v*t
2 楼
最近从某公司订了synthesized peptide,但是似乎不纯。
请问如何确定50aa左右的peptide的纯度?
谢谢!!
请问如何确定50aa左右的peptide的纯度?
谢谢!!
v*t
6 楼
Mass spec 可以吗?
m*1
7 楼
how about the point? will the point keep the same ?
C*T
12 楼
LCMS 和HPLC 都只能大致判断peptide的纯度,无法定量。
这两种方法(LC和HPLC)是依靠紫外峰估算peptide的含量。很多时候样品里的salt
and small molecule impurity不能依靠紫外吸收分析。业界认可的定量方法是楼上说
的AAA analysis。所谓 75%, 90% peptide content, 指的是AAA analysis 得到的数
据。
一个peptide经过HPLC提纯,看似纯度达到95%,做一下AAA analysis,发现peptide
content 只有50%,是很常见的事情。
不过楼上的样品,根据MS谱图来看,没有做AAA analysis的价值,太不纯了。50AA左右
的多肽,应该只有四五个峰。机器灵敏度不高的话,一般就是两三个峰。
这两种方法(LC和HPLC)是依靠紫外峰估算peptide的含量。很多时候样品里的salt
and small molecule impurity不能依靠紫外吸收分析。业界认可的定量方法是楼上说
的AAA analysis。所谓 75%, 90% peptide content, 指的是AAA analysis 得到的数
据。
一个peptide经过HPLC提纯,看似纯度达到95%,做一下AAA analysis,发现peptide
content 只有50%,是很常见的事情。
不过楼上的样品,根据MS谱图来看,没有做AAA analysis的价值,太不纯了。50AA左右
的多肽,应该只有四五个峰。机器灵敏度不高的话,一般就是两三个峰。
v*t
13 楼
多谢!
哪个公司的service比较好?
哪个公司的service比较好?
v*m
15 楼
公司合成时会出specification,AAA通常是做过的,会给出(weight of多肽/weight of
样品)的纯度。那些一起干燥出来的小分子如醋酸盐等都会加重样品的表观重量。这个
只会对绝对浓度有影响,另外小分子对后续的生物实验影响不大,透析一下就可去除。
我觉得LZ应该是更关心多肽内部的纯度,合成步骤多时肯定有一些会少掉某些AA,那些
多肽杂质如果太多,会影响后续的生物研究。此类杂质只能用RP-HPLC鉴定,LCMS能更
一步的定性多肽杂质。这些多肽杂质和目的多肽性质理化接近,只能过制备柱进一步纯
化。
LZ的质谱图貌似MALDI-TOF,这个质谱样品的matrix非常杂,有些杂质也许是样品本身
带的,也可能是学校的facility质谱机器太脏导致的。如果能走LC-ESI-QTOF或TOF,基
本能确定多肽杂质在总多肽里所占的比例。
【在 C******T 的大作中提到】
: LCMS 和HPLC 都只能大致判断peptide的纯度,无法定量。
: 这两种方法(LC和HPLC)是依靠紫外峰估算peptide的含量。很多时候样品里的salt
: and small molecule impurity不能依靠紫外吸收分析。业界认可的定量方法是楼上说
: 的AAA analysis。所谓 75%, 90% peptide content, 指的是AAA analysis 得到的数
: 据。
: 一个peptide经过HPLC提纯,看似纯度达到95%,做一下AAA analysis,发现peptide
: content 只有50%,是很常见的事情。
: 不过楼上的样品,根据MS谱图来看,没有做AAA analysis的价值,太不纯了。50AA左右
: 的多肽,应该只有四五个峰。机器灵敏度不高的话,一般就是两三个峰。
样品)的纯度。那些一起干燥出来的小分子如醋酸盐等都会加重样品的表观重量。这个
只会对绝对浓度有影响,另外小分子对后续的生物实验影响不大,透析一下就可去除。
我觉得LZ应该是更关心多肽内部的纯度,合成步骤多时肯定有一些会少掉某些AA,那些
多肽杂质如果太多,会影响后续的生物研究。此类杂质只能用RP-HPLC鉴定,LCMS能更
一步的定性多肽杂质。这些多肽杂质和目的多肽性质理化接近,只能过制备柱进一步纯
化。
LZ的质谱图貌似MALDI-TOF,这个质谱样品的matrix非常杂,有些杂质也许是样品本身
带的,也可能是学校的facility质谱机器太脏导致的。如果能走LC-ESI-QTOF或TOF,基
本能确定多肽杂质在总多肽里所占的比例。
【在 C******T 的大作中提到】
: LCMS 和HPLC 都只能大致判断peptide的纯度,无法定量。
: 这两种方法(LC和HPLC)是依靠紫外峰估算peptide的含量。很多时候样品里的salt
: and small molecule impurity不能依靠紫外吸收分析。业界认可的定量方法是楼上说
: 的AAA analysis。所谓 75%, 90% peptide content, 指的是AAA analysis 得到的数
: 据。
: 一个peptide经过HPLC提纯,看似纯度达到95%,做一下AAA analysis,发现peptide
: content 只有50%,是很常见的事情。
: 不过楼上的样品,根据MS谱图来看,没有做AAA analysis的价值,太不纯了。50AA左右
: 的多肽,应该只有四五个峰。机器灵敏度不高的话,一般就是两三个峰。
C*T
16 楼
并不是所有公司会给出peptide content。据我的经验,纯度数据会免费提供。大部分
