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Trouble-shooting of Southern Blot
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Trouble-shooting of Southern Blot# Biology - 生物学
m*i
1
Recipe 来自大厨 Jose Andres的书。
Squid with caramelized onion:
原料:squid一只(about 300g),1/4 cup olive oil,2tbsp dry white wine,1
garlic clove 拍扁,1 medium sized onion thinly sliced,some chopped parsley
做法:
1,中火,热油,把蒜放下去煎黄,下洋葱,煎到light brown,转小火,煎大概20分钟
吧,到洋葱完全caramelized,把洋葱拿出来,留底油。
2,油里加盐,转大火,放squid炒
3,把洋葱放进去炒,下酒,稍微saute一下
4,加盐调味,撒parsley,出锅
Traditional shrimp soup
原料:1/4 cup olive oil, 1 pound shrimp(我用了2/3 虾加一些扇贝,扇贝比虾味道
还好),6 cloves garlic thinly sliced,1 tsp brandy, some chopped parsley,
一只干辣椒
做法:
1,中大火,热油,把蒜煎黄
2,下虾,辣椒,煎熟
3,下brandy,稍微saute一下,下parsley,盐,出锅
都是非常简单的做法,味道非常非常赞。就是这个油啊……真是用得狠啊……
这些汤汁用来蘸面包真的是无敌了。
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s*1
2
我不爱钱!真的,我只追求我需要用到的钱,与那些希望钱越多越好的人不一样
。如果没有我那个渣男前男友我还不知道我自己竟然有这么高尚的想法呢。
也许我的前男友真的算是个的富二代吧,要不然他怎么可以高傲到目中无人的地
步呢?说说我和他的烂事吧。我和他的相遇并不精彩,我是个女律师,每天忙到天昏地
暗,所以在周末的时候我总是喜欢到一些能让人非常放松的夜店跳舞,也就是在夜店里
面遇到了请我喝酒的我的前男友。不得不说他追人绝对是有两下子的,要不然我这个极
度枯燥的女律师怎么会那么容易投入到他的怀抱。
可是交往之后我才发现我那所谓男朋友是有多傲慢,他仗着自己有几个钱,没事
总爱闯祸,然后用钱打发掉。刚开始我并没有制止他,想到自己也刚跟他交往没有多久
,还是不要多事好了。后来他竟然想用钱让我帮他做事,做什么事呢,让我尽情买足他
。他这不是明摆着把我当卖身的使唤了吗!鬼稀罕他。
有些话真的是说过了一遍再说一遍也不见得别人能懂!有钱不一定就能使鬼推磨
好吗!
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s*a
3
I used Amersham Direct Labeling Kit for my southern blot, and the protocol
is basically the kit manual. However, I have now a reproducible problem. As
shown in the blot, I expect a specific band in digested genomic DNA, but all
I have is a big smear (inside which there seems to be a band higher than my
target band).
I might have at least two problems:
1, the probe is bad;
2, the digestion is incomplete;
I kindly ask you to give me some advice regarding trouble shooting and how
should I proceed.
Take a bow...
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T*4
4
看着就像很美味的样子。谢谢分享!
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I*a
5
背景这么多斑点?可能是1的问题,
看错了
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A*a
6
都是海鮮..喜歡!

parsley

【在 m******i 的大作中提到】
: Recipe 来自大厨 Jose Andres的书。
: Squid with caramelized onion:
: 原料:squid一只(about 300g),1/4 cup olive oil,2tbsp dry white wine,1
: garlic clove 拍扁,1 medium sized onion thinly sliced,some chopped parsley
: 做法:
: 1,中火,热油,把蒜放下去煎黄,下洋葱,煎到light brown,转小火,煎大概20分钟
: 吧,到洋葱完全caramelized,把洋葱拿出来,留底油。
: 2,油里加盐,转大火,放squid炒
: 3,把洋葱放进去炒,下酒,稍微saute一下
: 4,加盐调味,撒parsley,出锅

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O*e
7
多半是消化不彻底。DNA量不要加太多。

As
all
my

【在 s******a 的大作中提到】
: I used Amersham Direct Labeling Kit for my southern blot, and the protocol
: is basically the kit manual. However, I have now a reproducible problem. As
: shown in the blot, I expect a specific band in digested genomic DNA, but all
: I have is a big smear (inside which there seems to be a band higher than my
: target band).
: I might have at least two problems:
: 1, the probe is bad;
: 2, the digestion is incomplete;
: I kindly ask you to give me some advice regarding trouble shooting and how
: should I proceed.

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A*a
8
問一下
squid吃來會不會硬硬的
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I*a
9
消化不彻底不是这样子的吧,
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A*r
10
不错
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s*a
11
目前这个探针有1100bp,太长了,不知道有没有关系。
我准备尝试几个150-300bp左右的探针
【在 IDjia (ID甲) 的大作中提到: 】
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c*2
12
zan!
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s*a
13
这次DNA用的是10ug(以前也试过5ug和10ug)
10ug DNA 100 ul体系切,precipitate之后上样也是类似结果(big smear,
with strongest part higher than desired)
有什么方法可以保证尽可能切好吗?

