b*e
2 楼
春天来了
做个好春梦
前三十位
做个好春梦
前三十位
m*n
3 楼
像打翻的牛奶
永远拾不回来
也像雨天的伤疤
时不时痛一下
也许
经历过无数个日出日落
我们再也不记得
爱情是什么
永远拾不回来
也像雨天的伤疤
时不时痛一下
也许
经历过无数个日出日落
我们再也不记得
爱情是什么
H*n
4 楼
自己折腾了好久，还是解决不了问题，只好来版上请教大牛了。
DNA shearing to 150-700 bp, Input DNA 量是～100ug，抗体用Abcam的anti-HA （
ChIP grade， 5ug for each IP）
抗体结合的buffer 配方是（ChIP dilution buffer： 20mMTrisHC PH8.0， EDTA PH8.
0 2mM, NaCl 150mM, SDS 0.01%, TritonX-100 1%）. 抗体incubate Overnight,
millipore的beads用dilution buffer 洗三遍，然后BSA block overnight 第二天加进
去，3-4hours.
还有，做的是tissue的ChIP（表达这个TF的细胞只占细胞总数的8%-10%），为了让固定
的1%甲醛渗透更快点，用tripsin消化了
组织（之前直接用SDS裂解组织也做过，效果也不好），固定10min.
wash： 1 low salt ->1 high salt->1 LiCL suffer->2* TE
问题: 1. 没有TF banding 的地方， anti-HA 和 anti-IgG都能扩出带。
2. 理论有TF banding的地方， anti-HA拉下的带和anti-IgG 相比基本没有加强
（可能有加强一点）。
3. 这个HA抗体比较tricky， 同时做了一组anti-polII，和anti-IgG相比，能拉
下很多TATAbox region.
看一些材料说可以优化binding buffer 盐浓度,让抗体结合的更好点，但是没有经验，
不知道如何改.另外，其他的改进方法都还有那些？ 不甚感激！！！
DNA shearing to 150-700 bp, Input DNA 量是～100ug，抗体用Abcam的anti-HA （
ChIP grade， 5ug for each IP）
抗体结合的buffer 配方是（ChIP dilution buffer： 20mMTrisHC PH8.0， EDTA PH8.
0 2mM, NaCl 150mM, SDS 0.01%, TritonX-100 1%）. 抗体incubate Overnight,
millipore的beads用dilution buffer 洗三遍，然后BSA block overnight 第二天加进
去，3-4hours.
还有，做的是tissue的ChIP（表达这个TF的细胞只占细胞总数的8%-10%），为了让固定
的1%甲醛渗透更快点，用tripsin消化了
组织（之前直接用SDS裂解组织也做过，效果也不好），固定10min.
wash： 1 low salt ->1 high salt->1 LiCL suffer->2* TE
问题: 1. 没有TF banding 的地方， anti-HA 和 anti-IgG都能扩出带。
2. 理论有TF banding的地方， anti-HA拉下的带和anti-IgG 相比基本没有加强
（可能有加强一点）。
3. 这个HA抗体比较tricky， 同时做了一组anti-polII，和anti-IgG相比，能拉
下很多TATAbox region.
看一些材料说可以优化binding buffer 盐浓度,让抗体结合的更好点，但是没有经验，
不知道如何改.另外，其他的改进方法都还有那些？ 不甚感激！！！
v*6
5 楼
赞!
