到】

: http://www.lmg.embl.de/home.html
: 据说已经卖了不少了。你可以联系他们试试。

f*u2012-03-17 07:03

237 楼

所以德国人最近改进了light sheet microscopy。
最初的型号样品是上下移动的，他们现在有人把样品做成旋转的，
这样估计能改进Z的分辨率。

【在 a*q 的大作中提到】

: Z方向上的分辨率比xy方向差是单个显微镜物镜会聚光线的本质决定的。把STED和4Pi结
: 合起来就可以做到xyz一样的30nm分辨率，iPALM也是一样的道理。只是这样的仪器全世
: 界也没有几个人有本事搭起来还用得起来。
:
: 50nm

p*u2012-03-17 07:03

238 楼

庄姑娘长得挺好看的。

techniques

【在 m***o 的大作中提到】

: 不是生物领域，感觉Harvard 庄晓薇的这个方向作的好牛。她真的能够看见单分子的
: in vivo 的运动吗？还有， Nucleic Acid - Protein Interactions？
: Single-Molecule biology:
: Nucleic Acid - Protein Interactions
: We explore single-molecule fluorescence imaging and spectroscopy techniques
: to study complex biomolecular systems.

a*y2012-03-17 07:03

239 楼

I only had time to input two sentences. I don't understand that why do you
want to pick on me?
Frankly, even for the information you mentioned below, they are not accurate:
for example
学分辨的理论极限是可见光下限: 400nm的一半 -wrong
You comments on fluorescent dyes are also superficial.
You can go back to look at my previous two sentences. I don;t know why you
commented that I was distrubing?

50nm

【在 z********g 的大作中提到】

: 咳！看来没人把STED原理讲清楚，我就简单说一下吧。
: 因为任何可见光发光点都有半波长衍射极限，所以光学分辨的理论极限是可见光下限
: 400nm的一半。
: STED（stimulated emission depletion），中文可译为受激发射损耗。
: STED的核心思想是，用一束光斑象面包圈(Donut)的、波长比激发光略长的激光将荧光
: 分子的受激荧光强制损耗掉。
: 也就是用Donut laser强行让激发态的电子回到基态(stimulated emission)，这个过程
: 也会发出荧光，但与正常跃迁的荧光波长不一样，可被过滤。
: 于是只剩下如一根针似的荧光，在XY平面上的分辨率就大大提高了，据称可以达到50nm
: 以下，但在Z方向的分辨率仍没有改善。

i*g2012-03-17 07:03

240 楼

庄长得一般吧，谢倒是算帅哥，看他年轻时的照片，秒杀很多ws生物男吧：
http://www.pkuschool.edu.cn/article-gzb.aspx?menuid=1290&tab=ta

庄姑娘长得挺好看的。
techniques

【在 p****u 的大作中提到】

: 庄姑娘长得挺好看的。
:
: techniques

s*s2012-03-17 07:03

241 楼

谢上次来做报告，头发梳得根根顺，秒杀99%生物wsn。靠在前台角落里
拿着ipad假装忙，我觉得一定是在偷偷打鸟

【在 i****g 的大作中提到】

: 庄长得一般吧，谢倒是算帅哥，看他年轻时的照片，秒杀很多ws生物男吧：
: http://www.pkuschool.edu.cn/article-gzb.aspx?menuid=1290&tab=ta
:
: 庄姑娘长得挺好看的。
: techniques

p*l2012-03-17 07:03

242 楼

STED的原理，在物理版讲可以只说一句，共振荧光抑制自发荧光，在生
物版讲，就得比较科普了。
Stimulated emission现象是爱因斯坦预言的。一个荧光分子，在被激发
后，会把能量辐射发出去。发出去的这个emission的波长一定是比激发光
长的。这个是能量守恒决定的。但是具体emission的波长，是有个几率分
布的。这个分布，就是荧光分子的emission spectrum，或者，准确的说，
是荧光分子的spontanouse emission spectrum。这里的spontanouse是
指，荧光分子的emission过程是自发的，没有任何外界调控。把荧光样
品在显微镜下照照片子，看到的都是spontanouse emission。
爱因斯坦预言，如果在激发一个荧光分子的同时，还加上一个很强的光场，
这个附加光的波长，恰好在spontanouse emission spectrum之内，那么
你可以把所用的emission通过共振都调制到这个附加光的波长上。这时候，
整个fluorescence emission成了一个单波长的stimulated emission，荧光
在别的波长上都没了。这个预言是完全是空对空纸面上推出来的，没有一
点实验证据。其背后的原因是，要观测到spontanouse emission，需要高
强度单波长光源来做附加的stimulating light。在那个没有激光只有灯泡的
年代，这个实验是很难做。
可是stimulated emission恰好是制造高强度单波长光源的极佳机理。stimulated
emission不但把所用荧光都集中到了一个波长，由于这是个
共振过程，stimulated emission下所有的荧光发射方向也是一样的。也就
是说，一旦实现强stimulated emission，你会得到一个频谱奇纯，方向性
奇佳，特别好聚焦的光源。要证明爱因斯坦预言的这个现象，实际上是要
把鸡和蛋一起做出来。实验的结果，就是人们造出了激光。
如果做反向思维，既然荧光都跑到stimulating light的波长去了，如果在别
的波长下观测荧光，岂不是就看不到荧光了，这个现像就是Stimulated emission
depletion(STED)。STED现象在物理界其实不是什么新闻。但是
把它用到生物成像上，是非常大胆。原因两个，一个是荧光细胞实在不是
做stimulated emission现象的好样品，现象非常弱。一般物理做这个实验，
用的都是很浓很纯而且不易bleaching的荧光物质。二是，stimulated
emission现象需要极大的瞬时光强，当年的激光技术做这个很勉强，另一
方面，很难相信这么大光强不会把样品烧糊了。Hell开始做STED的时候，
two photon刚刚出炉。生物样品对极短的高强度的光脉冲照射，耐受到底
怎样，是个很大的问号。如果Hell当年有点生物背景，估计就不会敢去做这件
事了。

h*w2012-03-17 07:03

243 楼

Eric 同学不是搞了个twophoton axion beam scanning imaging 吗，比lightsheet
cool。

C*e2012-03-17 07:03

244 楼

大概看了一下，不太明白“Cryo”体现在哪里
就我一点粗浅的hands-on experience
SAXS是非常非常tricky的
而且一般都是溶液里测
不知道如果要cryo该怎么测

X-ray crystallography,
cross-validate structural models.
structures of biological macromolecules
small peptides to huge

【在 l**********1 的大作中提到】

: 庄只是徐福炼丹给秦始皇炼那个长生不老丹吧?
: Xiaoliang Sunney Xie
: Raman Scattering is King Route to 单分子Raman scattering 光 (possible)
: 1)
: Single DNA molecule detection in an optical trap using surface-enhanced Raman scattering
: //apl.aip.org/resource/1/applab/v96/i21/p213701_s1
: Abstract:
: Raman spectra from single DNA molecules in their natural aqueous environment are presented. A DNA molecule that is anchored between two optically trapped dielectric beads is suspended in a solution with nanosized silver colloid particles. The nonspecific binding of the metal to the DNA enhances the Raman scattering that is excited by a near-infrared beam. A Raman spectrum is first recorded followed by a force-extension curve that verifies the presence of a single DNA molecule.
: 2)
: Tip-enhanced Raman spectroscopy of single RNA strands: towards a novel direct-sequencing method.

p*l2012-03-17 07:03

245 楼

所有的super resolution技术，基本思路其实是一样的：既然200nm以内的多
个发光分子无法分辨，我只要能控制这些分子，不让他们全发光就好了。PALM
和STORM用随机switch达到目的，算是比较精巧的法子。Hell的思路比较猛，走
纯物理，用STED来把分子搞得不发光了。所有的super resolution方法中，STED
是最麻烦的，也是唯一不需要任何后期图像处理的，所有的麻烦事都在物理和硬
件上。
一束激发光聚焦到样品上，最理想的情况下，光斑也会有200～300nm直径。通常情况下，整个光斑中的荧光分子都会发光，你说不清楚光是从这个斑里哪部分来的。Hell的想法是，如果让光斑外圈的分子变得不发光了，那么成像分辨率就提高了。做这个只要是非线性的效应就行了，Hell也做过其他方法，但是总的看，还是STED效应最合适。

【在 p*l 的大作中提到】

: STED的原理，在物理版讲可以只说一句，共振荧光抑制自发荧光，在生
: 物版讲，就得比较科普了。
: Stimulated emission现象是爱因斯坦预言的。一个荧光分子，在被激发
: 后，会把能量辐射发出去。发出去的这个emission的波长一定是比激发光
: 长的。这个是能量守恒决定的。但是具体emission的波长，是有个几率分
: 布的。这个分布，就是荧光分子的emission spectrum，或者，准确的说，
: 是荧光分子的spontanouse emission spectrum。这里的spontanouse是
: 指，荧光分子的emission过程是自发的，没有任何外界调控。把荧光样
: 品在显微镜下照照片子，看到的都是spontanouse emission。
: 爱因斯坦预言，如果在激发一个荧光分子的同时，还加上一个很强的光场，

f*u2012-03-17 07:03

246 楼

谢谢科普。这个讲的透彻。

【在 p*l 的大作中提到】

: STED的原理，在物理版讲可以只说一句，共振荧光抑制自发荧光，在生
: 物版讲，就得比较科普了。
: Stimulated emission现象是爱因斯坦预言的。一个荧光分子，在被激发
: 后，会把能量辐射发出去。发出去的这个emission的波长一定是比激发光
: 长的。这个是能量守恒决定的。但是具体emission的波长，是有个几率分
: 布的。这个分布，就是荧光分子的emission spectrum，或者，准确的说，
: 是荧光分子的spontanouse emission spectrum。这里的spontanouse是
: 指，荧光分子的emission过程是自发的，没有任何外界调控。把荧光样
: 品在显微镜下照照片子，看到的都是spontanouse emission。
: 爱因斯坦预言，如果在激发一个荧光分子的同时，还加上一个很强的光场，

B*G2012-03-17 07:03

247 楼

zadehzhong对你第一页上发言的评论没什么问题，你说Sunnyday说的是STED，这个说法
显然是错误的，Sunnyday的最初描述更接近庄的STORM。另外我也没看出zadehzhong关
于分辨率和荧光染色剂的说法有什么错误。这个版面上专业搞成像的人多得是，上面提
到的几个老板组里的人也有，不确定的发言还是要谨慎。

accurate:

【在 a**y 的大作中提到】

: I only had time to input two sentences. I don't understand that why do you
: want to pick on me?
: Frankly, even for the information you mentioned below, they are not accurate:
: for example
: 学分辨的理论极限是可见光下限: 400nm的一半 -wrong
: You comments on fluorescent dyes are also superficial.
: You can go back to look at my previous two sentences. I don;t know why you
: commented that I was distrubing?
:
: 50nm

a*y2012-03-17 07:03

248 楼

If you refer to 专业搞成像的人, I think I am one of them.
If you look close to Sunnyday's description, it is close to one of the near-
field optical spectroscopy.
I don't think his description is for PALM/STORM. PALM can not precisely
determine where the light is delivered (to tens of nm). Mathematical
processing is the trick. Many previous post has explained this.

