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求设计knockin-bac transgenic的同学帮帮忙
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求设计knockin-bac transgenic的同学帮帮忙# Biology - 生物学
m*5
1 楼
如图，刚做好一个bac recombinnering的plasmid
想同时用tag标记C-terminal,另外因为是最后一个Exon，所以可以用是recapituate
endogenous 3,UTR调控，没有加artificial polyA
现在的问题是，因为种种原因，FRT-Neo-FRT不得不插在如图mCherry和3'UTR中间的位置
麻烦来了
1, 因为Neo selection marker和我的基因是同向的，在FRT-Neo-FRT不删除的情况下，
我的基因是否会用上Neo 的3'UTR(SV40 polyA)
2,哪些方法可以最快地删除Neo?我听说有bacterial表达flipase的，但四处找不到
commercial的
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O*e
2 楼
1. Most likly.
2. 我也没用过Flippase的表达载体。公司买不到，就去找发过类似文章的作者要呗

位置

【在 m******5 的大作中提到】
: 如图，刚做好一个bac recombinnering的plasmid
: 想同时用tag标记C-terminal,另外因为是最后一个Exon，所以可以用是recapituate
: endogenous 3,UTR调控，没有加artificial polyA
: 现在的问题是，因为种种原因，FRT-Neo-FRT不得不插在如图mCherry和3'UTR中间的位置
: 麻烦来了
: 1, 因为Neo selection marker和我的基因是同向的，在FRT-Neo-FRT不删除的情况下，
: 我的基因是否会用上Neo 的3'UTR(SV40 polyA)
: 2,哪些方法可以最快地删除Neo?我听说有bacterial表达flipase的，但四处找不到
: commercial的
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m*5
3 楼
1,most likely yes or no?

【在 O******e 的大作中提到】
: 1. Most likly.
: 2. 我也没用过Flippase的表达载体。公司买不到，就去找发过类似文章的作者要呗
:
: 位置
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O*e
4 楼
yes

【在 m******5 的大作中提到】
: 1,most likely yes or no?
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m*5
5 楼
Flipase表达载体我有，但那要在细胞里共转
我有查到有E.coli自带flipase的，质粒transform进去delection就完成了
正四处找commercial的

【在 O******e 的大作中提到】
: 1. Most likly.
: 2. 我也没用过Flippase的表达载体。公司买不到，就去找发过类似文章的作者要呗
:
: 位置
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s*r
6 楼
马上做一个大肠杆菌的表达construct.
共转大肠杆菌不就行了。

Flipase表达载体我有，但那要在细胞里共转
我有查到有E.coli自带flipase的，质粒transform进去delection就完成了
正四处找commercial的

【在 m******5 的大作中提到】
: Flipase表达载体我有，但那要在细胞里共转
: 我有查到有E.coli自带flipase的，质粒transform进去delection就完成了
: 正四处找commercial的
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m*5
7 楼
that takes time...

【在 s******r 的大作中提到】
: 马上做一个大肠杆菌的表达construct.
: 共转大肠杆菌不就行了。
:
: Flipase表达载体我有，但那要在细胞里共转
: 我有查到有E.coli自带flipase的，质粒transform进去delection就完成了
: 正四处找commercial的
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s*a
8 楼
当时为什么不设计成反向呢

位置

【在 m******5 的大作中提到】
: 如图，刚做好一个bac recombinnering的plasmid
: 想同时用tag标记C-terminal,另外因为是最后一个Exon，所以可以用是recapituate
: endogenous 3,UTR调控，没有加artificial polyA
: 现在的问题是，因为种种原因，FRT-Neo-FRT不得不插在如图mCherry和3'UTR中间的位置
: 麻烦来了
: 1, 因为Neo selection marker和我的基因是同向的，在FRT-Neo-FRT不删除的情况下，
: 我的基因是否会用上Neo 的3'UTR(SV40 polyA)
: 2,哪些方法可以最快地删除Neo?我听说有bacterial表达flipase的，但四处找不到
: commercial的
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a*8
9 楼
In many cases, the NeoR cassette inserts into intron region without concern.
Why people do not think the NeoR poly A would cause truncated form of the
endogenous gene? If you still feel uncomfortable with this, why not try
transfecting into 293 cells and test the expression (using fluorescence, RT-
PCR for 3'UTR or others)? Good luck.
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m*5
10 楼
because they use reversed direction...

【在 a******8 的大作中提到】
: In many cases, the NeoR cassette inserts into intron region without concern.
: Why people do not think the NeoR poly A would cause truncated form of the
: endogenous gene? If you still feel uncomfortable with this, why not try
: transfecting into 293 cells and test the expression (using fluorescence, RT-
: PCR for 3'UTR or others)? Good luck.
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s*r
11 楼
最多一个礼拜，你跟别人要来菌株也差不多时间。

that takes time...

【在 m******5 的大作中提到】
: that takes time...
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a*8
12 楼
Not necessarily.the mRNA splicing from the same genomic locus can be
different when using different promoters. There are many successful examples
when NeoR is in forward direction.

【在 m******5 的大作中提到】
: because they use reversed direction...
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m*5
13 楼
even in my case ? it
is in between of my last exon and 3,utr

【在 a******8 的大作中提到】
: Not necessarily.the mRNA splicing from the same genomic locus can be
: different when using different promoters. There are many successful examples
: when NeoR is in forward direction.
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m*5
14 楼
I actually want to take advantage of the polya downstream of neo in case I
don't want to pursue 3,utr function

【在 s******a 的大作中提到】
: 当时为什么不设计成反向呢
:
: 位置
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m*5
15 楼
而且我手头没有选择标签for co transfection...

【在 s******r 的大作中提到】
: 马上做一个大肠杆菌的表达construct.
: 共转大肠杆菌不就行了。
:
: Flipase表达载体我有，但那要在细胞里共转
: 我有查到有E.coli自带flipase的，质粒transform进去delection就完成了
: 正四处找commercial的
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g*y
16 楼
不是很明白为什么要在bacteria里面删除neo, 难道不用在ES cell里做selection么？
SW105 has an arabinose-inducible flpe gene ,做bac recombineering 的 lab不是
通常都有sw102,105,106系列菌株么？

位置

【在 m******5 的大作中提到】
: 如图，刚做好一个bac recombinnering的plasmid
: 想同时用tag标记C-terminal,另外因为是最后一个Exon，所以可以用是recapituate
: endogenous 3,UTR调控，没有加artificial polyA
: 现在的问题是，因为种种原因，FRT-Neo-FRT不得不插在如图mCherry和3'UTR中间的位置
: 麻烦来了
: 1, 因为Neo selection marker和我的基因是同向的，在FRT-Neo-FRT不删除的情况下，
: 我的基因是否会用上Neo 的3'UTR(SV40 polyA)
: 2,哪些方法可以最快地删除Neo?我听说有bacterial表达flipase的，但四处找不到
: commercial的
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m*5
17 楼
有另外一个marker 筛选

【在 g***y 的大作中提到】
: 不是很明白为什么要在bacteria里面删除neo, 难道不用在ES cell里做selection么？
: SW105 has an arabinose-inducible flpe gene ,做bac recombineering 的 lab不是
: 通常都有sw102,105,106系列菌株么？
:
: 位置
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s*r
18 楼
找找周围的实验室，要个vector。

而且我手头没有选择标签for co transfection...

【在 m******5 的大作中提到】
: 而且我手头没有选择标签for co transfection...
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m*5
19 楼
though it is not directly relevant to my post, I still apreciate that!!thank
you!
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