排
排
m*o
6 楼
patpat
更像原味的咖啡
让你尝尝苦的滋味
又像儿时满身的伤疤
时间会医治好疼痛
请坚信
送走次次的爱爱恨恨
最终属于你的爱情
会在某个拐角等你
像打翻的牛奶
永远拾不回来
也像雨天的伤疤
时不时痛一下
也许
经历过无数个日出日落
我们再也不记得
爱情是什么
【在 m********n 的大作中提到】
: 像打翻的牛奶
: 永远拾不回来
: 也像雨天的伤疤
: 时不时痛一下
: 也许
: 经历过无数个日出日落
: 我们再也不记得
: 爱情是什么
更像原味的咖啡
让你尝尝苦的滋味
又像儿时满身的伤疤
时间会医治好疼痛
请坚信
送走次次的爱爱恨恨
最终属于你的爱情
会在某个拐角等你
像打翻的牛奶
永远拾不回来
也像雨天的伤疤
时不时痛一下
也许
经历过无数个日出日落
我们再也不记得
爱情是什么
【在 m********n 的大作中提到】
: 像打翻的牛奶
: 永远拾不回来
: 也像雨天的伤疤
: 时不时痛一下
: 也许
: 经历过无数个日出日落
: 我们再也不记得
: 爱情是什么
G*e
7 楼
我觉得你做的tissue ChIP比我做的是相当高级了，没有直接的经验，不过有一些擦边
的想法
Most likely，你已经指出来实验的问题了，在第三点
你用polii可以拉下来很多，但是这个抗体不行
说明你的ChIP过程是work的，至少对好的抗体来讲。
还有一个问题是信号强度的问题，有可能却是是这个TF在体内信号很低
是否可以考虑同时做个对照，拿已知的可以有很强binding的system
比如说体外培养的细胞，大家公认这个TF在某个promoter有很强的binding
拿着个来作为positive control
如果阳性对照出来了，这个tissue的还做不出来，那有可能却是没有cell culture那么
强的binding，或许体内和体外就是不一样。
有没有试过qPCR来定量分析？
如果你的polii用的是mouse igG2a的8wg16，我觉得它是一个非常好的抗体
在TATA和基因外区域，有些时候可以得到好几百倍的信号差异
所以我觉得qPCR可能会有帮助提高resolution
你的IgGChIP是什么IgG，是否和HA的抗体是同类，还是和PolII同类？
如果不是同类的，可能不能作为negative control
我不确定不同的IgG对tissueChIP是否会有高的背景
的想法
Most likely，你已经指出来实验的问题了，在第三点
你用polii可以拉下来很多，但是这个抗体不行
说明你的ChIP过程是work的，至少对好的抗体来讲。
还有一个问题是信号强度的问题，有可能却是是这个TF在体内信号很低
是否可以考虑同时做个对照，拿已知的可以有很强binding的system
比如说体外培养的细胞，大家公认这个TF在某个promoter有很强的binding
拿着个来作为positive control
如果阳性对照出来了，这个tissue的还做不出来，那有可能却是没有cell culture那么
强的binding，或许体内和体外就是不一样。
有没有试过qPCR来定量分析？
如果你的polii用的是mouse igG2a的8wg16，我觉得它是一个非常好的抗体
在TATA和基因外区域，有些时候可以得到好几百倍的信号差异
所以我觉得qPCR可能会有帮助提高resolution
你的IgGChIP是什么IgG，是否和HA的抗体是同类，还是和PolII同类？
如果不是同类的，可能不能作为negative control
我不确定不同的IgG对tissueChIP是否会有高的背景
b*d
8 楼
pai~~
M*9
9 楼
赞。 腐肉不去除， 伤口好不了。 转角遇见爱， 哈哈。。。
【在 m***o 的大作中提到】
: patpat
: 更像原味的咖啡
: 让你尝尝苦的滋味
: 又像儿时满身的伤疤
: 时间会医治好疼痛
: 请坚信
: 送走次次的爱爱恨恨
: 最终属于你的爱情
: 会在某个拐角等你
:
【在 m***o 的大作中提到】
: patpat
: 更像原味的咖啡
: 让你尝尝苦的滋味
: 又像儿时满身的伤疤
: 时间会医治好疼痛
: 请坚信
: 送走次次的爱爱恨恨
: 最终属于你的爱情
: 会在某个拐角等你
:
G*e
10 楼
没有看到你文中“大牛”两个字。。。
b*r
11 楼
吃
D*r
12 楼
还想梦幻的霓虹灯
让你看不清它的真实颜色
灯灭了
梦也该醒了
【在 m***o 的大作中提到】
: patpat
: 更像原味的咖啡
: 让你尝尝苦的滋味
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: 请坚信
: 送走次次的爱爱恨恨
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: 会在某个拐角等你
:
让你看不清它的真实颜色
灯灭了
梦也该醒了
【在 m***o 的大作中提到】
: patpat
: 更像原味的咖啡
: 让你尝尝苦的滋味
: 又像儿时满身的伤疤
: 时间会医治好疼痛
: 请坚信
: 送走次次的爱爱恨恨
: 最终属于你的爱情
: 会在某个拐角等你
:
l*s
13 楼
我们可以讨论，这两天在做CHIP，你买 Cell singalling 的beads，我觉得挺好用。里
面把bsa什么的都是ready to use
另外我建议，用1mm glass beads 在计入125mM glycine 以后，打晕组织再次，打个6
次，中间休息1-2min 放在冰上。 trypsine 可以不用。 我这里些个protocol 可以给
你，07年nature protocol 有个 fast chip 你就可以借鉴
qq 53671616
面把bsa什么的都是ready to use
另外我建议，用1mm glass beads 在计入125mM glycine 以后，打晕组织再次，打个6
次，中间休息1-2min 放在冰上。 trypsine 可以不用。 我这里些个protocol 可以给
你，07年nature protocol 有个 fast chip 你就可以借鉴
qq 53671616
x*o
14 楼
pai
y*u
15 楼
唉，青年女诗人就是这样炼成的。
H*n
16 楼
多谢你的的回复！
我的positive control就是用anti-polII 拉下GAPDH的 TATA box region. 另外，我的
anti-HA 和 IgG都是Rabbit的，是否IgG这里会产生背景？
现在我在设计Q-PCR的引物，具体看看定量。老板还要我用这个模型做ChIP-seq，现在
这个enrichment的效果真让我不敢想象。
PS：我自己做了一个Knock-in 的老鼠，让那个TF带有HA fusion.
欢迎继续交流！
【在 G********e 的大作中提到】
: 我觉得你做的tissue ChIP比我做的是相当高级了，没有直接的经验，不过有一些擦边
: 的想法
: Most likely，你已经指出来实验的问题了，在第三点
: 你用polii可以拉下来很多，但是这个抗体不行
: 说明你的ChIP过程是work的，至少对好的抗体来讲。
: 还有一个问题是信号强度的问题，有可能却是是这个TF在体内信号很低
: 是否可以考虑同时做个对照，拿已知的可以有很强binding的system
: 比如说体外培养的细胞，大家公认这个TF在某个promoter有很强的binding
: 拿着个来作为positive control
: 如果阳性对照出来了，这个tissue的还做不出来，那有可能却是没有cell culture那么
我的positive control就是用anti-polII 拉下GAPDH的 TATA box region. 另外，我的
anti-HA 和 IgG都是Rabbit的，是否IgG这里会产生背景？
现在我在设计Q-PCR的引物，具体看看定量。老板还要我用这个模型做ChIP-seq，现在
这个enrichment的效果真让我不敢想象。
PS：我自己做了一个Knock-in 的老鼠，让那个TF带有HA fusion.
欢迎继续交流！
【在 G********e 的大作中提到】
: 我觉得你做的tissue ChIP比我做的是相当高级了，没有直接的经验，不过有一些擦边
: 的想法
: Most likely，你已经指出来实验的问题了，在第三点
: 你用polii可以拉下来很多，但是这个抗体不行
: 说明你的ChIP过程是work的，至少对好的抗体来讲。
: 还有一个问题是信号强度的问题，有可能却是是这个TF在体内信号很低
: 是否可以考虑同时做个对照，拿已知的可以有很强binding的system
: 比如说体外培养的细胞，大家公认这个TF在某个promoter有很强的binding
: 拿着个来作为positive control
: 如果阳性对照出来了，这个tissue的还做不出来，那有可能却是没有cell culture那么
l*o
17 楼
排上！
【在 b****e 的大作中提到】
: 春天来了
: 做个好春梦
: 前三十位
l*o
18 楼
女青都该失恋啊？
【在 y****u 的大作中提到】
: 唉，青年女诗人就是这样炼成的。
【在 y****u 的大作中提到】
: 唉，青年女诗人就是这样炼成的。
H*n
19 楼
多谢beads的信息。其实我也怀疑这个milipore 的beads不给力。已发送qq好友申请。
呵呵。
6
【在 l********s 的大作中提到】
: 我们可以讨论，这两天在做CHIP，你买 Cell singalling 的beads，我觉得挺好用。里
: 面把bsa什么的都是ready to use
