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请教PCR问题# Biology - 生物学
C*K
1
我知道放室溫12hr是OK的. 不知有沒有人放更久的? 我把Wellness塞在冰盒裡凍成幾個
ice cubes, about 1 oZ size. 從冷
凍庫拿出來後在autofeeder放了24小時, 咪應該在15-24hr之間吃了最後一格, 但早上
我發現都吐在地上了. 我聞了聞剩下
的和他吐的(excuse me), 好像沒怪味. 他看起來也沒事, 早上依然吃早餐, 舔毛, 睡
覺, 沒什麼不一樣.
feeder附近室溫59-60F.
也許他只是吐毛犯了? 心裡還是有些毛毛的..
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c*y
2
要从基因组里扩两段片段,分别也就1kb左右,居然死活p不出来,求助
引物分别都设计了3对了,taq酶p,刚开始是p不出来,后来调整体系后会在300-500这
个区域出现非常特异的条带,但是1kb的位置什么都没有
基因组pcr不是应该很多非特异性条带的么。。。
求帮分析原因。。。
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t*u
3
坏了应该不会吃的
至少大米这样,叼着呢
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T*e
4
模板有问题吗?模板质量,模板浓度都会影响,可能你要稀释模板试试
引物GC含量多少?三对不同引物差别是什么?同一对引物你blast了吗?
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C*K
5
從來沒這樣餵過, 以前都餵乾糧.
爬螞蟻咪是拒吃的....
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i*a
6
genomic dna pcr的时候浓度不能太高,多稀释一下,引物3'端以g或c结尾。我做一般
用kod酶,现在谁还用taq。

【在 c********y 的大作中提到】
: 要从基因组里扩两段片段,分别也就1kb左右,居然死活p不出来,求助
: 引物分别都设计了3对了,taq酶p,刚开始是p不出来,后来调整体系后会在300-500这
: 个区域出现非常特异的条带,但是1kb的位置什么都没有
: 基因组pcr不是应该很多非特异性条带的么。。。
: 求帮分析原因。。。

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o*y
7
我家咪 12 小时候的罐头是肯定不吃的
得猫猫们应该能闻出来吧,而且他们很挑的
不过我觉得你这个又冻,又解冻的,是不是不太好?不过我也不懂

【在 C**K 的大作中提到】
: 我知道放室溫12hr是OK的. 不知有沒有人放更久的? 我把Wellness塞在冰盒裡凍成幾個
: ice cubes, about 1 oZ size. 從冷
: 凍庫拿出來後在autofeeder放了24小時, 咪應該在15-24hr之間吃了最後一格, 但早上
: 我發現都吐在地上了. 我聞了聞剩下
: 的和他吐的(excuse me), 好像沒怪味. 他看起來也沒事, 早上依然吃早餐, 舔毛, 睡
: 覺, 沒什麼不一樣.
: feeder附近室溫59-60F.
: 也許他只是吐毛犯了? 心裡還是有些毛毛的..

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M*g
8
Use Q5 from NEB.
or try to purify your genomic DNA and then do PCR again.
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S*t
9
24HR没问题的,其实猫早年被人类收养就是因为食腐,来人类这里找点剩下的食物,
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c*y
10
模版每个体系加40ug,刚开始我确实加太多了,在1kb那里有条带就以为是目的条带,
还一本正经割胶回收连接,后来才意识到可能是基因组dna而已,现在gapdh扩得很好
引物gc含量基本都在50-60之间我觉得可以接受吧,引物blast过,都有15个碱基错配,
可是我的目的片段就那么长,能设计的都设计了,再设计就不是那块区域了

【在 T*****e 的大作中提到】
: 模板有问题吗?模板质量,模板浓度都会影响,可能你要稀释模板试试
: 引物GC含量多少?三对不同引物差别是什么?同一对引物你blast了吗?

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C*K
11
我記得你說罐頭有防腐劑呢....

【在 S********t 的大作中提到】
: 24HR没问题的,其实猫早年被人类收养就是因为食腐,来人类这里找点剩下的食物,
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c*y
12
以前我也用kod,后来觉得taq扩增效率高,先把条件摸出来再换高保真,现在新到的实
验室没有kod也是一个问题。。。关键是taq连目的片段都p不出来我总觉得换酶也不见
得有用。。。
现在模版稀释了,40ng一个体系,引物3‘端也都是g或者c

【在 i**********a 的大作中提到】
: genomic dna pcr的时候浓度不能太高,多稀释一下,引物3'端以g或c结尾。我做一般
: 用kod酶,现在谁还用taq。

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C*K
13
就是怕壞了才凍過. 可又不敢餵乾糧.

