histone Wester blot# Biology - 生物学
K*U
1 楼
RT，Ref材料寄出后移民局会发个什么收到之类的信件么，还是网上会有什么更新，还
是一直到有结果才发通知。
有点急，材料快递的，三天了，没有什么消息，网上也没有什么更新。
知情人给说一下，谢谢！
是一直到有结果才发通知。
有点急，材料快递的，三天了，没有什么消息，网上也没有什么更新。
知情人给说一下，谢谢！
m*t
2 楼
最近做histone Wb，没bands。别人的文章看起来很容易，方法也没有任何特殊说明。
请教做过的各位了。
请教做过的各位了。
v*b
3 楼
你用什么寄到？ 如果是快递应该有个签收扫描图片的
我用USPS快递 就是这样
我用USPS快递 就是这样
p*b
4 楼
裂解液不够强？ histone可能需要比较强的去垢剂
K*U
5 楼
律师邮寄的，用的是隔夜就收到那种（吐血，要60$）.他没有给我什么扫描图片之类的
。这种应该不会邮寄丢掉吧？
。这种应该不会邮寄丢掉吧？
r*k
6 楼
我就用1 percent的 sds的RIPA。 但是最主要的是你的GEL是不是15%的？因为histone
很小 如果不是 你肯定跑不出来 histone是非常strong的band 我5ug都能做出来。。
很小 如果不是 你肯定跑不出来 histone是非常strong的band 我5ug都能做出来。。
a*l
7 楼
online status will change.
【在 K*****U 的大作中提到】
: RT，Ref材料寄出后移民局会发个什么收到之类的信件么，还是网上会有什么更新，还
: 是一直到有结果才发通知。
: 有点急，材料快递的，三天了，没有什么消息，网上也没有什么更新。
: 知情人给说一下，谢谢！
【在 K*****U 的大作中提到】
: RT，Ref材料寄出后移民局会发个什么收到之类的信件么，还是网上会有什么更新，还
: 是一直到有结果才发通知。
: 有点急，材料快递的，三天了，没有什么消息，网上也没有什么更新。
: 知情人给说一下，谢谢！
s*2
8 楼
acidic extraction
【在 m******t 的大作中提到】
: 最近做histone Wb，没bands。别人的文章看起来很容易，方法也没有任何特殊说明。
: 请教做过的各位了。
【在 m******t 的大作中提到】
: 最近做histone Wb，没bands。别人的文章看起来很容易，方法也没有任何特殊说明。
: 请教做过的各位了。
K*U
9 楼
真的啊，那怎么办，这样还能寄丢了，难道要打个电话问问？
t*k
10 楼
我是用做chip的裂解液，貌似不错
v*b
11 楼
不用担心
电话问问律师 有没有收到签收的照片 特快一般都要签收 除非 waiver signature
电话问问律师 有没有收到签收的照片 特快一般都要签收 除非 waiver signature
f*d
12 楼
Histone 是很容易做的，要sonicate cell lysates, 确保细胞核裂解，RIPA buffer绝
对没问题。如果没有的话，1% SDS ＋ heating也很容易看到，如果还看不到的话，用
8M UREA+RIPA, 这样的话，即使在胶上都能看到很强的band. 此外这个protein特别小
，好像15还是18kD, 所以胶别跑过了。
对没问题。如果没有的话，1% SDS ＋ heating也很容易看到，如果还看不到的话，用
8M UREA+RIPA, 这样的话，即使在胶上都能看到很强的band. 此外这个protein特别小
，好像15还是18kD, 所以胶别跑过了。
K*U
13 楼
OK,多谢，明天一定要搞清楚，不然来不及了。
z*t
14 楼
正解，好使
【在 s**2 的大作中提到】
: acidic extraction
【在 s**2 的大作中提到】
: acidic extraction
K*U
15 楼
打电话给律师了，他说UPS的TRACK显示移民局在周二收到了材料，网上一直没有更新是
因为这个系统对于PP的一般没有更新。
是这样么？昨天有好心人给我短信，说是PP的RFE审批网上也会更新，怎么办，要给移
民局打电话么？律师肯定不会打，他认为已经收到了。我打会不会有负面的影响呢？
因为这个系统对于PP的一般没有更新。
是这样么？昨天有好心人给我短信，说是PP的RFE审批网上也会更新，怎么办，要给移
民局打电话么？律师肯定不会打，他认为已经收到了。我打会不会有负面的影响呢？
A*y
16 楼
No need for acidic extraction. Sonication will do. Using abcam chip grand
HH3 antibody 1/10,000 will give you less than 1 sec exposure.
HH3 antibody 1/10,000 will give you less than 1 sec exposure.
