跪求用TRIZOL提取gDNA的高效办法，苦恼纠结打滚哭喊中# Biology - 生物学
y*u
1 楼
近必须要用Trizol提取组织里的gDNA.第一次跟着Trizol公司的protocol走浓度很低质
量很差。第二次改进了方法测出浓度较高，质量很差，然后用NACL和酒精简单洗了后浓
度低极了，质量好了。现在我采取了一个改进的TRIZOL提DNA方法，但是由于方法说明
比较模糊，所以试着做了下，DNA浓度低，质量差。
这个新方法:移除TRIZOL-CHLOROFORM分层出的上清RNA后，在有机层中加入1/10体积的
10% SDS和1/2体积的5M NACL.混匀后离心12,000rpm.这样得出肉眼可见的三层（上清，
中间一层白色物质，下层的粉色物质）。根据别人发表的PAPER上的说明是移用上清，
所以我就抽取上清加入95%冷酒精，-80°C 15分钟后高速离心沉淀。后续就是和原始的
TRIZOL protocol一样的的柠檬酸钠和75%酒精沉淀清洗，结果没有看到DNA白色沉淀，
测试后发现DNA质量差，浓度很低很低低低。我就用水做BLANK,测了下我保留下来的中
间一层白色物质（一开始以为上清是DNA),结果发现DNA浓度很高，质量也行。我怀疑
DNA根本就不在上清里面，而是在中间一层的白色物质内（这边有个疑问点就是这个白
色物质是在TRIZOL,CHLOROFORM,SDS, NACL里面，所以这些chemicals对NANO DROP影响
有多大，是否我测出的读数根本不就不是DNA).
我现在有个选择：
我已经保留了那个移去上清的管（内有中层白色物质和下层粉红物质）。我打算照着
TRIZOL原始的PROTOCOL用100%酒精沉淀DNA(如果那层白色物质真的是DNA的话），然后
用柠檬酸钠和75%酒精沉淀清洗DNA.
现在的疑问是：
1. 那个中间层白色物质是否是DNA
2. 白色物质是在TRIZOL,CHLOROFORM,SDS, NACL里面,我用100%酒精是否能沉淀出DNA
3. 原始PROTOCOL要求轻柔混匀，用2,000g为DNA沉淀清洗。我改为12,000g后效果很好
。现在我看了一个PROTOCOL(VU MEDISCH CENTRUM)DNA提取过程直接用VORTEX剧烈震荡
混匀，加速到20,000g.请问这样效果会好吗，DNA震成这样不散架了么？
4.我后续是做测序。
请各位大神赐教，小女子不胜感激。比较啰嗦。但是真的很苦恼，因为标本珍贵，是在
不容许一试再试。
量很差。第二次改进了方法测出浓度较高，质量很差，然后用NACL和酒精简单洗了后浓
度低极了，质量好了。现在我采取了一个改进的TRIZOL提DNA方法，但是由于方法说明
比较模糊，所以试着做了下，DNA浓度低，质量差。
这个新方法:移除TRIZOL-CHLOROFORM分层出的上清RNA后，在有机层中加入1/10体积的
10% SDS和1/2体积的5M NACL.混匀后离心12,000rpm.这样得出肉眼可见的三层（上清，
中间一层白色物质，下层的粉色物质）。根据别人发表的PAPER上的说明是移用上清，
所以我就抽取上清加入95%冷酒精，-80°C 15分钟后高速离心沉淀。后续就是和原始的
TRIZOL protocol一样的的柠檬酸钠和75%酒精沉淀清洗，结果没有看到DNA白色沉淀，
测试后发现DNA质量差，浓度很低很低低低。我就用水做BLANK,测了下我保留下来的中
间一层白色物质（一开始以为上清是DNA),结果发现DNA浓度很高，质量也行。我怀疑
DNA根本就不在上清里面，而是在中间一层的白色物质内（这边有个疑问点就是这个白
色物质是在TRIZOL,CHLOROFORM,SDS, NACL里面，所以这些chemicals对NANO DROP影响
有多大，是否我测出的读数根本不就不是DNA).
我现在有个选择：
我已经保留了那个移去上清的管（内有中层白色物质和下层粉红物质）。我打算照着
TRIZOL原始的PROTOCOL用100%酒精沉淀DNA(如果那层白色物质真的是DNA的话），然后
用柠檬酸钠和75%酒精沉淀清洗DNA.
现在的疑问是：
1. 那个中间层白色物质是否是DNA
2. 白色物质是在TRIZOL,CHLOROFORM,SDS, NACL里面,我用100%酒精是否能沉淀出DNA
3. 原始PROTOCOL要求轻柔混匀，用2,000g为DNA沉淀清洗。我改为12,000g后效果很好
。现在我看了一个PROTOCOL(VU MEDISCH CENTRUM)DNA提取过程直接用VORTEX剧烈震荡
混匀，加速到20,000g.请问这样效果会好吗，DNA震成这样不散架了么？
4.我后续是做测序。
请各位大神赐教，小女子不胜感激。比较啰嗦。但是真的很苦恼，因为标本珍贵，是在
不容许一试再试。
