PCR二次扩增 - 未名空间MITBBS历史存档

D*w2013-01-23 08:01

1 楼

iCloud?
Amazon cloud drive?
Skydrive?
Google Drive?
Dropbox?

x*e2013-01-23 08:01

2 楼

模板非常珍贵，而且已经用完了。PCR能扩出非常弱的条带。想以纯化的PCR弱产物为模
板，同样的引物来二次扩增，结果啥都扩不出来（以前也碰到过这种情况，这次是死马
当成活马医，结果还是一样）。引物往里面缩进10个碱基就能扩得很好。
不明白其中的道理，PCR指数扩增不就是以前一循环的产物为模板吗？为什么二次扩增
就不行了？
望各位不吝指教。

g*r2013-01-23 08:01

3 楼

遇到过这个情况解决方法是把PCR产物稀释很多倍作为模板比如你可以试试 1/100，1
/1000, 1/10000....
如果做出来了记得给我发个包子哈哈哈哈

【在 x**e 的大作中提到】

: 模板非常珍贵，而且已经用完了。PCR能扩出非常弱的条带。想以纯化的PCR弱产物为模
: 板，同样的引物来二次扩增，结果啥都扩不出来（以前也碰到过这种情况，这次是死马
: 当成活马医，结果还是一样）。引物往里面缩进10个碱基就能扩得很好。
: 不明白其中的道理，PCR指数扩增不就是以前一循环的产物为模板吗？为什么二次扩增
: 就不行了？
: 望各位不吝指教。

D*02013-01-23 08:01

4 楼

1. dilute template，
2. 如果不work，把引物往里设计，primer binding的时候不能perfect match到原来引
物位置。
3. 如果不purify PCR product，里面焦磷酸盐之类的会降低PCR specificity and
sensitivity。
4. qiagen hotstar kit for amplification。

【在 x**e 的大作中提到】

: 模板非常珍贵，而且已经用完了。PCR能扩出非常弱的条带。想以纯化的PCR弱产物为模
: 板，同样的引物来二次扩增，结果啥都扩不出来（以前也碰到过这种情况，这次是死马
: 当成活马医，结果还是一样）。引物往里面缩进10个碱基就能扩得很好。
: 不明白其中的道理，PCR指数扩增不就是以前一循环的产物为模板吗？为什么二次扩增
: 就不行了？
: 望各位不吝指教。

x*e2013-01-23 08:01

5 楼

1/10000？我试过1/10稀释，以为够稀的了，因为条带本来就很弱，过柱纯化后就更少
了，结果没出来。我再试试更稀的看看。
我是用来构建载体的，引物是从ATG到TGA，所以也没办法往里面缩。
主要想不通的是其中的道理，PCR指数扩增不就是以前一循环的产物为模板吗？为什么
纯化后做模板就不行了呢？

s*y2013-01-23 08:01

6 楼

在我理解中，因为你的第一次的产品不是象你想像的那么纯的，而是有很多杂带，只不
过在胶上你不一定能看到而已。如果直接扩，一个常见的结果就是那些杂带扩得比你想
要的带更多，结果就成了一个均匀的smear, 所以你什么带都看不见了。

【在 x**e 的大作中提到】

: 模板非常珍贵，而且已经用完了。PCR能扩出非常弱的条带。想以纯化的PCR弱产物为模
: 板，同样的引物来二次扩增，结果啥都扩不出来（以前也碰到过这种情况，这次是死马
: 当成活马医，结果还是一样）。引物往里面缩进10个碱基就能扩得很好。
: 不明白其中的道理，PCR指数扩增不就是以前一循环的产物为模板吗？为什么二次扩增
: 就不行了？
: 望各位不吝指教。

x*e2013-01-23 08:01

7 楼

因为不好扩，第一次用的是touch down，扩出约10条带，目标带3.2k比较弱，挖胶回收
后一起有20个ng。二次扩增没有看到smear，倒是有几条其他大小的杂带。

C*e2013-01-23 08:01

8 楼

说个不相干的
如果这个基因的序列已知
直接去合成吧
现在合成也没多少钱
而且挺快的

f*p2013-01-23 08:01

9 楼

为什么不做克隆呢？条带弱点没什么影响。

【在 x**e 的大作中提到】

: 模板非常珍贵，而且已经用完了。PCR能扩出非常弱的条带。想以纯化的PCR弱产物为模
: 板，同样的引物来二次扩增，结果啥都扩不出来（以前也碰到过这种情况，这次是死马
: 当成活马医，结果还是一样）。引物往里面缩进10个碱基就能扩得很好。
: 不明白其中的道理，PCR指数扩增不就是以前一循环的产物为模板吗？为什么二次扩增
: 就不行了？
: 望各位不吝指教。

d*l2013-01-23 08:01

10 楼

先把条带切出来，然后用gel purification kit纯化，然后再用普通的pcr
purification kit纯化，然后再做第二轮pcr
一定要两轮纯化

【在 x**e 的大作中提到】

: 模板非常珍贵，而且已经用完了。PCR能扩出非常弱的条带。想以纯化的PCR弱产物为模
: 板，同样的引物来二次扩增，结果啥都扩不出来（以前也碰到过这种情况，这次是死马
: 当成活马医，结果还是一样）。引物往里面缩进10个碱基就能扩得很好。
: 不明白其中的道理，PCR指数扩增不就是以前一循环的产物为模板吗？为什么二次扩增
: 就不行了？
: 望各位不吝指教。

C*e2013-01-23 08:01

11 楼

对了，条带弱一点也可以做TOPO blunt end cloning的
用电转化
应该没什么问题

x*e2013-01-23 08:01

12 楼

3k多的片段，合成的话应该很贵吧。
一起就10来个ng的产物，也试过上TOPO，因为酶切位点的保护碱基就用的cacc，用的买
的感受态，上不去，怀疑TOPO自身只有2.6k，装不下3k的东西

j*x2013-01-23 08:01

13 楼

3kb以上有专用的topo大片段kit

【在 x**e 的大作中提到】

: 3k多的片段，合成的话应该很贵吧。
: 一起就10来个ng的产物，也试过上TOPO，因为酶切位点的保护碱基就用的cacc，用的买
: 的感受态，上不去，怀疑TOPO自身只有2.6k，装不下3k的东西

N*n2013-01-23 08:01

14 楼

Can you raise your primers annealing temperature by extending a few more
bases? I had the experience with shorter primer and lower annealing
temperature without success. Increasing the length of primer as well as the
annealing temperature solved the problem. Good luck

m*u2013-01-23 08:01

15 楼

Is it a high GC template? If so, add DMSO to enhance the PCR efficiency.