【在 B*G 的大作中提到】

: zadehzhong对你第一页上发言的评论没什么问题，你说Sunnyday说的是STED，这个说法
: 显然是错误的，Sunnyday的最初描述更接近庄的STORM。另外我也没看出zadehzhong关
: 于分辨率和荧光染色剂的说法有什么错误。这个版面上专业搞成像的人多得是，上面提
: 到的几个老板组里的人也有，不确定的发言还是要谨慎。
:
: accurate:

z*62012-03-17 07:03

249 楼

建议把娃娃鱼大牛的科普加精，连我这个物理一塌糊涂的人都基本看懂了...

【在 p*l 的大作中提到】

: STED的原理，在物理版讲可以只说一句，共振荧光抑制自发荧光，在生
: 物版讲，就得比较科普了。
: Stimulated emission现象是爱因斯坦预言的。一个荧光分子，在被激发
: 后，会把能量辐射发出去。发出去的这个emission的波长一定是比激发光
: 长的。这个是能量守恒决定的。但是具体emission的波长，是有个几率分
: 布的。这个分布，就是荧光分子的emission spectrum，或者，准确的说，
: 是荧光分子的spontanouse emission spectrum。这里的spontanouse是
: 指，荧光分子的emission过程是自发的，没有任何外界调控。把荧光样
: 品在显微镜下照照片子，看到的都是spontanouse emission。
: 爱因斯坦预言，如果在激发一个荧光分子的同时，还加上一个很强的光场，

a*y2012-03-17 07:03

250 楼

I went back to read the first page. I didn't see the bottom post by Sunnyday
. I only saw his post on 定位激发 (the 3rd in the row). So I said it is STED.
By combing his posts, Sunnyday basically described a mixture of STED and
PALM/STORM/FPALM.

【在 B*G 的大作中提到】

: zadehzhong对你第一页上发言的评论没什么问题，你说Sunnyday说的是STED，这个说法
: 显然是错误的，Sunnyday的最初描述更接近庄的STORM。另外我也没看出zadehzhong关
: 于分辨率和荧光染色剂的说法有什么错误。这个版面上专业搞成像的人多得是，上面提
: 到的几个老板组里的人也有，不确定的发言还是要谨慎。
:
: accurate:

s*y2012-03-17 07:03

251 楼

啊，你们不要吵了。我其实当时就是随便挑了一种我知道的最简单的方法来
举个例子而已，其实和STORM或者STED或者PALM到底有没有关系我根本不知道
（这个好像我一早就自己先招认了）。呵呵。
我其实根本就不是搞光学的，只不过看大牛们都不出声，只好硬着头皮来
抛砖引玉一下。这个版上难得有这么棒的学术帖，我也从中学到了很多，
所以大家也别太挑剔双方的语言了。

h*s2012-03-17 07:03

252 楼

The idea was originally initiated by Steven Chu.

h*s2012-03-17 07:03

253 楼

Dynamic resolution is different from static resolution.

下，整个光斑中的荧光分子都会发光，你说不清楚光是从这个斑里哪部分来的。Hell的
想法是，如果让光斑外圈的分子变得不发光了，那么成像分辨率就提高了。做这个只要
是非线性的效应就行了，Hell也做过其他方法，但是总的看，还是STED效应最合适。

【在 p*l 的大作中提到】

: 所有的super resolution技术，基本思路其实是一样的：既然200nm以内的多
: 个发光分子无法分辨，我只要能控制这些分子，不让他们全发光就好了。PALM
: 和STORM用随机switch达到目的，算是比较精巧的法子。Hell的思路比较猛，走
: 纯物理，用STED来把分子搞得不发光了。所有的super resolution方法中，STED
: 是最麻烦的，也是唯一不需要任何后期图像处理的，所有的麻烦事都在物理和硬
: 件上。
: 一束激发光聚焦到样品上，最理想的情况下，光斑也会有200～300nm直径。通常情况下，整个光斑中的荧光分子都会发光，你说不清楚光是从这个斑里哪部分来的。Hell的想法是，如果让光斑外圈的分子变得不发光了，那么成像分辨率就提高了。做这个只要是非线性的效应就行了，Hell也做过其他方法，但是总的看，还是STED效应最合适。

z*g2012-03-17 07:03

254 楼

4Pi是用两个相对的物镜变相地把数值孔径变大了，其在Z轴上的分辨率在100nm左右。
而且两个直接相对、距离很近的物镜，把样品的厚度也限制了，大概在数十微米以下。
在此基础上加入STED，难度不是一般的大啊！
旋转样品的方法倒是不错，如果用油镜或水镜就麻烦了。
我知道 Yale 的年轻AP Dr. Joerg Bewersdorf，把STED与TIRF结合起来，这样可以把Z
轴的分辨率做到50nm以下。
这也是一种结合型的创新，但这种方法也受制于TIRF的局限，只能用于观察细胞表面的
活动，不能观察到细胞内部生物大分子的活动。
娃娃鱼同学给我们解释了很多光学物理的原理，让大伙受益非浅。
西瓜同学的解卷积想法很有启发。
学化学的同学，对于分子的概念很强。
学生物的同学，对于biological events很熟悉。
多来点学光学、学物理的同行，大家一起交流，共同进步。
第一页中，Sunnyday说的荧光强度呈现某种非线性分布（如高斯分布），可用数学或光
学方法进行过滤优化分辨率，但我怀疑这种处理可能不能使分辨率远小于200nm。专家
指点一下吧。
ahvy, don't take it personal.
如果你的专业跟你的表现一样强硬，为何要把第一页中你的前两条乱shoot的comments
删掉呢？可惜别人回复中还是能看到的。
年轻人，谦虚点! 无论你将来是在学术界还是工业界混，记得要先留意自己的破绽。等
你到了我这把年纪，就会知道越尖锐的东西越容易折断，除非你够硬。
我也不是行家，只希望能在交流中多学习成长。

发信人: sunnyday (飞鱼), 信区: Biology
标题: Re: 哪位能科普一下ZHUANG的单分子荧光
发信站: BBS 未名空间站 (Sun Mar 18 21:09:29 2012, 美东)
在我的理解里，一种最简单的方法，就是用机械的方式，把激光的激发头
对准某个点，对准的精度可以达到纳米。当然，激光对得再准，也有一个
发出的光的光斑问题，因为因为激光也是光，也有一个0.2um的问题，但是通过计算，
可以知道激光点的那个光斑里面的最高强度的峰的位置在哪里，然后再经过计算，就知
道应该是什么什么范围里面能受到最大的激发（这个范围就会远小于0.2um）。然后一
条线上扫描过去后，再经过计算，把那些因为是受到非光峰的
散光而被激发的点的信号给抹去，剩下的点大概应该就是精确的点了。

【在 f**u 的大作中提到】

: 所以德国人最近改进了light sheet microscopy。
: 最初的型号样品是上下移动的，他们现在有人把样品做成旋转的，
: 这样估计能改进Z的分辨率。

s*y2012-03-17 07:03

255 楼

我汗一下，看来是因为我引起的，所以我还是再澄清一下吧，
因为我本身其实不是做光学的，仅仅是用户而已，所以对那些原理的问题一向
都是一知半懂。我说的那个定点激发，其实是以前别人向我解释某某显微镜的
时候这么简单的告诉我的。
但是后来有人追着问我到底怎么个定点激发，我只好乱举了一种我知道的貌似
可以用的技术而已。正如后来的人指出的那样，我那个例子在机械上貌似
比较贴近STED或者near-field spec （需要准确定点然后进行扫描，所以
在这个角度上ahvy其实也不算说错了）, 但是在光学上又貌似不是（比方说
没有指出需要donut，所以在这个角度上你是对的)。但是我作为一个用户，
真的知道不了那么深（比方说那个donut），所以只是比较浅的谈了一个
理论上貌似可以的例子而已，我在原贴中一开头就指出了，必须由俺师姐
娃娃鱼说的为准。所以大家也别再为这个我信口扯出来的例子伤脑筋和伤和气了。
呵呵。
至于near-field spec，据说也是可以突破200um 的（貌似在探头那里
动些手脚就可以了？）。原理貌似和扫描电镜差不多。不过没有什么人用，
因为要把探头弄得和样品特别近才行，估计顶多勉勉强强能扫个表面或者
断面吧，可能不太适合大部分生物样品。

