R*r
2 楼
加了个中国馆
里面有几个无尽长城关卡，斗秦始皇，比英文版的好玩多了
★ 发自iPhone App: ChineseWeb 7.8
里面有几个无尽长城关卡，斗秦始皇，比英文版的好玩多了
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s*i
3 楼
周一到今天连续每天跑两个胶
结果每个都有问题
取成年小黑鼠样本
测PDK1，P-PDK1 还有其他protein
第一次的样本是上星期做的，结果pdk1 和P—pdk1 各出来bands，PDK比 P-PDK弱，第
一个不解
怀疑操作有问题，另取样本重新制作，第二次PDK没显示出来，P-PDK却一直存在，只不
过对比第一次稍弱
因为只load10ug跑胶，怀疑太少重复第三次，20ug，其他条件和第一次一样
结果PDK1还是没有显示 P—PDK1有显示
怀疑抗体浓度不够，今天使用一抗和二抗都用1：500，之前一直用1：1000
换用TPS—T 冲洗，之前都用PBS—T
另外操作过程反复检查过，把蛋白转到膜后ponceau检查没有问题，5%nonfat milk
incubate 1.30小时，冲洗都足15min，一抗体4度冰箱过夜，冲洗三次后二抗两小时，
再冲洗三次。抗体用的是cell signaling technology的。
百思不得其解，为啥第一次显示得出来~
另外同在一个胶跑的还有AKT和P-AKT，AKT显示正常，就是P-AKT有超多nonspecific
bands，有什么办法可以改进吗？
结果每个都有问题
取成年小黑鼠样本
测PDK1，P-PDK1 还有其他protein
第一次的样本是上星期做的，结果pdk1 和P—pdk1 各出来bands，PDK比 P-PDK弱，第
一个不解
怀疑操作有问题，另取样本重新制作，第二次PDK没显示出来，P-PDK却一直存在，只不
过对比第一次稍弱
因为只load10ug跑胶，怀疑太少重复第三次，20ug，其他条件和第一次一样
结果PDK1还是没有显示 P—PDK1有显示
怀疑抗体浓度不够，今天使用一抗和二抗都用1：500，之前一直用1：1000
换用TPS—T 冲洗，之前都用PBS—T
另外操作过程反复检查过，把蛋白转到膜后ponceau检查没有问题，5%nonfat milk
incubate 1.30小时，冲洗都足15min，一抗体4度冰箱过夜，冲洗三次后二抗两小时，
再冲洗三次。抗体用的是cell signaling technology的。
百思不得其解，为啥第一次显示得出来~
另外同在一个胶跑的还有AKT和P-AKT，AKT显示正常，就是P-AKT有超多nonspecific
bands，有什么办法可以改进吗？
w*y
4 楼
晕死，这么大个了
R*r
5 楼
秦始皇太狠了，死活过不去。
百度的所有攻略都不成。
谁有武功秘籍的，讨论一下啊。
百度的所有攻略都不成。
谁有武功秘籍的，讨论一下啊。
s*i
6 楼
今天停止实验，彻查问题
有大牛可以帮忙给些建议吗？
有大牛可以帮忙给些建议吗？
f*n
7 楼
来看老三的圣父光辉！
g*0
8 楼
１。并不是你说每步操作（特别是转膜）没问题就没问题的，找个老手帮你看看。
２。不同组织目标蛋白含量不一样，对抗体的反应也不一样，对同样抗体，有些组织带
就很干净，有些就出杂band。
３。cell signaling似乎鼠源抗体效果强于兔源抗体。
４。在效果不好的情况下，就不要再用最便宜的那种２５０ml一大瓶的普通ECL发光液
了。卖贵一点的 ECL plus或ECL extra之类的增强液。
２。不同组织目标蛋白含量不一样，对抗体的反应也不一样，对同样抗体，有些组织带
就很干净，有些就出杂band。
３。cell signaling似乎鼠源抗体效果强于兔源抗体。
４。在效果不好的情况下，就不要再用最便宜的那种２５０ml一大瓶的普通ECL发光液
了。卖贵一点的 ECL plus或ECL extra之类的增强液。
f*n
9 楼
这个次序和姿势俺看明白了
老三果然还是最喜欢小粉，小粉也最黏爸爸，还是女儿娇
老三果然还是最喜欢小粉，小粉也最黏爸爸，还是女儿娇
h*o
10 楼
p-PDK和PDK用得不是同一个抗体,不同抗体质量差距太大了, 强弱不能简单的比较
一般做pProtein/Protein都是先p在strip做总的,像你这种情况的话,我的建议是
parallel 跑两块一样的胶,一块做pPDK一块用个强一点的Femto显影做PDK就行了
至于AKT和P-AKT,我用过cell signaling 的p-AKT具体哪一个忘记了,band非常specific
.
另外二抗用的太高浓度了, 一般条带出不来,提高二抗是没有用的,反而会增加背景或者非特异性的条带
普通ECL的话,二抗我都是1:10000-20000
一般做pProtein/Protein都是先p在strip做总的,像你这种情况的话,我的建议是
parallel 跑两块一样的胶,一块做pPDK一块用个强一点的Femto显影做PDK就行了
至于AKT和P-AKT,我用过cell signaling 的p-AKT具体哪一个忘记了,band非常specific
.
