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连接产物当PCR模板
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连接产物当PCR模板# Biology - 生物学
c*n
1 楼
【 以下文字转载自 SanDiego 讨论区 】
发信人: crazyman (嘉天之锡), 信区: SanDiego
标 题: 这次大地震是不是就是传说中overdue的那个
发信站: BBS 未名空间站 (Sun Apr 4 22:49:33 2010, 美东)
是不是墨西哥人倒霉了, 然后美国人这边安稳了, 下次又要等100年了吧
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m*8
2 楼
有谁用PCR产物连接T载体后直接用来做下一轮PCR的模板吗？引物设计在插入片段的两
端。会不会在PCR过程中因为有nick而断裂？
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u*r
3 楼
应该可以的
断裂的PCR放不出来，只会放大连接进去的
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s*s
4 楼
太多了，没问题

【在 m******8 的大作中提到】
: 有谁用PCR产物连接T载体后直接用来做下一轮PCR的模板吗？引物设计在插入片段的两
: 端。会不会在PCR过程中因为有nick而断裂？
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j*n
5 楼
技术上没问题
运气不好 要是有些template有mutation 不就挂了？
做ta cloning的目的之一就是sequencing吧？

★ 发自iPhone App: ChineseWeb 8.7

【在 m******8 的大作中提到】
: 有谁用PCR产物连接T载体后直接用来做下一轮PCR的模板吗？引物设计在插入片段的两
: 端。会不会在PCR过程中因为有nick而断裂？
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j*n
6 楼
我记得很多年前 刚接触分子克隆的时候
老板说的第一句话就是禁止用pcr产物做下一轮pcr template
貌似你这个也差不多吧？

★ 发自iPhone App: ChineseWeb 8.7

【在 m******8 的大作中提到】
: 有谁用PCR产物连接T载体后直接用来做下一轮PCR的模板吗？引物设计在插入片段的两
: 端。会不会在PCR过程中因为有nick而断裂？
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e*s
7 楼
你老板这么说依据是啥？感觉不科学。
我反正动不动就拿PCR产物进一步扩增。

【在 j****n 的大作中提到】
: 我记得很多年前 刚接触分子克隆的时候
: 老板说的第一句话就是禁止用pcr产物做下一轮pcr template
: 貌似你这个也差不多吧？
:
: ★ 发自iPhone App: ChineseWeb 8.7
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j*n
8 楼
Mutation 而且pcr过程会被放大
如果target gene表达会导致细胞毒性，mutation在进一步被富集。。。

★ 发自iPhone App: ChineseWeb 8.7

【在 e****s 的大作中提到】
: 你老板这么说依据是啥？感觉不科学。
: 我反正动不动就拿PCR产物进一步扩增。
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t*z
9 楼
如果还用原来的引物，是扩不出来的。要用nested primers。

【在 e****s 的大作中提到】
: 你老板这么说依据是啥？感觉不科学。
: 我反正动不动就拿PCR产物进一步扩增。
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j*n
10 楼
？还有这问题？不太可能吧 哈哈

★ 发自iPhone App: ChineseWeb 8.7

【在 t*****z 的大作中提到】
: 如果还用原来的引物，是扩不出来的。要用nested primers。
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t*z
11 楼
这是我自己的经验。

【在 j****n 的大作中提到】
: ？还有这问题？不太可能吧 哈哈
:
: ★ 发自iPhone App: ChineseWeb 8.7
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j*n
12 楼
个别例子 还是？
我们做OE-pcr 一般都没用新的primer
也没出过啥问题。。。

★ 发自iPhone App: ChineseWeb 8.7

【在 t*****z 的大作中提到】
: 这是我自己的经验。
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t*z
13 楼
我是做MLST，用的是普通Taq酶，我试验过几个基因和几组引物都不行，一点点产物都
没有。
OE-PCR，如果我理解没错的话，用的不是原来的引物，而是跟原来互补的引物吧？

【在 j****n 的大作中提到】
: 个别例子 还是？
: 我们做OE-pcr 一般都没用新的primer
: 也没出过啥问题。。。
:
: ★ 发自iPhone App: ChineseWeb 8.7
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j*n
14 楼
我们都是直接用fragment1-F 和fragment2-R 貌似也没出过啥问题

★ 发自iPhone App: ChineseWeb 8.7

【在 t*****z 的大作中提到】
: 我是做MLST，用的是普通Taq酶，我试验过几个基因和几组引物都不行，一点点产物都
: 没有。
: OE-PCR，如果我理解没错的话，用的不是原来的引物，而是跟原来互补的引物吧？
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t*z
15 楼
你试试fragment1-F和fragment1-R，看看会怎样？

【在 j****n 的大作中提到】
: 我们都是直接用fragment1-F 和fragment2-R 貌似也没出过啥问题
:
: ★ 发自iPhone App: ChineseWeb 8.7
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b*e
16 楼
nested primer 更好。但是原本的primer也是可以扩出来的。可以换不同的酶试试，各
个公司差很多，而且对于扩增的片段大小不同，各个酶也不太一样。
我比较喜欢用clontech 的 primestar HS。

【在 t*****z 的大作中提到】
: 如果还用原来的引物，是扩不出来的。要用nested primers。
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t*z
17 楼
这样啊，看来是我的PCR条件太不够优化了，呵呵呵

【在 b*********e 的大作中提到】
: nested primer 更好。但是原本的primer也是可以扩出来的。可以换不同的酶试试，各
: 个公司差很多，而且对于扩增的片段大小不同，各个酶也不太一样。
: 我比较喜欢用clontech 的 primestar HS。
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