把Z

【在 z********g 的大作中提到】

: 4Pi是用两个相对的物镜变相地把数值孔径变大了，其在Z轴上的分辨率在100nm左右。
: 而且两个直接相对、距离很近的物镜，把样品的厚度也限制了，大概在数十微米以下。
: 在此基础上加入STED，难度不是一般的大啊！
: 旋转样品的方法倒是不错，如果用油镜或水镜就麻烦了。
: 我知道 Yale 的年轻AP Dr. Joerg Bewersdorf，把STED与TIRF结合起来，这样可以把Z
: 轴的分辨率做到50nm以下。
: 这也是一种结合型的创新，但这种方法也受制于TIRF的局限，只能用于观察细胞表面的
: 活动，不能观察到细胞内部生物大分子的活动。
: 娃娃鱼同学给我们解释了很多光学物理的原理，让大伙受益非浅。
: 西瓜同学的解卷积想法很有启发。

z*g2012-03-17 07:03

256 楼

门外汉瞎猜一下.
Cryo是不是指溶液样品滴到液氮里冻一下，就象Cryo-EM的样品前处理似的？
不知道现在的SAXS分辨率能到1nm，以前有个同学测，看到的蛋白结构就是个大概轮廓
，细节什么的都不清楚，还不如做电镜呢。现在膜蛋白的Cryo-EM也有办法做了。

【在 C*******e 的大作中提到】

: 大概看了一下，不太明白“Cryo”体现在哪里
: 就我一点粗浅的hands-on experience
: SAXS是非常非常tricky的
: 而且一般都是溶液里测
: 不知道如果要cryo该怎么测
:
: X-ray crystallography,
: cross-validate structural models.
: structures of biological macromolecules
: small peptides to huge

l*12012-03-17 07:03

257 楼

Please refer figure:
cited from PDF document of EMBL and ESRF Geneva/Grenoble
link:
//erl.chess.cornell.edu/gatherings/2011_Workshops/talks/WS2Svergun.pdf

【在 z********g 的大作中提到】

: 门外汉瞎猜一下.
: Cryo是不是指溶液样品滴到液氮里冻一下，就象Cryo-EM的样品前处理似的？
: 不知道现在的SAXS分辨率能到1nm，以前有个同学测，看到的蛋白结构就是个大概轮廓
: ，细节什么的都不清楚，还不如做电镜呢。现在膜蛋白的Cryo-EM也有办法做了。

l*12012-03-17 07:03

258 楼

if without Cryo then do solution SAXS below 1.0 nm scale that particle
signal might be read as wave
signal, then your CNS or N sub manuscript wrote that your group got a new
structure might belong to Wave patterns?
德布罗意
主条目：德布罗意波
1924年，路易·德布罗意构造了德布罗意假说，声称所有的物质都有类波的属性。他将
这个波长λ和动量p联系为：
这是对爱因斯坦等式的一般化，因为光子的动量为p = E / c（c为真空中的光速），而
λ = c / ν。
德布罗意的方程三年后通过两个独立的电子散射实验被证实于电子（具有静止质量）身
上。在阿伯丁大学，乔治·佩吉特·汤姆孙将一束电子穿过薄金属片，并且观察到了预
期中的干涉样式。在贝尔实验室，克林頓·戴維森和雷斯特·革末将他们的实验电子束
穿过一个晶体。
德布罗意于1929年因为这个假设获得了诺贝尔物理学奖。汤姆孙和戴維森因为他们的实
验工作共享了1937年诺贝尔物理学奖。
//zh.wikipedia.org/wiki/波粒二象性
Ps:
//www.emeraldbiosystems.com/blog/author/Peter-Nollert.aspx
Crystal structure of small protein crambin at 0.48 Å resolution
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21505232

【在 C*******e 的大作中提到】

: 大概看了一下，不太明白“Cryo”体现在哪里
: 就我一点粗浅的hands-on experience
: SAXS是非常非常tricky的
: 而且一般都是溶液里测
: 不知道如果要cryo该怎么测
:
: X-ray crystallography,
: cross-validate structural models.
: structures of biological macromolecules
: small peptides to huge

C*e2012-03-17 07:03

259 楼

不可能冻一下再测的
因为是溶液
要给注射到一个固定的小cell里
只有十几到二十微升
这个小cell还要反复用
而且如果要cryo的话就要解决有冰的问题
就要加cryo protactant
所谓分辨率达到1nm我觉得是个极限
应该还是有别的补充信息才行
我看到的SAXS做出来的也就是个轮廓
没有细节
而且SAXS的数据处理非常tricky
另外做shape reconstruction的时候同样的数据，
输入的对称性不一样
会产生完全不同的模型

【在 z********g 的大作中提到】

: 门外汉瞎猜一下.
: Cryo是不是指溶液样品滴到液氮里冻一下，就象Cryo-EM的样品前处理似的？
: 不知道现在的SAXS分辨率能到1nm，以前有个同学测，看到的蛋白结构就是个大概轮廓
: ，细节什么的都不清楚，还不如做电镜呢。现在膜蛋白的Cryo-EM也有办法做了。

C*e2012-03-17 07:03

260 楼

回头再详细拜读一下
如果真有cryo条件下做SAXS那学习了！
上面贴的那个图很有意思
所谓1 nm的分辨率是在q^-1 6－8 nm左右的地方
而做过 SAXS的人都知道SAXS数据最最重要最最有价值的是在q^-1 0-0.1 (A^-1)的这个区间
也就是10 nm分辨率
当然这个区间重要不代表q^-1 0.1以上都不重要
不过很多fix distance beam line测量的区间在0－0.3 A^1 (0-3 nm^-1)
我个人感觉SAXS这个领域还在方法、工具建立的阶段

new

【在 l**********1 的大作中提到】

: if without Cryo then do solution SAXS below 1.0 nm scale that particle
: signal might be read as wave
: signal, then your CNS or N sub manuscript wrote that your group got a new
: structure might belong to Wave patterns?
: 德布罗意
: 主条目：德布罗意波
: 1924年，路易·德布罗意构造了德布罗意假说，声称所有的物质都有类波的属性。他将
: 这个波长λ和动量p联系为：
: 这是对爱因斯坦等式的一般化，因为光子的动量为p = E / c（c为真空中的光速），而
: λ = c / ν。

l*12012-03-17 07:03

261 楼

STORM 10nm is tricker for living imaging now
so SAXS optimized Beamline even world only had three or four : Geneva/Kobe/
Stanford/Jia-Ding Shanghai
then is better than STORM iPALM etc for 10nm scale living structure discovery.

个区间

【在 C*******e 的大作中提到】

: 回头再详细拜读一下
: 如果真有cryo条件下做SAXS那学习了！
: 上面贴的那个图很有意思
: 所谓1 nm的分辨率是在q^-1 6－8 nm左右的地方
: 而做过 SAXS的人都知道SAXS数据最最重要最最有价值的是在q^-1 0-0.1 (A^-1)的这个区间
: 也就是10 nm分辨率
: 当然这个区间重要不代表q^-1 0.1以上都不重要
: 不过很多fix distance beam line测量的区间在0－0.3 A^1 (0-3 nm^-1)
: 我个人感觉SAXS这个领域还在方法、工具建立的阶段
:

C*e2012-03-17 07:03

262 楼

SAXS可以做“living structure”的么？
学习了
你指的是切片->微结构，还是蛋白、蛋白/核酸复合物？

discovery.

【在 l**********1 的大作中提到】

: STORM 10nm is tricker for living imaging now
: so SAXS optimized Beamline even world only had three or four : Geneva/Kobe/
: Stanford/Jia-Ding Shanghai
: then is better than STORM iPALM etc for 10nm scale living structure discovery.
:
: 个区间

i*g2012-03-17 07:03

263 楼

行家趁此机会再科普一下Sunney Xie的工作吧～～

不是生物领域，感觉Harvard 庄晓薇的这个方向作的好牛。她真的能够看见单分子的
in vivo 的运动吗？还有， Nucleic Acid - Protein Interactions？
Single-Molecule biology:
Nucleic Acid - Protein Interactions
We explore single-molecule fluorescence imaging and spectroscopy techniques
to study complex biomolecular systems.

【在 m***o 的大作中提到】

: 不是生物领域，感觉Harvard 庄晓薇的这个方向作的好牛。她真的能够看见单分子的
: in vivo 的运动吗？还有， Nucleic Acid - Protein Interactions？
: Single-Molecule biology:
: Nucleic Acid - Protein Interactions
: We explore single-molecule fluorescence imaging and spectroscopy techniques
: to study complex biomolecular systems.

s*y2012-03-17 07:03

264 楼

这几个技术是针对不同的场合的吧？
SAXS貌似是针对纯化了的蛋白溶液，需要对有序的样品进行叠加运算之后
倒推出结构。在我的理解中类似于一个不需要结晶的x-ray解构技术，
这个在近期内貌似没有任何希望能够用到细胞上吧？
如果要说细胞结构的话，冷冻电镜用的是类似的思路（对有序的样品进行
叠加运算），但是可以用到细胞上。
但是不管是冷冻电镜还是SAXS, 都有这个需要对象结构有序的前提，否则
就无从下手解结构了。所以在这个意义上，这两个技术和STORM/PALM/STED
是针对于不同的应用的，不太适合厚此薄彼吧。

discovery.