公司peptide content会额外收费,一般100左右,贵的可能会200到300。我同意你的说
法,LCMS可以给杂质定性。有两点我觉得可以商榷,第一,透析能不能去除盐。我们一
般先desalt, 然后HPLC提纯多肽(~95% pure),然后做peptide content(假设70%)。
这25%的difference一般是多肽上结合的盐,比如TFA。众所周知多肽是以盐的结合体形
式提纯出来的。透析是不必要也是无益的。第二,多肽的不纯物当然会影响到结果。关
于小分子对生物学有没有影响,别的杂质不说,就举一个简单的TFA。业界的animal
study protocol,一般会要求避免多肽以TFA盐的形式进入动物体内,首选是acetate
salt,病理学毒性比TFA小 up to 30%。其他的小分子就更不用提了。TFA影响生物学的
例子我自己也见过一些。
公司peptide content会额外收费,一般100左右,贵的可能会200到300。我同意你的说
法,LCMS可以给杂质定性。有两点我觉得可以商榷,第一,透析能不能去除盐。我们一
般先desalt, 然后HPLC提纯多肽(~95% pure),然后做peptide content(假设70%)。
这25%的difference一般是多肽上结合的盐,比如TFA。众所周知多肽是以盐的结合体形
式提纯出来的。透析是不必要也是无益的。第二,多肽的不纯物当然会影响到结果。关
于小分子对生物学有没有影响,别的杂质不说,就举一个简单的TFA。业界的animal
study protocol,一般会要求避免多肽以TFA盐的形式进入动物体内,首选是acetate
salt,病理学毒性比TFA小 up to 30%。其他的小分子就更不用提了。TFA影响生物学的
例子我自己也见过一些。
v*m
18 楼
赞内行,在csbio上班?
我记得治疗多肽在FDA那里用tfa和acn 或methanol都不行,都是用acetate和ethanol制
备tox 或GMP batch。
我记得有些lyo的样品可以用NH4HCO3 buffer透析,去掉其他盐,然后lyo的时候,NH3,
H2O,和CO2都会被抽走。不清楚结合在多肽上的tfa能否被这样的盐替换。
【在 C******T 的大作中提到】
: 并不是所有公司会给出peptide content。据我的经验,纯度数据会免费提供。大部分
: 公司peptide content会额外收费,一般100左右,贵的可能会200到300。我同意你的说
: 法,LCMS可以给杂质定性。有两点我觉得可以商榷,第一,透析能不能去除盐。我们一
: 般先desalt, 然后HPLC提纯多肽(~95% pure),然后做peptide content(假设70%)。
: 这25%的difference一般是多肽上结合的盐,比如TFA。众所周知多肽是以盐的结合体形
: 式提纯出来的。透析是不必要也是无益的。第二,多肽的不纯物当然会影响到结果。关
: 于小分子对生物学有没有影响,别的杂质不说,就举一个简单的TFA。业界的animal
: study protocol,一般会要求避免多肽以TFA盐的形式进入动物体内,首选是acetate
: salt,病理学毒性比TFA小 up to 30%。其他的小分子就更不用提了。TFA影响生物学的
: 例子我自己也见过一些。
我记得治疗多肽在FDA那里用tfa和acn 或methanol都不行,都是用acetate和ethanol制
备tox 或GMP batch。
我记得有些lyo的样品可以用NH4HCO3 buffer透析,去掉其他盐,然后lyo的时候,NH3,
H2O,和CO2都会被抽走。不清楚结合在多肽上的tfa能否被这样的盐替换。
【在 C******T 的大作中提到】
: 并不是所有公司会给出peptide content。据我的经验,纯度数据会免费提供。大部分
: 公司peptide content会额外收费,一般100左右,贵的可能会200到300。我同意你的说
: 法,LCMS可以给杂质定性。有两点我觉得可以商榷,第一,透析能不能去除盐。我们一
: 般先desalt, 然后HPLC提纯多肽(~95% pure),然后做peptide content(假设70%)。
: 这25%的difference一般是多肽上结合的盐,比如TFA。众所周知多肽是以盐的结合体形
: 式提纯出来的。透析是不必要也是无益的。第二,多肽的不纯物当然会影响到结果。关
: 于小分子对生物学有没有影响,别的杂质不说,就举一个简单的TFA。业界的animal
: study protocol,一般会要求避免多肽以TFA盐的形式进入动物体内,首选是acetate
: salt,病理学毒性比TFA小 up to 30%。其他的小分子就更不用提了。TFA影响生物学的
: 例子我自己也见过一些。
C*T
19 楼
对的。acetate 比较普遍。
多肽上的盐较好替换,用不同的酸,两到三次lyo可以换掉。
我是biologist,csbio应该没有我这样的职位。多谢垂询。
多肽上的盐较好替换,用不同的酸,两到三次lyo可以换掉。
我是biologist,csbio应该没有我这样的职位。多谢垂询。
v*t
20 楼
感谢专家们的建议!
这个peptide确实比较长,60aa。因为是要用于structural study,所以比较关心全长
peptide在peptide总量中的百分比。盐的话可以替换。
这个peptide确实比较长,60aa。因为是要用于structural study,所以比较关心全长
peptide在peptide总量中的百分比。盐的话可以替换。
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