另外二抗用的太高浓度了, 一般条带出不来,提高二抗是没有用的,反而会增加背景或者非特异性的条带
普通ECL的话,二抗我都是1:10000-20000
b*a
11 楼
小黑小粉的黑眼线变黑眼圈了。
s*i
12 楼
多谢两位的指教
下周根据意见改进
我通常是用普通ECL显示 然后再把半个小时还没有显示的膜再用supersignal显示一遍
不过通常普通ECL显示不出来 super也没辙
上面的PDK就是这样的例子
下周根据意见改进
我通常是用普通ECL显示 然后再把半个小时还没有显示的膜再用supersignal显示一遍
不过通常普通ECL显示不出来 super也没辙
上面的PDK就是这样的例子
P*2
13 楼
打到BSO
【在 z*********n 的大作中提到】
: 嘿嘿，轮流抱了会，一点都不闹
【在 z*********n 的大作中提到】
: 嘿嘿，轮流抱了会，一点都不闹
s*i
14 楼
请问Hellozero
我做这个实验就是要看PDK和P-PDK在同一个组织中显示出来量的不同
和对比不同组织的情况
你说不同抗体不能对比的话 那应该在怎么样对比两个的量呢？
今天再看发现AKT/P-AKT用的不是cell signaling的，是santa cruz的。这是唯一一个
不是cell那个公司的抗体
我实验室一哥们一直在用，不过他只取特定size的band 所以有nonspecific band他也
不知道
我在想是不是抗体的问题
我刚进实验室 有很多东西其实都不懂，真正菜鸟一只
specific
者非特异性的条带
【在 h*******o 的大作中提到】
: p-PDK和PDK用得不是同一个抗体,不同抗体质量差距太大了, 强弱不能简单的比较
: 一般做pProtein/Protein都是先p在strip做总的,像你这种情况的话,我的建议是
: parallel 跑两块一样的胶,一块做pPDK一块用个强一点的Femto显影做PDK就行了
: 至于AKT和P-AKT,我用过cell signaling 的p-AKT具体哪一个忘记了,band非常specific
: .
: 另外二抗用的太高浓度了, 一般条带出不来,提高二抗是没有用的,反而会增加背景或者非特异性的条带
: 普通ECL的话,二抗我都是1:10000-20000
我做这个实验就是要看PDK和P-PDK在同一个组织中显示出来量的不同
和对比不同组织的情况
你说不同抗体不能对比的话 那应该在怎么样对比两个的量呢？
今天再看发现AKT/P-AKT用的不是cell signaling的，是santa cruz的。这是唯一一个
不是cell那个公司的抗体
我实验室一哥们一直在用，不过他只取特定size的band 所以有nonspecific band他也
不知道
我在想是不是抗体的问题
我刚进实验室 有很多东西其实都不懂，真正菜鸟一只
specific
者非特异性的条带
【在 h*******o 的大作中提到】
: p-PDK和PDK用得不是同一个抗体,不同抗体质量差距太大了, 强弱不能简单的比较
: 一般做pProtein/Protein都是先p在strip做总的,像你这种情况的话,我的建议是
: parallel 跑两块一样的胶,一块做pPDK一块用个强一点的Femto显影做PDK就行了
: 至于AKT和P-AKT,我用过cell signaling 的p-AKT具体哪一个忘记了,band非常specific
: .
: 另外二抗用的太高浓度了, 一般条带出不来,提高二抗是没有用的,反而会增加背景或者非特异性的条带
: 普通ECL的话,二抗我都是1:10000-20000
y*l
15 楼
co~
【在 P******2 的大作中提到】
: 打到BSO
【在 P******2 的大作中提到】
: 打到BSO
Y*s
16 楼
so that's what you do when you are not boarding... :)
is that dinner?
/runnnn
is that dinner?
