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请教个酵母相关问题。

请教个酵母相关问题。# Biology - 生物学

H*s2014-05-23 07:05

1 楼

从酵母里提到的质粒几乎必须用电转的方法才能转到细菌里面去，并且过夜生长后的菌
落形态非常小，是什么原因？有没有可以化学转化到细菌里面的方法可以用一下？谢谢
了。

X*n2014-05-23 07:05

2 楼

你要改变你从酵母里面提质粒的方法，而不是细菌的转化方法。
加入P1buffer后一定要用beads打破酵母的细胞壁。

H*s2014-05-23 07:05

3 楼

老大，我就是这么做的呀。

【在 X******n 的大作中提到】

: 你要改变你从酵母里面提质粒的方法，而不是细菌的转化方法。
: 加入P1buffer后一定要用beads打破酵母的细胞壁。

X*n2014-05-23 07:05

4 楼

估计你细胞壁破的不够。

s*n2014-05-23 07:05

5 楼

用电转也没啥不好的吧？

H*s2014-05-23 07:05

6 楼

加了酸洗的玻璃珠和裂解液之后，在振荡器上自动振了10分钟（最大速度）。应该不存
在细胞壁破裂不够的问题。再说，用细胞壁破的不够，可以解释为什么化学转化不成功
（因为产量低）。但是没法子解释为什么菌落特别小呀。
老大，看来您是高手，能不能分享一下你的protocol？谢了。

【在 X******n 的大作中提到】

: 估计你细胞壁破的不够。

H*s2014-05-23 07:05

7 楼

这不是好奇吗。越想越觉得好奇。查了文献，有的文献里提到了这么一两句，但是不足
以解决心里的疑问。

【在 s********n 的大作中提到】

: 用电转也没啥不好的吧？

s*n2014-05-23 07:05

8 楼

E. coli的菌落小？

【在 H****s 的大作中提到】

: 加了酸洗的玻璃珠和裂解液之后，在振荡器上自动振了10分钟（最大速度）。应该不存
: 在细胞壁破裂不够的问题。再说，用细胞壁破的不够，可以解释为什么化学转化不成功
: （因为产量低）。但是没法子解释为什么菌落特别小呀。
: 老大，看来您是高手，能不能分享一下你的protocol？谢了。

w*y2014-05-23 07:05

9 楼

从酵母里提的质粒一般量比较低，所以要用高效率的感受态细胞，用top10转效果比较
好。

【在 H****s 的大作中提到】

: 从酵母里提到的质粒几乎必须用电转的方法才能转到细菌里面去，并且过夜生长后的菌
: 落形态非常小，是什么原因？有没有可以化学转化到细菌里面的方法可以用一下？谢谢
: 了。

s*r2014-05-23 07:05

10 楼

小菌落里的质粒弄出来看看还对不对，可能质粒在酵母里吧e coli的origin抗性啥的弄
丢了

【在 H****s 的大作中提到】

j*n2014-05-23 07:05

11 楼

我们实验室就是做酵母的
这个问题经常发现
刚开始怀疑是目标蛋白对 e coli有毒性很多yeast promoter在e coli都有不同程度的
活性
后来发现即使有stop codon mutation的也存在相同问题
共同的结果就是过夜抽提得到plasmid 浓度非常低经常低于50 ng/ul
至于原因不清楚
目前

★ 发自iPhone App: ChineseWeb 8.7

【在 H****s 的大作中提到】

j*n2014-05-23 07:05

12 楼

我们试过不少方法，有些效果比较明显
1 NEB turbo比top 10好然后比dh5a好
2 可以试试用30甚至更低的温度，包括recover，inoculation, and liquid culture
Good luck
我最感兴趣的还是这个原因。老板说是所谓的toxic dna，就是plasmid dna形成某种特
殊的结构，然后形成 e coli toxicity 不过没看过这方便的文章。苦于没时间做更深
入的研究。。。
欢迎高手指点。。。

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【在 j****n 的大作中提到】

: 我们实验室就是做酵母的
: 这个问题经常发现
: 刚开始怀疑是目标蛋白对 e coli有毒性很多yeast promoter在e coli都有不同程度的
: 活性
: 后来发现即使有stop codon mutation的也存在相同问题
: 共同的结果就是过夜抽提得到plasmid 浓度非常低经常低于50 ng/ul
: 至于原因不清楚
: 目前
:
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j*n2014-05-23 07:05

13 楼

应该不是转化方法的问题
20k以下的plasmid 电转/热转区别不明显
30k以上的貌似要电转？至少我没做出来过，哈哈毕竟yeast抽出来plasmid 质量太差

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【在 H****s 的大作中提到】

s*x2014-05-23 07:05

14 楼

菌落小肯定是毒性问题，和dna量没关系。
换载体或者换个酵母治理试试。

H*s2014-05-23 07:05

15 楼

小菌落都是对的，和抗性丢失没有什么关系。

【在 s******r 的大作中提到】

: 小菌落里的质粒弄出来看看还对不对，可能质粒在酵母里吧e coli的origin抗性啥的弄
: 丢了

H*s2014-05-23 07:05

16 楼

转化过夜生长后，菌落在平板上如针尖大小，长24小时，菌落形态也很小。

【在 s********n 的大作中提到】

: E. coli的菌落小？

H*s2014-05-23 07:05

17 楼

握手。
toxic dna这个假设我在一篇文献里面看到过，只是说有可能是酵母genomic DNA所带来
的毒性。没有看到什么实验证据。

【在 j****n 的大作中提到】

: 我们试过不少方法，有些效果比较明显
: 1 NEB turbo比top 10好然后比dh5a好
: 2 可以试试用30甚至更低的温度，包括recover，inoculation, and liquid culture
: Good luck
: 我最感兴趣的还是这个原因。老板说是所谓的toxic dna，就是plasmid dna形成某种特
: 殊的结构，然后形成 e coli toxicity 不过没看过这方便的文章。苦于没时间做更深
: 入的研究。。。
: 欢迎高手指点。。。
:
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H*s2014-05-23 07:05

18 楼

应该和载体没有关系，因为转到细菌里后从细菌里小提的质粒就没有这个现象了，肯定
和酵母有关。

【在 s********x 的大作中提到】

: 菌落小肯定是毒性问题，和dna量没关系。
: 换载体或者换个酵母治理试试。

h*r2014-05-23 07:05

19 楼

我是门外汉。很有意思的现象。质粒DNA被酵母修饰了？