【在 l**********1 的大作中提到】

: STORM 10nm is tricker for living imaging now
: so SAXS optimized Beamline even world only had three or four : Geneva/Kobe/
: Stanford/Jia-Ding Shanghai
: then is better than STORM iPALM etc for 10nm scale living structure discovery.
:
: 个区间

a*q2012-03-17 07:03

265 楼

另一个关键的区别在于SAXS和冷冻电镜都需要纯化的样品。如果电镜在细胞里面的话，
至少需要能够从形貌上分辨出要看什么分子。大的结构比如说核糖体、微管可以认出来
，如果随便挑一个分子就很难说了，一大堆长的差不多的。荧光的方法就不一样，信号
的来源是知道的。
当然就分辨率而言，荧光还是比不过电镜，毕竟波长的区别在那里。

【在 s******y 的大作中提到】

: 这几个技术是针对不同的场合的吧？
: SAXS貌似是针对纯化了的蛋白溶液，需要对有序的样品进行叠加运算之后
: 倒推出结构。在我的理解中类似于一个不需要结晶的x-ray解构技术，
: 这个在近期内貌似没有任何希望能够用到细胞上吧？
: 如果要说细胞结构的话，冷冻电镜用的是类似的思路（对有序的样品进行
: 叠加运算），但是可以用到细胞上。
: 但是不管是冷冻电镜还是SAXS, 都有这个需要对象结构有序的前提，否则
: 就无从下手解结构了。所以在这个意义上，这两个技术和STORM/PALM/STED
: 是针对于不同的应用的，不太适合厚此薄彼吧。
:

s*y2012-03-17 07:03

266 楼

我汗一下，我没有弄明白你在问什么问题。。。

on

【在 l**********1 的大作中提到】

: STORM Stochastic not deterministic
: even Zhuang her SHI-XIONG/SHI-DI Taekjip Ha now want to try other ways:
: //physics.illinois.edu/people/profile.asp?tjha
: //zhuang.harvard.edu/pi.html
: please refer:
: In the field of microscopy development there was again a strong emphasis on
: high resolution techniques (Hess, Sauer, Hell) and on combined microscopy
: techniques to manipulate the sample for example with an AFM or optical
: tweezers under optical inspection (Taekjip Ha, Jan Vogelsang, Gopal
: Balasubramanian)

C*e2012-03-17 07:03

267 楼

我的理解也是这样

【在 s******y 的大作中提到】

: 这几个技术是针对不同的场合的吧？
: SAXS貌似是针对纯化了的蛋白溶液，需要对有序的样品进行叠加运算之后
: 倒推出结构。在我的理解中类似于一个不需要结晶的x-ray解构技术，
: 这个在近期内貌似没有任何希望能够用到细胞上吧？
: 如果要说细胞结构的话，冷冻电镜用的是类似的思路（对有序的样品进行
: 叠加运算），但是可以用到细胞上。
: 但是不管是冷冻电镜还是SAXS, 都有这个需要对象结构有序的前提，否则
: 就无从下手解结构了。所以在这个意义上，这两个技术和STORM/PALM/STED
: 是针对于不同的应用的，不太适合厚此薄彼吧。
:

a*q2012-03-17 07:03

268 楼

STORM每一帧的采样是Stochastic的，但是最后很多帧的数据加起来得到的图像是完全
Deterministic的，因为是由样品里面的所有荧光标记的位置决定的，所以没有什么问
题啊。
Taekjip Ha做的AFM以及Optical Tweezer跟我们讨论的光学显微完全不是一回事。一个是跟
SAXS一样做提纯分子的研究的，一个是做细胞成像的，而且Taekjip Ha现在也在做
PALM/STORM。

ways:
emphasis
on
microscopy

【在 l**********1 的大作中提到】

: STORM Stochastic not deterministic
: even Zhuang her SHI-XIONG/SHI-DI Taekjip Ha now want to try other ways:
: //physics.illinois.edu/people/profile.asp?tjha
: //zhuang.harvard.edu/pi.html
: please refer:
: In the field of microscopy development there was again a strong emphasis on
: high resolution techniques (Hess, Sauer, Hell) and on combined microscopy
: techniques to manipulate the sample for example with an AFM or optical
: tweezers under optical inspection (Taekjip Ha, Jan Vogelsang, Gopal
: Balasubramanian)

s*y2012-03-17 07:03

269 楼

我倒。。。我还是没有理解你的问题。
你是试图在说STORM microscopy的逻辑思路不对么？
还是说super resolution microscopy不能用于某些科研场合？
如果是前者，其实那个仪器的逻辑是没有问题的。因为需要成像的对象
要么就是用抗体特异的标记了(STORM)，要么就是用荧光蛋白融合表达了(PALM)。
所以仅仅是瞬时成像的时候被激发的荧光点有随机性而已，但是总体对象是
不随机的，所以叠加起来之后应该就是一个总体的图了。
如果你是说后者，那么谁也没有指望光学显微镜能够什么问题都能回答呀，
仅仅对于某些特定样品特定用途有用而已。

microscopy的

【在 l**********1 的大作中提到】

: STORM Stochastic
: is similar to below soft used in Stochastic Population Genetics:
: LAMARC - Likelihood Analysis with Metropolis Algorithm using Random
: Coalescence
: //evolution.genetics.washington.edu/lamarc/index.html
: 俄罗斯外高加索人的百岁长寿因子的发掘的话不会用这类super resolution microscopy的
: relative papers:
: 1)
: /www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16618935
: 2)

z*g2012-03-17 07:03

270 楼

如果STORM必须拍很多照片，然后进行图像处理才能得到高分辨的图像，是不是意味着
STORM不能监测动态过程？它的时间分辨常数又是在什么量级上？
对于生物样品（如蛋白二维晶体或密集表达的膜蛋白），AFM能在XY平面做出分辨率达
到1nm的表面形貌图像(topography)，Z方向的分辨率理论上能达到0.1nm，但要在较硬
表面（如半体导样品）。AFM除能成像之外，还能做力谱，这是它独特的地方，很多实
验室用它来做蛋白的折叠与去折叠。
Optical tweezer是另一做力谱的方法。做线性分子较多，如DNA与蛋白相互作用，mRNA
转录等。

个是跟

【在 a*q 的大作中提到】

: STORM每一帧的采样是Stochastic的，但是最后很多帧的数据加起来得到的图像是完全
: Deterministic的，因为是由样品里面的所有荧光标记的位置决定的，所以没有什么问
: 题啊。
: Taekjip Ha做的AFM以及Optical Tweezer跟我们讨论的光学显微完全不是一回事。一个是跟
: SAXS一样做提纯分子的研究的，一个是做细胞成像的，而且Taekjip Ha现在也在做
: PALM/STORM。
:
: ways:
: emphasis
: on

z*g2012-03-17 07:03

271 楼

抛砖引玉先。
十年前听过Sunney Xie的报告，讲近场拉曼成像，就是CARS。不久前的年会上，他又讲
了最新的进展，已经能做到实时成像了，能看到血红细胞在血管里的流动，能区分皮肤
表面组织的大致成分，还能区分出动物脑中的癌变部位。主要是用拉曼谱的两个波长，
lipid 2845 cm-1, protein 2950 cm-1.
我的粗浅理解是，只要能得到可解析的信噪比，成像就是激光扫描和后续处理的事了，
至于精度可能不能要求太高，但贵在不用标记，完全Non-invasive。只是近场拉曼成像
，要求样品紧贴物镜，对于其应用稍有限制，或许将来可以用手持式光纤的方法直接用
到临床，这样手术中主刀医生就不用等病理切片的结果出来就可以判断哪些是病变组织
需要切除的。
听过钱永健的一次报告，他是做GFP起家的，所以他的方法是用免疫或转基因的方法将
癌变组织标记上荧光，这样医生直接切除有荧光的组织即可。
Sunney Xie是实验方法创新的大牛。对于研究工具与研究方法的改进和创新，是中国学
术界需要大力改进思维定势的地方，老是用已商业化的机器，只能跟在别人后面跑，做
不到最前沿。
其他同学再介绍下Xie的其它方面的工作吧。

techniques

【在 i****g 的大作中提到】

: 行家趁此机会再科普一下Sunney Xie的工作吧～～
:
: 不是生物领域，感觉Harvard 庄晓薇的这个方向作的好牛。她真的能够看见单分子的
: in vivo 的运动吗？还有， Nucleic Acid - Protein Interactions？
: Single-Molecule biology:
: Nucleic Acid - Protein Interactions
: We explore single-molecule fluorescence imaging and spectroscopy techniques
: to study complex biomolecular systems.

a*q2012-03-17 07:03

272 楼

动态过程还是可以的，时间分辨常数大概在几秒到几十秒量级，跟具体实验参数还有要
看什么东西有关，已经有好几篇文章讲这个的。这方面确实比不上SIM；如果要看的东
西小的话，也比不上STED，不过Commercial的STED太不争气了。
关于AFM，可以参考Toshio Ando的High-speed AFM：
http://www.s.kanazawa-u.ac.jp/phys/biophys/index.htm
很有意思的，蛋白质构象变化，马达蛋白的运动都可以直接录像了。

mRNA

【在 z********g 的大作中提到】

: 如果STORM必须拍很多照片，然后进行图像处理才能得到高分辨的图像，是不是意味着
: STORM不能监测动态过程？它的时间分辨常数又是在什么量级上？
: 对于生物样品（如蛋白二维晶体或密集表达的膜蛋白），AFM能在XY平面做出分辨率达
: 到1nm的表面形貌图像(topography)，Z方向的分辨率理论上能达到0.1nm，但要在较硬
: 表面（如半体导样品）。AFM除能成像之外，还能做力谱，这是它独特的地方，很多实
: 验室用它来做蛋白的折叠与去折叠。
: Optical tweezer是另一做力谱的方法。做线性分子较多，如DNA与蛋白相互作用，mRNA
: 转录等。
:
: 个是跟

a*q2012-03-17 07:03

273 楼

CARS的好处确实是不用标记，在临床上最大用处我想应该是做内窥镜和noninvasive的病理学分析；
缺点是灵敏度和特异性不如荧光，所以在细胞生物学上的应用有限，比如做脂肪代谢（谢晓亮发了这方
面的文章的）。

【在 z********g 的大作中提到】

: 抛砖引玉先。
: 十年前听过Sunney Xie的报告，讲近场拉曼成像，就是CARS。不久前的年会上，他又讲
: 了最新的进展，已经能做到实时成像了，能看到血红细胞在血管里的流动，能区分皮肤
: 表面组织的大致成分，还能区分出动物脑中的癌变部位。主要是用拉曼谱的两个波长，
: lipid 2845 cm-1, protein 2950 cm-1.
: 我的粗浅理解是，只要能得到可解析的信噪比，成像就是激光扫描和后续处理的事了，
: 至于精度可能不能要求太高，但贵在不用标记，完全Non-invasive。只是近场拉曼成像
: ，要求样品紧贴物镜，对于其应用稍有限制，或许将来可以用手持式光纤的方法直接用
: 到临床，这样手术中主刀医生就不用等病理切片的结果出来就可以判断哪些是病变组织
: 需要切除的。

t*n2012-03-17 07:03

274 楼

Thanks a lot for explaining...