: 另外我建议，用1mm glass beads 在计入125mM glycine 以后，打晕组织再次，打个6
: 次，中间休息1-2min 放在冰上。 trypsine 可以不用。 我这里些个protocol 可以给
: 你，07年nature protocol 有个 fast chip 你就可以借鉴
: qq 53671616
呵呵。
6
【在 l********s 的大作中提到】
: 我们可以讨论，这两天在做CHIP，你买 Cell singalling 的beads，我觉得挺好用。里
: 面把bsa什么的都是ready to use
: 另外我建议，用1mm glass beads 在计入125mM glycine 以后，打晕组织再次，打个6
: 次，中间休息1-2min 放在冰上。 trypsine 可以不用。 我这里些个protocol 可以给
: 你，07年nature protocol 有个 fast chip 你就可以借鉴
: qq 53671616
EA
20 楼
re
【在 b****e 的大作中提到】
: 春天来了
: 做个好春梦
: 前三十位
【在 b****e 的大作中提到】
: 春天来了
: 做个好春梦
: 前三十位
g*g
21 楼
这点算个啥。 真正的愁，真正的怨。
那是啥， 有一句词， 忘了。 等想起来在填上。
【在 m********n 的大作中提到】
: 像打翻的牛奶
: 永远拾不回来
: 也像雨天的伤疤
: 时不时痛一下
: 也许
: 经历过无数个日出日落
: 我们再也不记得
: 爱情是什么
那是啥， 有一句词， 忘了。 等想起来在填上。
【在 m********n 的大作中提到】
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: 永远拾不回来
: 也像雨天的伤疤
: 时不时痛一下
: 也许
: 经历过无数个日出日落
: 我们再也不记得
: 爱情是什么
w*a
22 楼
我是直接买的millipore的试剂盒
感觉用的很好
不过我得抗体是高浓度chip专用的
感觉用的很好
不过我得抗体是高浓度chip专用的
v*o
23 楼
Re
【在 b****e 的大作中提到】
: 春天来了
: 做个好春梦
: 前三十位
【在 b****e 的大作中提到】
: 春天来了
: 做个好春梦
: 前三十位
l*o
24 楼
坐等
【在 g**********g 的大作中提到】
: 这点算个啥。 真正的愁，真正的怨。
: 那是啥， 有一句词， 忘了。 等想起来在填上。
【在 g**********g 的大作中提到】
: 这点算个啥。 真正的愁，真正的怨。
: 那是啥， 有一句词， 忘了。 等想起来在填上。
n*k
25 楼
换抗体！抗体好， everything rocks! Ab sucks, nothing works!
PH8.
【在 H****n 的大作中提到】
: 自己折腾了好久，还是解决不了问题，只好来版上请教大牛了。
: DNA shearing to 150-700 bp, Input DNA 量是～100ug，抗体用Abcam的anti-HA （
: ChIP grade， 5ug for each IP）
: 抗体结合的buffer 配方是（ChIP dilution buffer： 20mMTrisHC PH8.0， EDTA PH8.
: 0 2mM, NaCl 150mM, SDS 0.01%, TritonX-100 1%）. 抗体incubate Overnight,
: millipore的beads用dilution buffer 洗三遍，然后BSA block overnight 第二天加进
: 去，3-4hours.
: 还有，做的是tissue的ChIP（表达这个TF的细胞只占细胞总数的8%-10%），为了让固定
: 的1%甲醛渗透更快点，用tripsin消化了
: 组织（之前直接用SDS裂解组织也做过，效果也不好），固定10min.
PH8.
【在 H****n 的大作中提到】
: 自己折腾了好久，还是解决不了问题，只好来版上请教大牛了。
: DNA shearing to 150-700 bp, Input DNA 量是～100ug，抗体用Abcam的anti-HA （
: ChIP grade， 5ug for each IP）
: 抗体结合的buffer 配方是（ChIP dilution buffer： 20mMTrisHC PH8.0， EDTA PH8.
: 0 2mM, NaCl 150mM, SDS 0.01%, TritonX-100 1%）. 抗体incubate Overnight,
: millipore的beads用dilution buffer 洗三遍，然后BSA block overnight 第二天加进
: 去，3-4hours.