/runnnn
d*y
17 楼
好肥
s*l
18 楼
瓦~~~你终于买相机了阿~~~~
a*r
19 楼
哇塞好大的个子！
不过还是那么的cute啊！
强烈要求老三和兔子们合影奔，而且不许掐头去尾的，嗯
不过还是那么的cute啊！
强烈要求老三和兔子们合影奔，而且不许掐头去尾的，嗯
c*e
20 楼
= =
被张老三的“一个半巴掌”蒙蔽了
看着很结实啊。。。。。一定抱着很舒服=w=
【在 w***y 的大作中提到】
: 晕死，这么大个了
被张老三的“一个半巴掌”蒙蔽了
看着很结实啊。。。。。一定抱着很舒服=w=
【在 w***y 的大作中提到】
: 晕死，这么大个了
w*e
21 楼
兔爹好幸福啊！好奇的问一句，三色的那只是不是女娃？
h*r
22 楼
据说只有小粉是女娃
【在 w****e 的大作中提到】
: 兔爹好幸福啊！好奇的问一句，三色的那只是不是女娃？
【在 w****e 的大作中提到】
: 兔爹好幸福啊！好奇的问一句，三色的那只是不是女娃？
c*a
23 楼
啧啧，长得真快啊
w*j
24 楼
长这么大了啊
P*0
25 楼
麻辣兔头。
【在 z*********n 的大作中提到】
: 嘿嘿，轮流抱了会，一点都不闹
【在 z*********n 的大作中提到】
: 嘿嘿，轮流抱了会，一点都不闹
w*e
26 楼
哦谢谢。。俺以为兔子也和猫一样，有三种颜色的都是女娃。
【在 h********r 的大作中提到】
: 据说只有小粉是女娃
【在 h********r 的大作中提到】
: 据说只有小粉是女娃
a*e
27 楼
赞圣父光辉
小粉跟小孩子一样，乖乖的趴着啊
小粉跟小孩子一样，乖乖的趴着啊
z*n
28 楼
从那次后又长了，哈哈哈哈
【在 c*******e 的大作中提到】
: = =
: 被张老三的“一个半巴掌”蒙蔽了
: 看着很结实啊。。。。。一定抱着很舒服=w=
【在 c*******e 的大作中提到】
: = =
: 被张老三的“一个半巴掌”蒙蔽了
: 看着很结实啊。。。。。一定抱着很舒服=w=
C*y
29 楼
看起来手感超好
【在 z*********n 的大作中提到】
: 嘿嘿，轮流抱了会，一点都不闹
【在 z*********n 的大作中提到】
: 嘿嘿，轮流抱了会，一点都不闹
s*t
30 楼
穿着黑衣服抱小白兔，嘿嘿嘿。。。
z*n
31 楼
是大白兔，呵呵，现在都长得很大
【在 s*******t 的大作中提到】
: 穿着黑衣服抱小白兔，嘿嘿嘿。。。
【在 s*******t 的大作中提到】
: 穿着黑衣服抱小白兔，嘿嘿嘿。。。
p*l
32 楼
好象有点故意刺激我们。。。
说实话，我现在是努力培养感情，昨天她在我们膝盖上上上下下多次来享用点心。劳工
说了：除非你又要给她剪指甲了，还是耐心等她彻底顺伏再抱吧。
我等等等等等等吧。
嘿，老三好象还没给你的儿女们剪过指甲吧，晚上回去看看，有多长了，太长的话，他
们容易受伤的。
【在 z*********n 的大作中提到】
: 是大白兔，呵呵，现在都长得很大
说实话，我现在是努力培养感情，昨天她在我们膝盖上上上下下多次来享用点心。劳工
说了：除非你又要给她剪指甲了，还是耐心等她彻底顺伏再抱吧。
我等等等等等等吧。
嘿，老三好象还没给你的儿女们剪过指甲吧，晚上回去看看，有多长了，太长的话，他
们容易受伤的。
【在 z*********n 的大作中提到】
: 是大白兔，呵呵，现在都长得很大
p*l
33 楼
好象抱小粉的手法比较安全，别的都有窜出去的风险。
z*n
34 楼
他们不窜，很enjoy，呵呵
【在 p*******l 的大作中提到】
: 好象抱小粉的手法比较安全，别的都有窜出去的风险。
【在 p*******l 的大作中提到】
: 好象抱小粉的手法比较安全，别的都有窜出去的风险。
p*l
35 楼
你上次不是说抱兔子是违背他们天性？怎么现在改口了？抱得舒服吧？呵呵
【在 z*********n 的大作中提到】
: 他们不窜，很enjoy，呵呵
【在 z*********n 的大作中提到】
: 他们不窜，很enjoy，呵呵
z*n
36 楼
嗯，但是昨天抱他们的时候的确非常乖顺，哈哈
【在 p*******l 的大作中提到】
: 你上次不是说抱兔子是违背他们天性？怎么现在改口了？抱得舒服吧？呵呵
【在 p*******l 的大作中提到】
: 你上次不是说抱兔子是违背他们天性？怎么现在改口了？抱得舒服吧？呵呵
f*n
37 楼
赞老三！长这么大了。
M*9
38 楼
天啊， 长这么大了？
【在 z*********n 的大作中提到】
: 嘿嘿，轮流抱了会，一点都不闹
【在 z*********n 的大作中提到】
: 嘿嘿，轮流抱了会，一点都不闹
D*y
39 楼
原来张老三真的是男的哇。。。。。
有一阵子我有点晕了，以为张老三是女的。
【在 z*********n 的大作中提到】
: 嘿嘿，轮流抱了会，一点都不闹
有一阵子我有点晕了，以为张老三是女的。
【在 z*********n 的大作中提到】
: 嘿嘿，轮流抱了会，一点都不闹
d*c
40 楼
还会再长大么？
已经长了好几倍了吧。。
【在 z*********n 的大作中提到】
: 嘿嘿，轮流抱了会，一点都不闹
已经长了好几倍了吧。。
【在 z*********n 的大作中提到】
: 嘿嘿，轮流抱了会，一点都不闹
L*i
41 楼
长的超大只了
小的时候就趴在手掌上 = =
兔子看来还是认爹的啊
小的时候就趴在手掌上 = =
兔子看来还是认爹的啊
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