请教baculovirus transfection# Biology - 生物学e*m2013-03-18 07:031 楼跟imac 27价格差不多甚至更高一点吧,这个有什么特殊之处么?屏幕很高级么?还是说这个一般都是有deal的时候才买的
A*w2013-03-18 07:032 楼最近在做baculovirus transfection一直做不出来用了两种不同的方法,一个是BD BaculoGold DNA + pVL1393-DNA.就是follow manual另一是Bac to Bac system, 用cellfectin II reagent。用的是Sf-21 conditioned in Sf-900II media (大于95%viability)怎么做都在5天transfection后看不到病态细胞然后amplification后也没有~请大牛指教!感谢!
n*32013-03-18 07:034 楼是不是根本就没有拿到recombinant baculovirus啊?我们做的时候7天以后Sf9 cells就好多死细胞了。Sf21应该也一样啊。“amplification后也没有”是什么意思?没有检测到目标蛋白基因的表达?
b*t2013-03-18 07:035 楼Outlet半价★ 发自iPhone App: ChineseWeb 8.2.2【在 e**********m 的大作中提到】: 跟imac 27价格差不多甚至更高一点吧,这个有什么特殊之处么?屏幕很高级么?还是: 说这个一般都是有deal的时候才买的
m*82013-03-18 07:036 楼一般来说这种情况就是BACMID DNA有问题。【在 A****w 的大作中提到】: 最近在做baculovirus transfection一直做不出来: 用了两种不同的方法,一个是BD BaculoGold DNA + pVL1393-DNA.: 就是follow manual: 另一是Bac to Bac system, 用cellfectin II reagent。: 用的是Sf-21 conditioned in Sf-900II media (大于95%viability): 怎么做都在5天transfection后看不到病态细胞: 然后amplification后也没有~: 请大牛指教!: 感谢!
A*w2013-03-18 07:037 楼BD BaculoGold DNA + pVL1393-DNA 那个没有bacmid prep的这一步bac to bac BACMID DNA用M13和目标基因的特异引物检测的,可以看到pcr产物,难道是transfection的量不够,用quick and dirty prep的。》》是不是根本就没有拿到recombinant baculovirus啊?我们做的时候7天以后Sf9cells就好多死细胞了。Sf21应该也一样啊。感觉是没有拿到baculovirus,细胞transfection 5-7天后,看不到涨大的病态细胞(或者和control差别不大)看不出来。。。有些时候看到是好多死细胞了,有的时候看起来还行。》》“amplification后也没有”是什么意思?没有检测到目标蛋白基因的表达?就是在transfection后,有这个supernatant去infect健康的细胞(在T75里)。然后看细胞形态,也做蛋白表达检测(western)
T*u2013-03-18 07:038 楼我当时做的时候也是第一代看不明显蛋白也测不到表达。但是我再去扩增第二代就有了。【在 A****w 的大作中提到】: BD BaculoGold DNA + pVL1393-DNA 那个没有bacmid prep的这一步: bac to bac BACMID DNA用M13和目标基因的特异引物检测的,可以看到pcr产物,难道: 是transfection的量不够,用quick and dirty prep的。: 》》是不是根本就没有拿到recombinant baculovirus啊?我们做的时候7天以后Sf9: cells: 就好多死细胞了。Sf21应该也一样啊。: 感觉是没有拿到baculovirus,细胞transfection 5-7天后,看不到涨大的病态细胞(: 或者和control差别不大)看不出来。。。: 有些时候看到是好多死细胞了,有的时候看起来还行。: 》》“amplification后也没有”是什么意思?没有检测到目标蛋白基因的表达?
B*a2013-03-18 07:039 楼bac to bac一大早提fresh的bacmid你加8-10ug 的bacmid DNA (因为bacmid不会很纯)等72个小时,~2ml 的P1 全用来做一盘子P2
A*w2013-03-18 07:0310 楼请问你的bac to bac提取的方法是啥?是不是我上面提及的quick-and-dirty的方法还是用kit的啊?【在 B*****a 的大作中提到】: bac to bac: 一大早提fresh的bacmid: 你加8-10ug 的bacmid DNA (因为bacmid不会很纯): 等72个小时,~2ml 的P1 全用来做一盘子P2
B*a2013-03-18 07:0311 楼MINIprep buffer I II III, 然后直接异丙醇沉淀, 不用column提纯【在 A****w 的大作中提到】: 请问你的bac to bac提取的方法是啥?: 是不是我上面提及的quick-and-dirty的方法: 还是用kit的啊?
B*a2013-03-18 07:0312 楼还有bacmid到P1,这步过了72h,infection不是很明显,但是P1到P2这步>48小时,会比较明显。真跟你的bacmid有没有insertion没有关系,全看titer【在 A****w 的大作中提到】: 请问你的bac to bac提取的方法是啥?: 是不是我上面提及的quick-and-dirty的方法: 还是用kit的啊?
I*y2013-03-18 07:0313 楼get the PureLink kit to purify Bacmid【在 A****w 的大作中提到】: 请问你的bac to bac提取的方法是啥?: 是不是我上面提及的quick-and-dirty的方法: 还是用kit的啊?
S*r2013-03-18 07:0314 楼说的没错,bac to bac很有可能P1和P2的细胞形变都不明显。可以像上面某位说的那样,P1全部用来做P2,做P3的时候多加P2。P1,P2,P3的细胞都可以直接western,就知道蛋白是否表达。【在 B*****a 的大作中提到】: 还有bacmid到P1,这步过了72h,infection不是很明显,但是P1到P2这步>48小时,会比: 较明显。: 真跟你的bacmid有没有insertion没有关系,全看titer
b*e2013-03-18 07:0315 楼P1看不到很正常你试试把2ml P1(3-4天)扔进10ml Sf9里,没隔一天查一次cell density如果cell density加倍了就加midium稀释回2m这样养4-5天看看,只要cell density不加倍了就说明成功了另外cellfectin II reagent加多点,bacmid浓度大一些【在 A****w 的大作中提到】: 最近在做baculovirus transfection一直做不出来: 用了两种不同的方法,一个是BD BaculoGold DNA + pVL1393-DNA.: 就是follow manual: 另一是Bac to Bac system, 用cellfectin II reagent。: 用的是Sf-21 conditioned in Sf-900II media (大于95%viability): 怎么做都在5天transfection后看不到病态细胞: 然后amplification后也没有~: 请大牛指教!: 感谢!
x*22013-03-18 07:0317 楼http://www.wistar.org/our-science/shared-resources-cores/protei实在不放心,把bacmid送去让他们transfect,之后送300ml P3给你,300刀一次
b*e2013-03-18 07:0318 楼300ml P3 也就infect 15-20L 的cell, 这生意不错,呵呵【在 x**2 的大作中提到】: http://www.wistar.org/our-science/shared-resources-cores/protei: 实在不放心,把bacmid送去让他们transfect,之后送300ml P3给你,300刀一次