照，成像的分辨率差没关系，只要信号足够亮，定位精确度可以比成像分辨率高很多。
打个比方，我和个朋友约个地方碰头，出门忘了带眼镜，看啥都不太清楚，不过运气好
，碰头的地方就只一个人站在那里，不是我那朋友会是谁。如果运气不好，碰头的地方
人山人海，就找不着人在哪了。
，但是如果事先知道这肯定是个单分子，那么这个模糊光团的中心肯定是这个分子的位
置。这个中心定位的准确性，决定于我拍到的光团的亮度，越亮的光团，中心定位越准
。但是，如果我事先不知道这个光团是从一个单分子来的，这个光团其实是有可能从两
个甚至更多的单分子来的，可能分子之间间距很小，在图像上糊成了一团。那么光团的
中心即使找到了，也没什么意义。也就是说，这种超分辨定位方法，只在每个单分子之
间的间距大于200nm的时候才有用。
位的方法很简单，可是没法直接用在生物成像上。PALM和STORM的创新在于，找到了方
法，能随机把荧光分子来来回回在不发光的状态和发光状态之间调制。每次曝光之前，
他们把大多数分子调到off state，只留下少数分子发光。这样处理之后，就能大体满
足图像内全是互相分得很开的单分子。拍成的图像可以用来精确定位每个分子。因为一
张图像，只是看见了很小一部分散立的分子，要看见样品的全貌，PALM 和STROM必须反
复对样品分子的调制操作，每次曝光只随机观测很少�: 徊糠址肿樱詈蟀鸭甘
踔辽习僬啪范ㄎ坏牡シ肿油嫉悠鹄矗铣勺詈蟮耐枷瘛�
off switching是个随机过程，也就是说即使能做到>99%的单分子都分得很开，也没人
能100％保证没有挤成一团发光的分子。疑似来自多分子的光团需要在图像处理中去掉
。我不是做这个的，具体方法我也不清楚，不过从“疑似”和“去掉”两词，大家可以
细心体会这里面水有多深。

【在 p*l 的大作中提到】

: 庄的STORM和Betzig的PALM，基本原理一样。一句话说，如果你是在独立的单分子拍照，成像的分辨率差没关系，只要信号足够亮，定位精确度可以比成像分辨率高很多。打个比方，我和个朋友约个地方碰头，出门忘了带眼镜，看啥都不太清楚，不过运气好，碰头的地方就只一个人站在那里，不是我那朋友会是谁。如果运气不好，碰头的地方人山人海，就找不着人在哪了。
: 显微镜的光学分辨极限是200nm,，一个单分子会成像成一个约200nm直径的模糊光团，但是如果事先知道这肯定是个单分子，那么这个模糊光团的中心肯定是这个分子的位置。这个中心定位的准确性，决定于我拍到的光团的亮度，越亮的光团，中心定位越准。但是，如果我事先不知道这个光团是从一个单分子来的，这个光团其实是有可能从两个甚至更多的单分子来的，可能分子之间间距很小，在图像上糊成了一团。那么光团的中心即使找到了，也没什么意义。也就是说，这种超分辨定位方法，只在每个单分子之间的间距大于200nm的时候才有用。
: 一个荧光的细胞，上帝都没法保证这里面每个荧光分子间距足够开，所以尽管这个定位的方法很简单，可是没法直接用在生物成像上。PALM和STORM的创新在于，找到了方法，能随机把荧光分子来来回回在不发光的状态和发光状态之间调制。每次曝光之前，他们把大多数分子调到off state，只留下少数分子发光。这样处理之后，就能大体满足图像内全是互相分得很开的单分子。拍成的图像可以用来精确定位每个分子。因为一张图像，只是看见了很小一部分散立的分子，要看见样品的全貌，PALM 和STROM必须反复对样品分子的调制操作，每次曝光只随机观测很少一部分分子，最后把几十甚至上百张精确定位的单分子图叠加起来，合成最后的图像。
: PALM和STORM比较关键的地方，在于怎么保证所有的信号都是从独立单分子来的。on-off switching是个随机过程，也就是说即使能做到>99%的单分子都分得很开，也没人能100％保证没有挤成一团发光的分子。疑似来自多分子的光团需要在图像处理中去掉。我不是做这个的，具体方法我也不清楚，不过从“疑似”和“去掉”两词，大家可以细心体会这里面水有多深。
:
: pioneered

p*l2012-03-17 07:03

275 楼

呵呵！我听说国内有地方也买了leica的STED。一般买这种第一代的大型仪器，都是当
冤大头的命。
STED需要接近完美的alignment。就算是做光学的，要搭个STED出来也不是容易的事，
基本所有想自己搭STED的人，如果不是Hell的嫡系，折腾来折腾去都得找Hell讨教秘方。

【在 a*q 的大作中提到】

: 动态过程还是可以的，时间分辨常数大概在几秒到几十秒量级，跟具体实验参数还有要
: 看什么东西有关，已经有好几篇文章讲这个的。这方面确实比不上SIM；如果要看的东
: 西小的话，也比不上STED，不过Commercial的STED太不争气了。
: 关于AFM，可以参考Toshio Ando的High-speed AFM：
: http://www.s.kanazawa-u.ac.jp/phys/biophys/index.htm
: 很有意思的，蛋白质构象变化，马达蛋白的运动都可以直接录像了。
:
: mRNA

a*q2012-03-17 07:03

276 楼

就我所知道的谢晓亮的工作，特别早期的时候（94、95年左右）是用近场光学显微镜做
单分子检测，算是单分子荧光检测这一行最早的一批人。当年他跟Eric Betzig是直接
竞争对手，不过两个人现在都不做这个了。其实他到Harvard之后还做过一阵近场显微
镜，想看光合作用那些蛋白质的空间分布，后来放弃了，然后STORM之类的方法就出来
了。
96、97年前后开始做单分子酶学，就是用跟踪分析单个酶分子的反应过程。一大发现是
同一个酶分子的活性随时间在不断变化。这个方向做了几乎有10年，文章无数。
差不多那个时候开始的还有CARS，一直到现在都在做，前面都讨论过了。最近一个大的
突破是SRS，08年发的。其实这已经不是CARS了，光谱有很大的不同。SRS看的是由于拉
曼散射造成一束激光的能量被转移到另一束激光，这需要检测到激光能量的微小
变化，但最终灵敏度比CARS高很多。用跟SRS同样的手段还可以对有吸收但是不发荧光
的东西成像（比方说血红素）。
在Harvard开始的方向是在单细胞+单分子水平上观察细菌基因的表达和调控，主要是分
析Transcription和Translation的随机性。有一个结果特别有意思，就是在大肠杆菌里
面，任何一个时刻mRNA的copy number和对应蛋白质的copy number完全没有任何相关性
。这个方向成就了好几个现在转做系统生物学的人。
以上描述不见得完全准确，而且其它还有一些小的方向或者不太成功的方向，就不一一
列出来了。现在还有一个新方向是DNA测序。至于他们组里面还有没有未公开的秘密新
方向，我当然无从得知。

【在 z********g 的大作中提到】

: 抛砖引玉先。
: 十年前听过Sunney Xie的报告，讲近场拉曼成像，就是CARS。不久前的年会上，他又讲
: 了最新的进展，已经能做到实时成像了，能看到血红细胞在血管里的流动，能区分皮肤
: 表面组织的大致成分，还能区分出动物脑中的癌变部位。主要是用拉曼谱的两个波长，
: lipid 2845 cm-1, protein 2950 cm-1.
: 我的粗浅理解是，只要能得到可解析的信噪比，成像就是激光扫描和后续处理的事了，
: 至于精度可能不能要求太高，但贵在不用标记，完全Non-invasive。只是近场拉曼成像
: ，要求样品紧贴物镜，对于其应用稍有限制，或许将来可以用手持式光纤的方法直接用
: 到临床，这样手术中主刀医生就不用等病理切片的结果出来就可以判断哪些是病变组织
: 需要切除的。

l*12012-03-17 07:03

277 楼

11th♂的细菌膜蛋白
>时间分辨常数大概在几秒到几十秒量级
那就是说细菌膜蛋白的铁离子通道如果变化短于几秒 STORM无用武之地了吧?
打个比方用照相机拍刘翔百米跨栏的细节想找到技术弱点如可能改进后伦敦奥运夺金牌
用傻瓜机的话是南柯一梦吧还得用D700 or MARKII 5D 吧
用电显的电子波长看不明白膜蛋白分子上的亚原子级别的实时动态变化的话
现实要看小于1.0 nm 的话
只有用 ESRF etc Synchrotron Radiation X-ray beam line
Freire F, Romão MJ, Macedo AL, Aveiro SS, Goodfellow BJ, Carvalho AL.
Preliminary structural characterization of human SOUL, a haem-binding protein.
Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 2009 Jul 1;65(Pt 7):723-
Abstract
Human SOUL (hSOUL) is a 23 kDa haem-binding protein that was first identified as the PP(23) protein
isolated from human full-term placentas. Here, the overexpression, purification and crystallization of
hSOUL are reported. The crystals belonged to space group P6(4)22, with unit-cell parameters a = b = 145,
c = 60 A and one protein molecule in the asymmetric unit. X-ray diffraction data were collected to 3.5 A
resolution at the ESRF
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19574650
------
or
Structure of the Lassa virus nucleoprotein revealed by X-ray crystallography, small-angle X-ray scattering,
and electron microscopy.
J Biol Chem. 2011 Nov 4;286(44):38748-
>Abstract
The nucleoprotein (NP) of Lassa virus (LASV) strain AV was expressed in a recombinant baculovirus system.
The crystal structure of full-length NP was solved at a resolution of 2.45 Å. The overall fold corresponds to
that of NP of LASV strain Josiah (Qi, X., Lan, S., Wang, W., Schelde, L. M., Dong, H., Wallat, G. D., Ly, H.,
Liang, Y., and Dong, C. (2010) Nature 468, 779-783) with a root mean square deviation of 0.67 Å for all
atoms (6.3% difference in primary sequence).
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21917929
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22286384
汉堡大学的
Virologist:
//www15.bni-hamburg.de/bni/bni2/neu2/getfile.acgi?area_engl=researchgroups&pid=21234
Molecular/Biochem expert
//www.chemie.uni-hamburg.de/bc/betzel/mitarbeiter/Perbandt_e.html
//www.lexi-sdi.de/index.php?id=106
Instrument analysis expert:
//www.chemie.uni-hamburg.de/bc/betzel/mitarbeiter/index.html
三剑客组合啊
[回复]
[ 117 ]
发信人: abq (NM), 信区: Biology
标题: Re: 哪位能科普一下ZHUANG的单分子荧光
发信站: BBS 未名空间站 (Thu Mar 22 00:16:11 2012, 美东)
动态过程还是可以的，时间分辨常数大概在几秒到几十秒量级，跟具体实验参数还有要
看什么东西有关，已经有好几篇文章讲这个的。这方面确实比不上SIM；如果要看的东
西小的话，也比不上STED，不过Commercial的STED太不争气了。