: 还有，做的是tissue的ChIP（表达这个TF的细胞只占细胞总数的8%-10%），为了让固定
: 的1%甲醛渗透更快点，用tripsin消化了
: 组织（之前直接用SDS裂解组织也做过，效果也不好），固定10min.
j*0
26 楼
Pai
g*g
27 楼
而今识尽愁滋味，欲说还休。欲说还休，却道天凉好个秋。辛弃疾的词太豪放了。
最大莫过心死， 如果心若静水。 我不知道是解脱了还是最大的悲哀。 无欲无求难道
是最高境界？
【在 l****o 的大作中提到】
: 坐等
最大莫过心死， 如果心若静水。 我不知道是解脱了还是最大的悲哀。 无欲无求难道
是最高境界？
【在 l****o 的大作中提到】
: 坐等
H*n
28 楼
请问 anti-HA 的ChIP抗体哪家的好？
【在 n********k 的大作中提到】
: 换抗体！抗体好， everything rocks! Ab sucks, nothing works!
:
: PH8.
【在 n********k 的大作中提到】
: 换抗体！抗体好， everything rocks! Ab sucks, nothing works!
:
: PH8.
y*a
29 楼
数你快
不吃白不吃！
★ 发自iPhone App: ChineseWeb 8.6
【在 l*****o 的大作中提到】
:
: 排上！
不吃白不吃！
★ 发自iPhone App: ChineseWeb 8.6
【在 l*****o 的大作中提到】
:
: 排上！
G*e
30 楼
你这个positive control是CHIP过程的control，可以说明实验本身没问题
我说的那个是Ab的control，可以说明那个抗体可靠
如果这两个都做出来了，不管你得到什么样的结果都是非常solid
完全可以相信自己做出来的结果，不管别的人做出来什么样子，估计老板也无话可说
rabbit的IgG我在mouse tissue上做过，信号很低
ChIP-seq好啊，会得到比较全面的结果
【在 H****n 的大作中提到】
: 多谢你的的回复！
: 我的positive control就是用anti-polII 拉下GAPDH的 TATA box region. 另外，我的
: anti-HA 和 IgG都是Rabbit的，是否IgG这里会产生背景？
: 现在我在设计Q-PCR的引物，具体看看定量。老板还要我用这个模型做ChIP-seq，现在
: 这个enrichment的效果真让我不敢想象。
: PS：我自己做了一个Knock-in 的老鼠，让那个TF带有HA fusion.
: 欢迎继续交流！
我说的那个是Ab的control，可以说明那个抗体可靠
如果这两个都做出来了，不管你得到什么样的结果都是非常solid
完全可以相信自己做出来的结果，不管别的人做出来什么样子，估计老板也无话可说
rabbit的IgG我在mouse tissue上做过，信号很低
ChIP-seq好啊，会得到比较全面的结果
【在 H****n 的大作中提到】
: 多谢你的的回复！
: 我的positive control就是用anti-polII 拉下GAPDH的 TATA box region. 另外，我的
: anti-HA 和 IgG都是Rabbit的，是否IgG这里会产生背景？
: 现在我在设计Q-PCR的引物，具体看看定量。老板还要我用这个模型做ChIP-seq，现在
: 这个enrichment的效果真让我不敢想象。
: PS：我自己做了一个Knock-in 的老鼠，让那个TF带有HA fusion.
: 欢迎继续交流！
M*c
31 楼
吃包子 ：）
n*k
32 楼
I don't know but I know Ab is likely the No1 factor for ChIP, esp ChIP-seq,
so when buy antibody, look for ChIP-Seq grade or verified...
【在 H****n 的大作中提到】
: 请问 anti-HA 的ChIP抗体哪家的好？
so when buy antibody, look for ChIP-Seq grade or verified...