O*a
17 楼
很简单，我给你个protocol：
1. 要配15%的胶，注意组蛋白分子量10多K，不要跑出去了。
2. 酸抽：收集细胞，PBS洗干净；用TEB buffer（TritonX100 extraction buffer：
PBS＋0.5% TritonX100（v/v）＋2mM PMSF），冰上裂解10分钟，每10X10^6个细胞用
1ml TEB buffer。6500 g，4度离心10分钟，去掉上清，pellet就是nuclei。加0.2N
HCl（in水溶液），重悬起来，转轮上4度过夜，每10X10^6个细胞用250ul 0.2N HCl。
第二天6500 g4度离心10分钟，保留上清，就是histone。盐酸中的组蛋白，保存在－20
度、biorad测蛋白浓度，都没问题，不用TCA沉淀。
3. 一般取2-5ul，直接加SDS loading buffer就可以跑胶。不用改pH值。加了loading
buffer溴酚蓝会变色，因为pH太低，不过无所谓。跑胶转膜，ponceau S染色就能看到
清晰的三条组蛋白带（H3、H2A／2B，H4），一般还能看到上面一条组蛋白H1。western
更是没问题了。
4. 当然第2步之后你也可以用TCA沉淀：加1/2体积的100%TCA（终浓度33%），冰上沉淀
30min，最大转速4度离心10分钟，保留pellet，加1ml丙酮洗涤，最大转速4度离心10分
钟，保留pellet。用丙酮反复洗涤3次，室温空气中20分钟晾干，用水或者适当的
buffer重悬，－20保存或者下一步分析。
ps 37.5% HCl约等于 12.2M, 也就是12.2当量（12.2N）
【在 m******t 的大作中提到】
: 最近做histone Wb，没bands。别人的文章看起来很容易，方法也没有任何特殊说明。
: 请教做过的各位了。
1. 要配15%的胶，注意组蛋白分子量10多K，不要跑出去了。
2. 酸抽：收集细胞，PBS洗干净；用TEB buffer（TritonX100 extraction buffer：
PBS＋0.5% TritonX100（v/v）＋2mM PMSF），冰上裂解10分钟，每10X10^6个细胞用
1ml TEB buffer。6500 g，4度离心10分钟，去掉上清，pellet就是nuclei。加0.2N
HCl（in水溶液），重悬起来，转轮上4度过夜，每10X10^6个细胞用250ul 0.2N HCl。
第二天6500 g4度离心10分钟，保留上清，就是histone。盐酸中的组蛋白，保存在－20
度、biorad测蛋白浓度，都没问题，不用TCA沉淀。
3. 一般取2-5ul，直接加SDS loading buffer就可以跑胶。不用改pH值。加了loading
buffer溴酚蓝会变色，因为pH太低，不过无所谓。跑胶转膜，ponceau S染色就能看到
清晰的三条组蛋白带（H3、H2A／2B，H4），一般还能看到上面一条组蛋白H1。western
更是没问题了。
4. 当然第2步之后你也可以用TCA沉淀：加1/2体积的100%TCA（终浓度33%），冰上沉淀
30min，最大转速4度离心10分钟，保留pellet，加1ml丙酮洗涤，最大转速4度离心10分
钟，保留pellet。用丙酮反复洗涤3次，室温空气中20分钟晾干，用水或者适当的
buffer重悬，－20保存或者下一步分析。
ps 37.5% HCl约等于 12.2M, 也就是12.2当量（12.2N）
【在 m******t 的大作中提到】
: 最近做histone Wb，没bands。别人的文章看起来很容易，方法也没有任何特殊说明。
: 请教做过的各位了。
C*0
18 楼
正解！
20
loading
【在 O**********a 的大作中提到】
: 很简单，我给你个protocol：
: 1. 要配15%的胶，注意组蛋白分子量10多K，不要跑出去了。
: 2. 酸抽：收集细胞，PBS洗干净；用TEB buffer（TritonX100 extraction buffer：
: PBS＋0.5% TritonX100（v/v）＋2mM PMSF），冰上裂解10分钟，每10X10^6个细胞用
: 1ml TEB buffer。6500 g，4度离心10分钟，去掉上清，pellet就是nuclei。加0.2N
: HCl（in水溶液），重悬起来，转轮上4度过夜，每10X10^6个细胞用250ul 0.2N HCl。
: 第二天6500 g4度离心10分钟，保留上清，就是histone。盐酸中的组蛋白，保存在－20
: 度、biorad测蛋白浓度，都没问题，不用TCA沉淀。
: 3. 一般取2-5ul，直接加SDS loading buffer就可以跑胶。不用改pH值。加了loading
: buffer溴酚蓝会变色，因为pH太低，不过无所谓。跑胶转膜，ponceau S染色就能看到
20
loading
【在 O**********a 的大作中提到】
: 很简单，我给你个protocol：
: 1. 要配15%的胶，注意组蛋白分子量10多K，不要跑出去了。
: 2. 酸抽：收集细胞，PBS洗干净；用TEB buffer（TritonX100 extraction buffer：
: PBS＋0.5% TritonX100（v/v）＋2mM PMSF），冰上裂解10分钟，每10X10^6个细胞用
: 1ml TEB buffer。6500 g，4度离心10分钟，去掉上清，pellet就是nuclei。加0.2N
: HCl（in水溶液），重悬起来，转轮上4度过夜，每10X10^6个细胞用250ul 0.2N HCl。
: 第二天6500 g4度离心10分钟，保留上清，就是histone。盐酸中的组蛋白，保存在－20
: 度、biorad测蛋白浓度，都没问题，不用TCA沉淀。
: 3. 一般取2-5ul，直接加SDS loading buffer就可以跑胶。不用改pH值。加了loading
: buffer溴酚蓝会变色，因为pH太低，不过无所谓。跑胶转膜，ponceau S染色就能看到
j*x
19 楼
直接煮
c*u
20 楼
loading buffer 直接煮，蛋白胶都能看到。如果你做不出来，只能是你western有问题
。
。
O*a
21 楼
有DNA混在里面不会拖尾么
我还是喜欢酸抽，干净啊，跑出来的条带好看
【在 c*****u 的大作中提到】
: loading buffer 直接煮，蛋白胶都能看到。如果你做不出来，只能是你western有问题
: 。
我还是喜欢酸抽，干净啊，跑出来的条带好看
【在 c*****u 的大作中提到】
: loading buffer 直接煮，蛋白胶都能看到。如果你做不出来，只能是你western有问题
: 。
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