【在 O******e 的大作中提到】
: 多半是消化不彻底。DNA量不要加太多。
:
: As
: all
: my

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a*8
14
The amount of DNA is ok.
You are right that the probe is too long. Try using short and specific
probes.
Wash your membrane with more stringent buffer as there are dots on your
membrane.
Finally, genomic DNA quality can be a concern. Avoid votex during extraction
and frequent freeze/thaw cycles.
Good luck.
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O*e
15
probe为什么要那么长?太夸张了

【在 s******a 的大作中提到】
: 目前这个探针有1100bp,太长了,不知道有没有关系。
: 我准备尝试几个150-300bp左右的探针
: 【在 IDjia (ID甲) 的大作中提到: 】

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b*o
16
切割不完全 破酶烂DNA

As
all
my

【在 s******a 的大作中提到】
: I used Amersham Direct Labeling Kit for my southern blot, and the protocol
: is basically the kit manual. However, I have now a reproducible problem. As
: shown in the blot, I expect a specific band in digested genomic DNA, but all
: I have is a big smear (inside which there seems to be a band higher than my
: target band).
: I might have at least two problems:
: 1, the probe is bad;
: 2, the digestion is incomplete;
: I kindly ask you to give me some advice regarding trouble shooting and how
: should I proceed.

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s*a
17
一言难尽啊
实验室有另外一个高年级PHD,做和我类似的课题。
刚进实验室是他带我。他坚持认为越长越特异。所以我设计探针都按他建议的长度设计。
由于结果一直是smear,我就和他探讨是不是probe太长,非特异结合的可能性也大。
他直接否定我的想法,还是认为越长越好。
题外话,他基本从来没有肯定过我的想法。。。

【在 O******e 的大作中提到】
: probe为什么要那么长?太夸张了
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b*o
18
我觉得是这样的
Genomic DNA如果不干净 在酶切体系中是很粘的一个球 没有彻底溶解 pacI(切8bp位点
很少) 很有可能没法进入球的内部 导致不完全消化DNA
对于一般6bp的酶 因为位点比较多 酶一边切割表面的DNA 一边会帮助DNA溶解 所以酶
可以渗透到酶的内部 切割会很完全 不会有类似的问题
我建议你用pacI和一个不影响这个位点pattern的6bp酶来一起切 就不会有这个问题了
PS 我最多的时候一年做50个southern p32的哦 呵呵 不堪回首啊
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s*a
19
Thanks for your detailed explanation. I will check what enzymes I can use
for this purpose.
PS: You mean 50 experiments, not samples...right? That's indeed a lot.

【在 b*****o 的大作中提到】
: 我觉得是这样的
: Genomic DNA如果不干净 在酶切体系中是很粘的一个球 没有彻底溶解 pacI(切8bp位点
: 很少) 很有可能没法进入球的内部 导致不完全消化DNA
: 对于一般6bp的酶 因为位点比较多 酶一边切割表面的DNA 一边会帮助DNA溶解 所以酶
: 可以渗透到酶的内部 切割会很完全 不会有类似的问题
: 我建议你用pacI和一个不影响这个位点pattern的6bp酶来一起切 就不会有这个问题了
: PS 我最多的时候一年做50个southern p32的哦 呵呵 不堪回首啊

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l*1
20
把他做了 或阉了 误导你呢 by SB/NB probe 越长越特异
that 1100 bp probe 1/8 length is enough for SB/NB if that region is
special

计。

【在 s******a 的大作中提到】
: 一言难尽啊
: 实验室有另外一个高年级PHD,做和我类似的课题。
: 刚进实验室是他带我。他坚持认为越长越特异。所以我设计探针都按他建议的长度设计。
: 由于结果一直是smear,我就和他探讨是不是probe太长,非特异结合的可能性也大。
: 他直接否定我的想法,还是认为越长越好。
: 题外话,他基本从来没有肯定过我的想法。。。

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s*a
21
这个有点难度
:)

【在 l**********1 的大作中提到】
: 把他做了 或阉了 误导你呢 by SB/NB probe 越长越特异
: that 1100 bp probe 1/8 length is enough for SB/NB if that region is
: special
:
: 计。

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l*1
22
that is joke
就让他 赔你 一盒 韩国泡菜 亚洲食品店里的

【在 s******a 的大作中提到】
: 这个有点难度
: :)

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s*n
23
manual里没有建议的probe长度?这是P32标记的?
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h*y
24
探针的长度最好在300-800bp,1100bp的探针太长了。
探针的选择也很重要,不要有太多重复或者low complexity的区域。
you can use this website to search for the best probe.
http://www.genes2cognition.org/software/southern_blot/

【在 s******a 的大作中提到】
: 目前这个探针有1100bp,太长了,不知道有没有关系。
: 我准备尝试几个150-300bp左右的探针
: 【在 IDjia (ID甲) 的大作中提到: 】

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s*a
25
manual建议300bp是“good”,至少50bp以上。

【在 s********n 的大作中提到】
: manual里没有建议的probe长度?这是P32标记的?
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s*a
26
太感谢,我之前也就是主观选择区域,blast一下。之后我设计探针的时候可以参考这
个工具。

【在 h******y 的大作中提到】
: 探针的长度最好在300-800bp,1100bp的探针太长了。
: 探针的选择也很重要,不要有太多重复或者low complexity的区域。
: you can use this website to search for the best probe.
: http://www.genes2cognition.org/software/southern_blot/

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