【在 H****n 的大作中提到】
: 请问 anti-HA 的ChIP抗体哪家的好？
c*r
33 楼
pai
【在 b****e 的大作中提到】
: 春天来了
: 做个好春梦
: 前三十位
【在 b****e 的大作中提到】
: 春天来了
: 做个好春梦
: 前三十位
H*n
34 楼
懂你说的control的意思。
另外，你说的 rabbit的IgG在mouse tissue上信号很低，意思是我可以用这个IgG来做
背景对照了是么？
（还是说我的anti-HA Ab是Rabbit的对mouse protein结合很低，要换）
Thx
【在 G********e 的大作中提到】
: 你这个positive control是CHIP过程的control，可以说明实验本身没问题
: 我说的那个是Ab的control，可以说明那个抗体可靠
: 如果这两个都做出来了，不管你得到什么样的结果都是非常solid
: 完全可以相信自己做出来的结果，不管别的人做出来什么样子，估计老板也无话可说
: rabbit的IgG我在mouse tissue上做过，信号很低
: ChIP-seq好啊，会得到比较全面的结果
另外，你说的 rabbit的IgG在mouse tissue上信号很低，意思是我可以用这个IgG来做
背景对照了是么？
（还是说我的anti-HA Ab是Rabbit的对mouse protein结合很低，要换）
Thx
【在 G********e 的大作中提到】
: 你这个positive control是CHIP过程的control，可以说明实验本身没问题
: 我说的那个是Ab的control，可以说明那个抗体可靠
: 如果这两个都做出来了，不管你得到什么样的结果都是非常solid
: 完全可以相信自己做出来的结果，不管别的人做出来什么样子，估计老板也无话可说
: rabbit的IgG我在mouse tissue上做过，信号很低
: ChIP-seq好啊，会得到比较全面的结果
s*s
35 楼
赞
G*e
36 楼
我没有做成功过tissue的，不好下结论，猜测可能洗不干净，不过你的wash过程也没太
大问题。
你觉得tissue的ChIP和in vitro培养的cells的ChIP做起来有什么不同吗？
我最近也打算尝试tissue的ChIP
大问题。
你觉得tissue的ChIP和in vitro培养的cells的ChIP做起来有什么不同吗？
我最近也打算尝试tissue的ChIP
f*a
37 楼
Pai.
i*r
38 楼
排
【在 b****e 的大作中提到】
: 春天来了
: 做个好春梦
: 前三十位
【在 b****e 的大作中提到】
: 春天来了
: 做个好春梦
: 前三十位
k*9
39 楼
排
【在 b****e 的大作中提到】
: 春天来了
: 做个好春梦
: 前三十位
【在 b****e 的大作中提到】
: 春天来了
: 做个好春梦
: 前三十位
G*i
40 楼
吃
x*n
41 楼
排
DW
42 楼
排！好梦！
【在 b****e 的大作中提到】
: 春天来了
: 做个好春梦
: 前三十位
【在 b****e 的大作中提到】
: 春天来了
: 做个好春梦
: 前三十位
o*o
43 楼
re
【在 b****e 的大作中提到】
: 春天来了
: 做个好春梦
: 前三十位
【在 b****e 的大作中提到】
: 春天来了
: 做个好春梦
: 前三十位
j*u
44 楼
我想吃
S*s
45 楼
pai
G*8
46 楼
圆满
R*s
47 楼
吃！
【在 b****e 的大作中提到】
: 春天来了
: 做个好春梦
: 前三十位
【在 b****e 的大作中提到】
: 春天来了
: 做个好春梦
: 前三十位
d*3
48 楼
chi
h*e
49 楼
re
B*a
50 楼
Chi
【在 b****e 的大作中提到】
: 春天来了
: 做个好春梦
: 前三十位
【在 b****e 的大作中提到】
: 春天来了
: 做个好春梦
: 前三十位
c*u
51 楼
收呀
s*y
52 楼
Re
【在 b****e 的大作中提到】
: 春天来了
: 做个好春梦
: 前三十位
【在 b****e 的大作中提到】
: 春天来了
: 做个好春梦
: 前三十位
w*c
53 楼
排
【在 b****e 的大作中提到】
: 春天来了
: 做个好春梦
: 前三十位
【在 b****e 的大作中提到】
: 春天来了
: 做个好春梦
: 前三十位
w*8
54 楼
chi
a*a
55 楼
yeah！
n*n
56 楼
又来晚了h
y*8
57 楼
站后排
x*i
58 楼
春天快乐！
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