【在 s******y 的大作中提到】

: 我倒。。。我还是没有理解你的问题。
: 你是试图在说STORM microscopy的逻辑思路不对么？
: 还是说super resolution microscopy不能用于某些科研场合？
: 如果是前者，其实那个仪器的逻辑是没有问题的。因为需要成像的对象
: 要么就是用抗体特异的标记了(STORM)，要么就是用荧光蛋白融合表达了(PALM)。
: 所以仅仅是瞬时成像的时候被激发的荧光点有随机性而已，但是总体对象是
: 不随机的，所以叠加起来之后应该就是一个总体的图了。
: 如果你是说后者，那么谁也没有指望光学显微镜能够什么问题都能回答呀，
: 仅仅对于某些特定样品特定用途有用而已。
:

i*g2012-03-17 07:03

278 楼

介绍的很全面，谢涵盖的方向还真广。他最突出的贡献还是发明CARS和SRS吧？

就我所知道的谢晓亮的工作，特别早期的时候（94、95年左右）是用近场光学显微镜做
单分子检测，算是单分子荧光检测这一行最早的一批人。当年他跟Eric Betzig是直接
竞争对手，不过两个人现在都不做这个了。其实他到Harvard之后还做过一阵近场显微
镜，想看光合作用那些蛋白质的空间分布，后来放弃了，然后STORM之类的方法就出来
了。
96、97年前后开始做单分子酶学，就是用跟踪分析单个酶分子的反应过程。一大发现是
同一个酶分子的活性随时间在不断变化。这个方向做了几乎有10年，文章无数。
差不多那个时候开始的还有CARS，一直到现在都在做，前面都讨论过了。最近一个大的
突破是SRS，08年发的。其实这已经不是CARS了，光谱有很大的不同。SRS看的是由于拉
曼散射造成一束激光的能量被转移到另一束激光，这需要检测到激光能量大概10^-7的
变化，但最终灵敏度比CARS高很多。用跟SRS同样的手段还可以对有吸收但是不发荧光
的东西成像（比方说血红素）。
在Harvard开始的方向是在单细胞+单分子水平上观察细菌基因的表达和调控，主要是分
析Transcription和Translation的随机性。有一个结果特别有意思，就是在大肠杆菌里
面，任何一个时刻mRNA的copy number和对应蛋白质的copy number完全没有任何相关性
。这个方向成就了好几个现在转做系统生物学的人。
以上描述不见得完全准确，而且其它还有一些小的方向或者不太成功的方向，就不一一
列出来了。现在还有一个新方向是DNA测序。至于他们组里面还有没有未公开的秘密新
方向，我当然无从得知。

【在 a*q 的大作中提到】

: 就我所知道的谢晓亮的工作，特别早期的时候（94、95年左右）是用近场光学显微镜做
: 单分子检测，算是单分子荧光检测这一行最早的一批人。当年他跟Eric Betzig是直接
: 竞争对手，不过两个人现在都不做这个了。其实他到Harvard之后还做过一阵近场显微
: 镜，想看光合作用那些蛋白质的空间分布，后来放弃了，然后STORM之类的方法就出来
: 了。
: 96、97年前后开始做单分子酶学，就是用跟踪分析单个酶分子的反应过程。一大发现是
: 同一个酶分子的活性随时间在不断变化。这个方向做了几乎有10年，文章无数。
: 差不多那个时候开始的还有CARS，一直到现在都在做，前面都讨论过了。最近一个大的
: 突破是SRS，08年发的。其实这已经不是CARS了，光谱有很大的不同。SRS看的是由于拉
: 曼散射造成一束激光的能量被转移到另一束激光，这需要检测到激光能量的微小

z*g2012-03-17 07:03

279 楼

有做激光的牛人能解释一下如何做到高质量的Donut激光吗？
非常想知道技术细节。That's the juicy meal.

【在 v*****s 的大作中提到】

: STED的分辨率直接取决于doughnut中间那个空心的大小，这个对一个超分辨技术来说当
: 然是最重要的因素。他要多强功率的激光，我倒没印象了。我个人觉得一般强功率激光
: 都是军事用途的，硬烧伤或者模拟核试验的，米帝境内功率最强的激光应该是波音搞得
: 那个反导弹系统，单位面积强度最大的应该是那个XX实验室里面用32束激光聚焦到同一
: 点搞核聚变的。科研上很少用到太强功率的激光，生物的更不可能了，直接把细胞气化
: 了。
: 其实只要有那个doughnut的激光，有很多手段可以达到超分辨的，stimulated
: emission只是其中一种，还未必是最好的一种。这个里面最重要的idea是用激光
: deplete你的on state。sunney xie好像就用类似的办法实现了raman的单分子探测。

i*g2012-03-17 07:03

280 楼

觉得这种非标记的检测方法虽然有一定应用价值，但是对追求精度的实验检测而言还是
有点太粗糙了，如果能发现新的可标记但对蛋白结构功能影响很小的的荧光或其他小分
子，不仅分辨率可以提高几个级别，还能实时观测细胞内动态，那就很牛逼了。

抛砖引玉先。
十年前听过Sunney Xie的报告，讲近场拉曼成像，就是CARS。不久前的年会上，他又讲
了最新的进展，已经能做到实时成像了，能看到血红细胞在血管里的流动，能区分皮肤
表面组织的大致成分，还能区分出动物脑中的癌变部位。主要是用拉曼谱的两个波长，
lipid 2845 cm-1, protein 2950 cm-1.
我的粗浅理解是，只要能得到可解析的信噪比，成像就是激光扫描和后续处理的事了，
至于精度可能不能要求太高，但贵在不用标记，完全Non-invasive。只是近场拉曼成像
，要求样品紧贴物镜，对于其应用稍有限制，或许将来可以用手持式光纤的方法直接用
到临床，这样手术中主刀医生就不用等病理切片的结果出来就可以判断哪些是病变组织
需要切除的。
听过钱永健的一次报告，他是做GFP起家的，所以他的方法是用免疫或转基因的方法将
癌变组织标记上荧光，这样医生直接切除有荧光的组织即可。
Sunney Xie是实验方法创新的大牛。对于研究工具与研究方法的改进和创新，是中国学
术界需要大力改进思维定势的地方，老是用已商业化的机器，只能跟在别人后面跑，做
不到最前沿。
其他同学再介绍下Xie的其它方面的工作吧。
techniques

【在 z********g 的大作中提到】

: 抛砖引玉先。
: 十年前听过Sunney Xie的报告，讲近场拉曼成像，就是CARS。不久前的年会上，他又讲
: 了最新的进展，已经能做到实时成像了，能看到血红细胞在血管里的流动，能区分皮肤
: 表面组织的大致成分，还能区分出动物脑中的癌变部位。主要是用拉曼谱的两个波长，
: lipid 2845 cm-1, protein 2950 cm-1.
: 我的粗浅理解是，只要能得到可解析的信噪比，成像就是激光扫描和后续处理的事了，
: 至于精度可能不能要求太高，但贵在不用标记，完全Non-invasive。只是近场拉曼成像
: ，要求样品紧贴物镜，对于其应用稍有限制，或许将来可以用手持式光纤的方法直接用
: 到临床，这样手术中主刀医生就不用等病理切片的结果出来就可以判断哪些是病变组织
: 需要切除的。

v*s2012-03-17 07:03

281 楼

我只知道一般性的思路就是把激光聚焦以后，它在焦平面上的像实际等效于对激光的
profile作了傅立叶变换，那么在那个平面上进行beam shaping就可以做到精确的phase
control。这个现在应该算成熟技术了，物理化学里面的quantum control实验都是这
么做的，通过精确控制激光能量和形状，可以把分子激发到任意高能态。
具体说donut的话，我去看了一下paper，用的是spiral phase plate，比较精巧和特殊的一个方法。底下第一个链接上有一个比较好看的图，第二个链接讲清楚了为什么spiral phase plate可以形成donut。
http://en.wikipedia.org/wiki/Angular_momentum_of_light
http://www.st-andrews.ac.uk/~jcgl/Scots_Guide/MMWave/QO/compone

【在 z********g 的大作中提到】

: 有做激光的牛人能解释一下如何做到高质量的Donut激光吗？
: 非常想知道技术细节。That's the juicy meal.

v*s2012-03-17 07:03

282 楼

哈哈，我碰巧就认识一个不是hell的嫡系，自己搭了STED出来，用的还是2photon。可
惜没拼过hell，最后还是hell先搭出来的。

方。

【在 p*l 的大作中提到】

: 呵呵！我听说国内有地方也买了leica的STED。一般买这种第一代的大型仪器，都是当
: 冤大头的命。
: STED需要接近完美的alignment。就算是做光学的，要搭个STED出来也不是容易的事，
: 基本所有想自己搭STED的人，如果不是Hell的嫡系，折腾来折腾去都得找Hell讨教秘方。

z*g2012-03-17 07:03

283 楼

关于 High-speed AFM imaging, 还有个法国人叫Simon Scheuring. 有兴趣的同学可以
搜搜他的文章。
但AFM成像是触觉式的，只能看到表面形貌，而且加在针尖上的力、针尖与样品相互作
用力都会直接影响成像质量，所以我觉得观察一些很明显的构象变化，如myosin 走动
等是可以的，但对于蛋白内部或Helix倾斜角度变化等较小构象变化，这种方法可能还
需要进一步改进才行。

