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蛋白lysis buffer 含有8M urea电泳前需要加热吗？

蛋白lysis buffer 含有8M urea电泳前需要加热吗？# Biology - 生物学

y*i2015-05-28 07:05

1 楼

刚刚在petco买了一dozen的cricket用来养spider的
买好以后放在车里逛mall
逛了三个小时出来时发现下雪了~~~~雪很大
我有点担心小小的cricket在车里姓名攸关
看看他们。。不动了！！！！郁闷诶！
明儿过节了商店都关门了 spider会饿的呃= =
把cricket很绝望的拿回家里
看电视
看到一半听到蛐蛐蛐蛐的叫声
哇！原来cricket都复活了！！！
哈哈哈
spider不用饿了！
大家以后买cricket的时候如果发现他们不动了也许是冻僵了别急着扔掉他们哦不
然在野外就真的冷死而不是冻僵而已了！
bless！
圣诞快乐！

d*i2015-05-28 07:05

2 楼

身边不同人意见不同。。。。。。。谢谢！
目的是裂解细胞抽取蛋白做western。buffer里还有SDS, GLYCEROL.

i*a2015-05-28 07:05

3 楼

加热也不多。

【在 d****i 的大作中提到】

: 身边不同人意见不同。。。。。。。谢谢！
: 目的是裂解细胞抽取蛋白做western。buffer里还有SDS, GLYCEROL.

d*i2015-05-28 07:05

4 楼

不多是什么意思？

【在 i**********a 的大作中提到】

: 加热也不多。

m*y2015-05-28 07:05

5 楼

意思就是加热不加热关系都不大

【在 d****i 的大作中提到】

:
: 不多是什么意思？

j*92015-05-28 07:05

6 楼

不需要加热Z

d*i2015-05-28 07:05

7 楼

好吧，谢谢大家。看了都倾向于不加热。

s*y2015-05-28 07:05

8 楼

需要加热，不然的话细胞里释放出来的DNA 会把溶液搞得非常的粘

【在 d****i 的大作中提到】

: 身边不同人意见不同。。。。。。。谢谢！
: 目的是裂解细胞抽取蛋白做western。buffer里还有SDS, GLYCEROL.

d*i2015-05-28 07:05

9 楼

DNA我想用sonicate打碎。据说尿素加热分解会影响蛋白修饰。周围人说法不一。

【在 s******y 的大作中提到】

: 需要加热，不然的话细胞里释放出来的DNA 会把溶液搞得非常的粘

s*y2015-05-28 07:05

10 楼

是的，尿素加热会影响蛋白修饰。主要是有些修饰会产生化学反应。

【在 d****i 的大作中提到】

:
: DNA我想用sonicate打碎。据说尿素加热分解会影响蛋白修饰。周围人说法不一。

K*S2015-05-28 07:05

11 楼

don't do 95 degree or boiling, control the temperature under 60 and you will
be fine.

【在 d****i 的大作中提到】

:
: DNA我想用sonicate打碎。据说尿素加热分解会影响蛋白修饰。周围人说法不一。

f*d2015-05-28 07:05

12 楼

哦？那么heating之后DNA就沉淀了还是断了呢？

【在 s******y 的大作中提到】

: 需要加热，不然的话细胞里释放出来的DNA 会把溶液搞得非常的粘

d*i2015-05-28 07:05

13 楼

配尿素溶液时候说是不能超过37度，你这里说60是怎么回事？
[在 KingofMS (你太有才了) 的大作中提到：]
：don't do 95 degree or boiling, control the temperature under 60 and
you will be fine.
：
：...........

r*82015-05-28 07:05

14 楼

有SDS必须加热到95C,或者沸水浴5分钟。
目的是把蛋白质变为单链。
跟尿素没关系。

d*i2015-05-28 07:05

15 楼

尿素不是可以变性吗？
[在 rabbit8 (兔子) 的大作中提到：]
：
：有SDS必须加热到95C,或者沸水浴5分钟。
：...........

K*S2015-05-28 07:05

16 楼

Urea will cause carbamylation of protein/peptides which is usually related
to temperature and freshness of Urea. Rule of thumb is below 60 degree the
reaction is pretty slow. 37 is definitely too conservative.

【在 d****i 的大作中提到】

: 配尿素溶液时候说是不能超过37度，你这里说60是怎么回事？
: [在 KingofMS (你太有才了) 的大作中提到：]
: ：don't do 95 degree or boiling, control the temperature under 60 and
: you will be fine.
: ：
: ：...........

v*m2015-05-28 07:05

17 楼

顶。做蛋白修饰质谱分析的同修说得靠谱。

【在 K******S 的大作中提到】

: Urea will cause carbamylation of protein/peptides which is usually related
: to temperature and freshness of Urea. Rule of thumb is below 60 degree the
: reaction is pretty slow. 37 is definitely too conservative.

d*i2015-05-28 07:05

18 楼

western做出来了，发现在我手里8M urea不能迅速灭活蛋白修饰酶，我需要的PTM都没
有，阳性对照也没有。正在找原因。

K*52015-05-28 07:05

19 楼

还用这么传统办法提蛋白？有spin column based kit。一两分钟搞定，几乎不会有大
genomic DNA，上胶前要加热的。

【在 d****i 的大作中提到】

: western做出来了，发现在我手里8M urea不能迅速灭活蛋白修饰酶，我需要的PTM都没
: 有，阳性对照也没有。正在找原因。

d*i2015-05-28 07:05

20 楼

目的不是去除genomic DNA，是让蛋白迅速变性。

【在 K******5 的大作中提到】

: 还用这么传统办法提蛋白？有spin column based kit。一两分钟搞定，几乎不会有大
: genomic DNA，上胶前要加热的。

i*12015-05-28 07:05

21 楼

这帖子还没沉？
这问题不清楚。到底要跑胶看啥？8M urea 不足以denature所有的protein，特别是好
多酶类，所以很多的modification你都看不到了, 比如phosphorylation,
ubiquitination等. 可以75C左右加热5~10分钟，有carbamylation 和其他
modification产生，但总量不到~5%，大部分protein还在。总之，具体问题具体分析。