【在 o******y 的大作中提到】
: 我家咪 12 小时候的罐头是肯定不吃的
: 得猫猫们应该能闻出来吧,而且他们很挑的
: 不过我觉得你这个又冻,又解冻的,是不是不太好?不过我也不懂

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c*y
14
dna重新提过了,用试剂盒提的,感觉应该还好吧,gapdh扩得挺好的。
我试试,不停重新定酶怕老板批啊。。。

【在 M******g 的大作中提到】
: Use Q5 from NEB.
: or try to purify your genomic DNA and then do PCR again.

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S*t
15
有防腐计的就更不坏了

【在 C**K 的大作中提到】
: 我記得你說罐頭有防腐劑呢....
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j*n
16
不同的酶最优条件是不一样的。。。
我们做pcr优化顺序
1 touch down pcr
2 gradient pcr
3 换buffer 推荐epicenter buffer kit 有12 种不同buffer 适合不同gc含量的
对于特别难P的 我们经常发现只有1-2个buffer可行
4 换酶 我们实验室全部都是用q5 除了colony pcr 所以一般换酶不会有太好结果 以前
也试过不同公司的 感觉都不如q5

【在 c********y 的大作中提到】
: 以前我也用kod,后来觉得taq扩增效率高,先把条件摸出来再换高保真,现在新到的实
: 验室没有kod也是一个问题。。。关键是taq连目的片段都p不出来我总觉得换酶也不见
: 得有用。。。
: 现在模版稀释了,40ng一个体系,引物3‘端也都是g或者c

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o*y
17
喂小罐 3 oz 的试试?
我们都是早上喂两罐一直到下午回家
再打开一罐新的
旁边放点干粮,不过咪基本上就不吃干粮了

【在 C**K 的大作中提到】
: 就是怕壞了才凍過. 可又不敢餵乾糧.
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T*e
18
我建议你用q5,如果你有的话。
模板我建议你同时用1倍,10倍稀释,100倍稀释,1000倍稀释同时做。
你说的15个错配是什么情况?一共多长?怎么会这样?如果你引物设计有困难,建议用
巢式PCR
麻烦一点的就是设计个2~3kb好扩增的,然后做成plasmid,再从里面扩增你要的1kb,
应该容易很多
退货温度也可以优化一下,不过如果是Q5,我都用NEB Tm calculator
记得NEB有个high GC的buffer 不过我从来没有遇到过那样的问题
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C*K
19
真的嗎? 不要開玩笑啦, 我是真煩惱... >_<

【在 S********t 的大作中提到】
: 有防腐计的就更不坏了
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n*u
20
1kb 左右? 合成吧 也就五天就合好了

:要从基因组里扩两段片段,分别也就1kb左右,居然死活p不出来,求助
:引物分别都设计了3对了,taq酶p,刚开始是p不出来,后来调整体系后会在300-500这
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C*K
21
平時沒問題, 現在是因為要找人一天來餵一次才得這麼做滴呀.

【在 o******y 的大作中提到】
: 喂小罐 3 oz 的试试?
: 我们都是早上喂两罐一直到下午回家
: 再打开一罐新的
: 旁边放点干粮,不过咪基本上就不吃干粮了

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s*s
22
debug 的话,我一般都属先gradient pcr, 不行的话nested 基本能搞定。可能要换一
两个酶试试。
不过就一k,还不如合成,或者买clone从plasmid里面p

【在 c********y 的大作中提到】
: 要从基因组里扩两段片段,分别也就1kb左右,居然死活p不出来,求助
: 引物分别都设计了3对了,taq酶p,刚开始是p不出来,后来调整体系后会在300-500这
: 个区域出现非常特异的条带,但是1kb的位置什么都没有
: 基因组pcr不是应该很多非特异性条带的么。。。
: 求帮分析原因。。。

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T*e
23
12hr 我家大宝宝一般是不吃的。 就是吃也很可能会吐出来。

【在 C**K 的大作中提到】
: 我知道放室溫12hr是OK的. 不知有沒有人放更久的? 我把Wellness塞在冰盒裡凍成幾個
: ice cubes, about 1 oZ size. 從冷
: 凍庫拿出來後在autofeeder放了24小時, 咪應該在15-24hr之間吃了最後一格, 但早上
: 我發現都吐在地上了. 我聞了聞剩下
: 的和他吐的(excuse me), 好像沒怪味. 他看起來也沒事, 早上依然吃早餐, 舔毛, 睡
: 覺, 沒什麼不一樣.
: feeder附近室溫59-60F.
: 也許他只是吐毛犯了? 心裡還是有些毛毛的..

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l*e
24
问得太笼统。直接把你的序列都放出来,别人才有可能帮你。
否则都是扯淡。

【在 c********y 的大作中提到】
: 要从基因组里扩两段片段,分别也就1kb左右,居然死活p不出来,求助
: 引物分别都设计了3对了,taq酶p,刚开始是p不出来,后来调整体系后会在300-500这
: 个区域出现非常特异的条带,但是1kb的位置什么都没有
: 基因组pcr不是应该很多非特异性条带的么。。。
: 求帮分析原因。。。

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