【在 a*q 的大作中提到】

: 动态过程还是可以的，时间分辨常数大概在几秒到几十秒量级，跟具体实验参数还有要
: 看什么东西有关，已经有好几篇文章讲这个的。这方面确实比不上SIM；如果要看的东
: 西小的话，也比不上STED，不过Commercial的STED太不争气了。
: 关于AFM，可以参考Toshio Ando的High-speed AFM：
: http://www.s.kanazawa-u.ac.jp/phys/biophys/index.htm
: 很有意思的，蛋白质构象变化，马达蛋白的运动都可以直接录像了。
:
: mRNA

v*s2012-03-17 07:03

284 楼

他最近还有一个比较成功的方向，是利用SRS和STED类似的思路看单分子的absorption。
他的网页上说SRS变化是10^-4的量级，10^-7太小了，激光本身都很难做到那么稳。
SRS最大的问题是分子Raman峰的特异性。因为毕竟生物体内的分子就是C，H，O，N这些
东西拼积木拼起来的，不同分子之间的Raman峰有多大区别，能不能找到癌变分子的特
异峰（fingerprint），这个很难说。Van Duyne这批打算把SERS用到生物体的人，可以
观测整个频谱，然后通过不同峰之间的相对比例来区别分子，SRS做不到这一点，它必
须针对事先某已知频率的振动能级来调谐激光波长。如果再考虑到激光波长的限制，它
能观测的特定的峰就更少了。

【在 a*q 的大作中提到】

: 就我所知道的谢晓亮的工作，特别早期的时候（94、95年左右）是用近场光学显微镜做
: 单分子检测，算是单分子荧光检测这一行最早的一批人。当年他跟Eric Betzig是直接
: 竞争对手，不过两个人现在都不做这个了。其实他到Harvard之后还做过一阵近场显微
: 镜，想看光合作用那些蛋白质的空间分布，后来放弃了，然后STORM之类的方法就出来
: 了。
: 96、97年前后开始做单分子酶学，就是用跟踪分析单个酶分子的反应过程。一大发现是
: 同一个酶分子的活性随时间在不断变化。这个方向做了几乎有10年，文章无数。
: 差不多那个时候开始的还有CARS，一直到现在都在做，前面都讨论过了。最近一个大的
: 突破是SRS，08年发的。其实这已经不是CARS了，光谱有很大的不同。SRS看的是由于拉
: 曼散射造成一束激光的能量被转移到另一束激光，这需要检测到激光能量的微小

p*l2012-03-17 07:03

285 楼

Donut是通过在STED光束中加一个votex phase plate形成的。这样处理后的光，聚焦是
就形成了个donut，学名叫optical votex。votex phase plate不是one size fit all
的，得根据STED光的波长订做。你也可以买到一大块plate，上面不同的区域适用于不
同波长。好的donut需要完美圆对称的STED光束，和精确对心的phase plate。道理很简
单的，但是要调好，很需要手巧心细，要很动脑子想怎么根据现象去判断光路往哪边偏
了，无的放矢的调是一辈子都调不出来的。其实生物里也有很多这样的实验艺术，如果
没人带着教，自己摸索方法会很痛苦。所以想复制Hell的STED，实验基本功差的组，得
好好掂量掂量。

【在 z********g 的大作中提到】

: 有做激光的牛人能解释一下如何做到高质量的Donut激光吗？
: 非常想知道技术细节。That's the juicy meal.

p*l2012-03-17 07:03

286 楼

我还听过一个灰头土脸的报告，台湾来的，说我们的STED depletion到不了底,
donut中间太亮，号称是激光不好。我私下里觉得他们是点子低，那个激光Hell
用的挺欢的。
Hell在STED这上面优势太明显了，非嫡系的跟着他的思路混，肯定拼不过的。

【在 v*****s 的大作中提到】

: 哈哈，我碰巧就认识一个不是hell的嫡系，自己搭了STED出来，用的还是2photon。可
: 惜没拼过hell，最后还是hell先搭出来的。
:
: 方。

v*s2012-03-17 07:03

287 楼

不知道我们俩说的是不是同一个人，我说的也是个台湾人，现在在加拿大。他的仪器主
要是他自己和一个大陆千老一起搭的，千老现在回国了，我估计他自己有点抓瞎。

【在 p*l 的大作中提到】

: 我还听过一个灰头土脸的报告，台湾来的，说我们的STED depletion到不了底,
: donut中间太亮，号称是激光不好。我私下里觉得他们是点子低，那个激光Hell
: 用的挺欢的。
: Hell在STED这上面优势太明显了，非嫡系的跟着他的思路混，肯定拼不过的。

p*l2012-03-17 07:03

288 楼

我说的是个在台湾的组，号称想用STED做极小体积上的FCS。这个Hell也在做，不
过Hell对这方面兴趣好像不是那么大。

【在 v*****s 的大作中提到】

: 不知道我们俩说的是不是同一个人，我说的也是个台湾人，现在在加拿大。他的仪器主
: 要是他自己和一个大陆千老一起搭的，千老现在回国了，我估计他自己有点抓瞎。

h*w2012-03-17 07:03

289 楼

这个很难吗，可以买到商业的spiral phase plate

【在 z********g 的大作中提到】

: 有做激光的牛人能解释一下如何做到高质量的Donut激光吗？
: 非常想知道技术细节。That's the juicy meal.

h*w2012-03-17 07:03

290 楼

其实SRS不是xie组第一个做出来的。 SRS spectrometer 在物理上已经用了很久。几
乎同一年可能是2009，欧洲的一个group就用fs激光器实现了SRSimaging，但是慢。
你仔细的看那片science文章，Sunny 只是用ps替代了fs，然后加了个phase lock。他
们也应用那片文章。
欧洲那帮真憋屈啊，因为他们没有两个locked ps lasers. 当然即使有，人也不一定让
发science。谁都自导用ps啊， cars那么久了

absorption。

【在 v*****s 的大作中提到】

: 他最近还有一个比较成功的方向，是利用SRS和STED类似的思路看单分子的absorption。
: 他的网页上说SRS变化是10^-4的量级，10^-7太小了，激光本身都很难做到那么稳。
: SRS最大的问题是分子Raman峰的特异性。因为毕竟生物体内的分子就是C，H，O，N这些
: 东西拼积木拼起来的，不同分子之间的Raman峰有多大区别，能不能找到癌变分子的特
: 异峰（fingerprint），这个很难说。Van Duyne这批打算把SERS用到生物体的人，可以
: 观测整个频谱，然后通过不同峰之间的相对比例来区别分子，SRS做不到这一点，它必
: 须针对事先某已知频率的振动能级来调谐激光波长。如果再考虑到激光波长的限制，它
: 能观测的特定的峰就更少了。

p*l2012-03-17 07:03

291 楼

第一次读SRS的文章的时候，感觉真是银子堆出来的文章。没银子的组，只能望洋兴叹
。不过如果不是水平高有实力，也弄不到那么多钱。

【在 h*w 的大作中提到】

: 其实SRS不是xie组第一个做出来的。 SRS spectrometer 在物理上已经用了很久。几
: 乎同一年可能是2009，欧洲的一个group就用fs激光器实现了SRSimaging，但是慢。
: 你仔细的看那片science文章，Sunny 只是用ps替代了fs，然后加了个phase lock。他
: 们也应用那片文章。
: 欧洲那帮真憋屈啊，因为他们没有两个locked ps lasers. 当然即使有，人也不一定让
: 发science。谁都自导用ps啊， cars那么久了
:
: absorption。

a*q2012-03-17 07:03

292 楼

他成名的应该是单分子酶学，CARS在华人圈里面比较有名，不过我个人最喜欢的还是单
分子基因表达的那些东西。

【在 i****g 的大作中提到】

: 介绍的很全面，谢涵盖的方向还真广。他最突出的贡献还是发明CARS和SRS吧？
:
: 就我所知道的谢晓亮的工作，特别早期的时候（94、95年左右）是用近场光学显微镜做
: 单分子检测，算是单分子荧光检测这一行最早的一批人。当年他跟Eric Betzig是直接
: 竞争对手，不过两个人现在都不做这个了。其实他到Harvard之后还做过一阵近场显微
: 镜，想看光合作用那些蛋白质的空间分布，后来放弃了，然后STORM之类的方法就出来
: 了。
: 96、97年前后开始做单分子酶学，就是用跟踪分析单个酶分子的反应过程。一大发现是
: 同一个酶分子的活性随时间在不断变化。这个方向做了几乎有10年，文章无数。
: 差不多那个时候开始的还有CARS，一直到现在都在做，前面都讨论过了。最近一个大的

h*w2012-03-17 07:03

293 楼

其实optics alignment 不太难，只要你找到calibration的方法。我最讨厌那个脉冲延
时，每次要重合他们，我都要上low coherence spectrometer 去验证。
哪位有简单的办法？

【在 a*q 的大作中提到】

: 他成名的应该是单分子酶学，CARS在华人圈里面比较有名，不过我个人最喜欢的还是单
: 分子基因表达的那些东西。

p*l2012-03-17 07:03

294 楼

做个一般质量的donut不难，但是STED的donut要中心完全黑，否则的话
加大STED力度的时候，会把中间的信号也给deplete了。据Hell手下的人
说，donut的中心和环，对比度要好过95%才可以去成像，如果想做顶级
分辨率，对比度要更高。

【在 h*w 的大作中提到】

: 这个很难吗，可以买到商业的spiral phase plate

h*w2012-03-17 07:03

295 楼

其实这个就是一个wavefront change。几种方法：
比如有多模光纤的高模
液晶或deformable mirror 做客调的

【在 p*l 的大作中提到】

: 做个一般质量的donut不难，但是STED的donut要中心完全黑，否则的话
: 加大STED力度的时候，会把中间的信号也给deplete了。据Hell手下的人
: 说，donut的中心和环，对比度要好过95%才可以去成像，如果想做顶级
: 分辨率，对比度要更高。

a*q2012-03-17 07:03

296 楼

原理并不复杂，只是实际要实现如此高的对比度，不是随便什么方法都能做得出来的。

【在 h*w 的大作中提到】

: 其实这个就是一个wavefront change。几种方法：
: 比如有多模光纤的高模
: 液晶或deformable mirror 做客调的

p*l2012-03-17 07:03

297 楼

实现时还需要考虑能量损失，做出个完美但是不亮的donut也没什么用。

【在 a*q 的大作中提到】

: 原理并不复杂，只是实际要实现如此高的对比度，不是随便什么方法都能做得出来的。

v*s2012-03-17 07:03

298 楼

time domain的overlap一般是用非线性的方法去找的。根据光的波长不同，可以使用不
同的Nonlinear powder或者crystal，然后找合频信号。
low coherence spectrometer是什么东西？没听说过啊。

