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请教baculovirus transfection
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请教baculovirus transfection# Biology - 生物学
e*m
1
跟imac 27价格差不多甚至更高一点吧,这个有什么特殊之处么?屏幕很高级么?还是
说这个一般都是有deal的时候才买的
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A*w
2
最近在做baculovirus transfection一直做不出来
用了两种不同的方法,一个是BD BaculoGold DNA + pVL1393-DNA.
就是follow manual
另一是Bac to Bac system, 用cellfectin II reagent。
用的是Sf-21 conditioned in Sf-900II media (大于95%viability)
怎么做都在5天transfection后看不到病态细胞
然后amplification后也没有~
请大牛指教!
感谢!
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X*n
3
因为xps欢迎摸
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n*3
4
是不是根本就没有拿到recombinant baculovirus啊?我们做的时候7天以后Sf9 cells
就好多死细胞了。Sf21应该也一样啊。
“amplification后也没有”是什么意思?没有检测到目标蛋白基因的表达?
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b*t
5
Outlet半价

★ 发自iPhone App: ChineseWeb 8.2.2

【在 e**********m 的大作中提到】
: 跟imac 27价格差不多甚至更高一点吧,这个有什么特殊之处么?屏幕很高级么?还是
: 说这个一般都是有deal的时候才买的

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m*8
6

一般来说这种情况就是BACMID DNA有问题。

【在 A****w 的大作中提到】
: 最近在做baculovirus transfection一直做不出来
: 用了两种不同的方法,一个是BD BaculoGold DNA + pVL1393-DNA.
: 就是follow manual
: 另一是Bac to Bac system, 用cellfectin II reagent。
: 用的是Sf-21 conditioned in Sf-900II media (大于95%viability)
: 怎么做都在5天transfection后看不到病态细胞
: 然后amplification后也没有~
: 请大牛指教!
: 感谢!

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A*w
7
BD BaculoGold DNA + pVL1393-DNA 那个没有bacmid prep的这一步
bac to bac BACMID DNA用M13和目标基因的特异引物检测的,可以看到pcr产物,难道
是transfection的量不够,用quick and dirty prep的。
》》是不是根本就没有拿到recombinant baculovirus啊?我们做的时候7天以后Sf9
cells
就好多死细胞了。Sf21应该也一样啊。
感觉是没有拿到baculovirus,细胞transfection 5-7天后,看不到涨大的病态细胞(
或者和control差别不大)看不出来。。。
有些时候看到是好多死细胞了,有的时候看起来还行。
》》“amplification后也没有”是什么意思?没有检测到目标蛋白基因的表达?
就是在transfection后,有这个supernatant去infect健康的细胞(在T75里)。然后看
细胞形态,也做蛋白表达检测(western)
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T*u
8
我当时做的时候也是第一代看不明显蛋白也测不到表达。但是我再去扩增第二代就有了。

【在 A****w 的大作中提到】
: BD BaculoGold DNA + pVL1393-DNA 那个没有bacmid prep的这一步
: bac to bac BACMID DNA用M13和目标基因的特异引物检测的,可以看到pcr产物,难道
: 是transfection的量不够,用quick and dirty prep的。
: 》》是不是根本就没有拿到recombinant baculovirus啊?我们做的时候7天以后Sf9
: cells
: 就好多死细胞了。Sf21应该也一样啊。
: 感觉是没有拿到baculovirus,细胞transfection 5-7天后,看不到涨大的病态细胞(
: 或者和control差别不大)看不出来。。。
: 有些时候看到是好多死细胞了,有的时候看起来还行。
: 》》“amplification后也没有”是什么意思?没有检测到目标蛋白基因的表达?

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B*a
9
bac to bac
一大早提fresh的bacmid
你加8-10ug 的bacmid DNA (因为bacmid不会很纯)
等72个小时,~2ml 的P1 全用来做一盘子P2
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A*w
10
请问你的bac to bac提取的方法是啥?
是不是我上面提及的quick-and-dirty的方法
还是用kit的啊?

【在 B*****a 的大作中提到】
: bac to bac
: 一大早提fresh的bacmid
: 你加8-10ug 的bacmid DNA (因为bacmid不会很纯)
: 等72个小时,~2ml 的P1 全用来做一盘子P2

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B*a
11
MINIprep buffer I II III, 然后直接异丙醇沉淀, 不用column提纯

【在 A****w 的大作中提到】
: 请问你的bac to bac提取的方法是啥?
: 是不是我上面提及的quick-and-dirty的方法
: 还是用kit的啊?

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B*a
12
还有bacmid到P1,这步过了72h,infection不是很明显,但是P1到P2这步>48小时,会比
较明显。
真跟你的bacmid有没有insertion没有关系,全看titer

【在 A****w 的大作中提到】
: 请问你的bac to bac提取的方法是啥?
: 是不是我上面提及的quick-and-dirty的方法
: 还是用kit的啊?

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I*y
13
get the PureLink kit to purify Bacmid

【在 A****w 的大作中提到】
: 请问你的bac to bac提取的方法是啥?
: 是不是我上面提及的quick-and-dirty的方法
: 还是用kit的啊?

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S*r
14
说的没错,bac to bac很有可能P1和P2的细胞形变都不明显。可以像上面某位说的那样
,P1全部用来做P2,做P3的时候多加P2。
P1,P2,P3的细胞都可以直接western,就知道蛋白是否表达。

【在 B*****a 的大作中提到】
: 还有bacmid到P1,这步过了72h,infection不是很明显,但是P1到P2这步>48小时,会比
: 较明显。
: 真跟你的bacmid有没有insertion没有关系,全看titer

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b*e
15
P1看不到很正常
你试试把2ml P1(3-4天)扔进10ml Sf9里,没隔一天查一次cell density
如果cell density加倍了就加midium稀释回2m
这样养4-5天看看,只要cell density不加倍了就说明成功了
另外cellfectin II reagent加多点,bacmid浓度大一些

【在 A****w 的大作中提到】
: 最近在做baculovirus transfection一直做不出来
: 用了两种不同的方法,一个是BD BaculoGold DNA + pVL1393-DNA.
: 就是follow manual
: 另一是Bac to Bac system, 用cellfectin II reagent。
: 用的是Sf-21 conditioned in Sf-900II media (大于95%viability)
: 怎么做都在5天transfection后看不到病态细胞
: 然后amplification后也没有~
: 请大牛指教!
: 感谢!

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A*w
16
好,谢谢各位建议。
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