【在 h*w 的大作中提到】

: 其实optics alignment 不太难，只要你找到calibration的方法。我最讨厌那个脉冲延
: 时，每次要重合他们，我都要上low coherence spectrometer 去验证。
: 哪位有简单的办法？

v*s2012-03-17 07:03

299 楼

SRS还好吧，两台超快激光器对物化lab来说，不算什么大事。振荡器加CPA，最多也就
三四十万，不算什么大钱。几乎独立PI起手都要至少一台，不然怎么做实验啊。

【在 p*l 的大作中提到】

: 第一次读SRS的文章的时候，感觉真是银子堆出来的文章。没银子的组，只能望洋兴叹
: 。不过如果不是水平高有实力，也弄不到那么多钱。

l*12012-03-17 07:03

300 楼

STORM living cell video recording barrier might be fixed by nonlinear
quantum
spectroscopy after 2017 AC (possible)
Alán Aspuru-Guzik Harvard Univ
his team one PNAS paper:
Quantum state and process tomography of energy transfer systems via
ultrafast spectroscopy.
Yuen-Zhou J et al. (2011)
PNAS 108:17615-17620.
key words:
processing ∣ open quantum systems ∣ quantum biology>
link:
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21997214
more pls go to
links:
//aspuru.chem.harvard.edu/about-alan/
//aspuru.chem.harvard.edu/research/
//aspuru.chem.harvard.edu/quantum-simulation/
Ps: ZXW 一个实验物理的PhD from Cal 在理论量子生物物理光学上和Cal物理系本
科毕业的红脖子在同一水平吧 Lol
那个STORM original thought was from Steven Chu
//www.popsci.com/science/article/2010-07/research-team-including-energy-sec-
steven-chu-breaks-record-highest-resolution-optical-imaging
>
07/15/10 at 12:50 pm
The FPALM system of microscopy developed by Sam Hess at the University of
Maine can image single molecules, and has been around for years. This isn't
new technology, and therefore really isn't a breakthrough. Chu isn't the
first one to come up with this, as Hess and a few other independent
researchers developed their own systems. Another system very similar to
FPALM (Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy) is STORM (
Stochastic Optical Reconstruction Microscopy), which uses the same ideas.
From a paper I've written:
Hess, Girirajan, and Mason demonstrated excitation using photoactivatable
green fluoroescent protein (PA-GFP) molecules which are initially “dark,”
meaning they are weakly fluoresced. It is at this point that fluorescence
and visualization take place at first one, then another excitation
wavelength. Once this is done, a small number of randomly photoactivated
molecules are localized using methods for single-molecule detection. To
improve the result, the randomly photoactivated molecules are separated from
each other by several times the resolution, as determined by the Rayleigh
criterion (Hess et al.4259).
Once a randomly-determined number of photons are retrieved from the
molecules, each of the molecules used is then photobleached. This process of
photobleaching causes the individual molecules to proceed to a state of non
-fluorescence, at which point they are “dark” and will no longer fluoresce
. Because the molecules that have been photobleached can no longer be
excited to fluoresce, a very accurate image can be assembled without fear of
overlapping molecules. Photoactivation times for the fluorophores used by
Hess et al. with FPALM were not significant due to the fact that the entire
field was being imaged at once. However, this photoactivation time is
significant in other methods, as it becomes more difficult to increase the
activation rate (Hess et al.4269).
Source: Hess, Samuel T., Thanu P K Girirajan, and Michael D. Mason. "Ultra-
High Resolution Imaging by Fluorescence Photoactivation Localization
Microscopy." Biophysical Journal 91.11 (2006): 4258-272.
---
07/15/10 at 4:03 pm
@chaseea0
What Dr Chu is stating that they have done is quite a bit higher resolution
than the 20 nM that the method you are describing can do.
----
发信人: abq (NM), 信区: Biology
标题: Re: 哪位能科普一下ZHUANG的单分子荧光
发信站: BBS 未名空间站 (Thu Mar 22 00:16:11 2012, 美东)
动态过程还是可以的，时间分辨常数大概在几秒到几十秒量级，跟具体实验参数还有要
看什么东西有关，已经有好几篇文章讲这个的。这方面确实比不上SIM；如果要看的东
西小的话，也比不上STED，不过Commercial的STED太不争气了。
关于AFM，可以参考Toshio Ando的High-speed AFM：
http://www.s.kanazawa-u.ac.jp/phys/biophys/index.htm
很有意思的，蛋白质构象变化，马达蛋白的运动都可以直接录像了。

mRNA

【在 z********g 的大作中提到】

: 如果STORM必须拍很多照片，然后进行图像处理才能得到高分辨的图像，是不是意味着
: STORM不能监测动态过程？它的时间分辨常数又是在什么量级上？
: 对于生物样品（如蛋白二维晶体或密集表达的膜蛋白），AFM能在XY平面做出分辨率达
: 到1nm的表面形貌图像(topography)，Z方向的分辨率理论上能达到0.1nm，但要在较硬
: 表面（如半体导样品）。AFM除能成像之外，还能做力谱，这是它独特的地方，很多实
: 验室用它来做蛋白的折叠与去折叠。
: Optical tweezer是另一做力谱的方法。做线性分子较多，如DNA与蛋白相互作用，mRNA
: 转录等。
:
: 个是跟

l*12012-03-17 07:03

301 楼

Sure
plus one review:
Campos LA et al (2009)
The importance of being quantitative.
PNAS 106:E139; author reply E140. Epub Dec 15.
Direct observation of barrier-limited folding of BBL by single-molecule
fluorescence resonance energy transfer.
link:
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20018769

舒服。。。

【在 w***x 的大作中提到】

: 庄的病毒-蛋白互作很多就是用smFRET的啊。。。和STORM好像关系不大
: 至少我去年JC看了几篇她的HIV逆转录起始方面的文章，都是FRET。。。
: 顺便，觉得庄姐姐的paper写作很不错，至少我看得那几篇逻辑非常清楚，读起来很舒服。。。

r*r2012-03-17 07:03

302 楼

昨天也刚好在看类似的paper 说说我的感觉
单分子成像技术是很不错但是受限于dye的种类能看的分子也受到很大的限制
不能像是抗体一样想看什么就看什么想看一的分子还得先找到可以用的dye才行
这在成像技术上或许是突破但是要说应用..我想还差得很远
在有兴趣的protein上面接GFP 或许是一个方法但不是每个蛋白质都可以随意的接GFP
比如某些膜蛋白你插一个GFP行为就天差地远了

l*12012-03-17 07:03

303 楼

学习了
BTW
无论哪一个 Raman scatter or Stimulated emission
德国哥廷根大斯图加特大都有牛人啊除了法兰克福的Hell 以外
links:
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15884061
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?db=pubmed&cmd=link&linkname=pubmed_pubmed_
citedin&uid=15884061
//www.pi3.uni-stuttgart.de/ags/volkmer/andreas.html

【在 p*l 的大作中提到】

: Raman scatter和Stimulated emission是两码事。

l*12012-03-17 07:03

304 楼

so 庄院士只靠STORM 是拿不上炸药奖哪怕是提名的
而同一化学系的老墨
Alán Aspuru-Guzik
//aspuru.chem.harvard.edu/research/
他的非线性量子光学显微镜能量分析系统实用10年后就可能是炸药奖喽
Assistant Professor, Harvard University (2006-2010)
Postdoctoral Researcher, UC Berkeley (2005-2006)
Ph.D., UC Berkeley (2004)
B.Sc., Universidad Nacional Autónoma de México (1999)
Major Honors and Awards
2012 Ulam Fellow, Los Alamos National Laboratories
2011 Big Think Delphi Fellow
2010 MIT Technology Review Young Innovator Under 35 (TR35)
cited from link:
//aspuru.chem.harvard.edu/about-alan/

GFP

【在 r****r 的大作中提到】

: 昨天也刚好在看类似的paper 说说我的感觉
: 单分子成像技术是很不错但是受限于dye的种类能看的分子也受到很大的限制
: 不能像是抗体一样想看什么就看什么想看一的分子还得先找到可以用的dye才行
: 这在成像技术上或许是突破但是要说应用..我想还差得很远
: 在有兴趣的protein上面接GFP 或许是一个方法但不是每个蛋白质都可以随意的接GFP
: 比如某些膜蛋白你插一个GFP行为就天差地远了

Y*62012-03-17 07:03

305 楼

Anyone who works in field want to have a part time or full time jobs. Please
let me know. We just started a new company in Suzhou and would like to
invite people in this field to give lecture, write books, or build
instrument for us.

techniques

【在 m***o 的大作中提到】

: 不是生物领域，感觉Harvard 庄晓薇的这个方向作的好牛。她真的能够看见单分子的
: in vivo 的运动吗？还有， Nucleic Acid - Protein Interactions？
: Single-Molecule biology:
: Nucleic Acid - Protein Interactions
: We explore single-molecule fluorescence imaging and spectroscopy techniques
: to study complex biomolecular systems.

w*s2012-03-17 07:03

306 楼

看得我惊心动魄。

b*r2012-03-17 07:03

307 楼

有个比较弱的问题
这些激光会不会导致局部温度过高，影响细胞活性？

【在 a*q 的大作中提到】

: 实际的instrument response应该是pixel和gaussian function的convolution。稍微算
: 一下就可以发现，只要pixel的大小小于gaussian的standard deviation，pixel对定位
: 精度的影响是很小的。影响定位精度最大的因素是噪音，跟检测到的光子个数和背景强
: 度直接相关。所以信号无限的情况下，时空精度真的是可以无限的，只是实际实验中单
: 分子的信号当然不可能是无限的。
:
: 。