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做SILAC的氨基酸必须全标记么？

做SILAC的氨基酸必须全标记么？# Biology - 生物学

s*y2016-05-11 07:05

1 楼

我以前做过一次SILAC,用的氨基酸是L-Leucine-13C6，就是6个碳原子都标记了的。效
果不错，但是氨基酸很贵。
然后这次需要做更多的分析，觉得氨基酸贵死了。然后找到了一个单标记的L-Leucine-
13C1，就是分子中的6个碳原子中只标记了一个碳，这样会便宜很多很多很多倍。但是
我就不知道这样的氨基酸是否适合做SILAC,比方说，不同的标记的峰是否分得够开? 以
及算法里是否容易改？

l*y2016-05-11 07:05

2 楼

不行，有isotope envelope, 至少得差4 Da才行。

s*y2016-05-11 07:05

3 楼

哦，好吧，那就只能硬着头皮买全标记的了。谢谢解答！

【在 l****y 的大作中提到】

: 不行，有isotope envelope, 至少得差4 Da才行。

b*y2016-05-11 07:05

4 楼

借问：
我合成了一个30aa的多肽，其中一个位置是X（＝20aa中的任意一个）。不知能否用MS
定量每一个aa在该位置的丰度。当然，Ile and Leu can't be distinguished.
多谢！

【在 l****y 的大作中提到】

: 不行，有isotope envelope, 至少得差4 Da才行。

l*y2016-05-11 07:05

5 楼

不好弄，离子化效率不一样，而且有些质量接近，
如果UPLC能分开就好办，不过估计也不好分，
[在 bearbaby (小熊) 的大作中提到：]
:借问：
:我合成了一个30aa的多肽，其中一个位置是X（＝20aa中的任意一个）。不知能否用MS
:定量每一个aa在该位置的丰度。当然，Ile and Leu can't be distinguished.
:多谢！

b*y2016-05-11 07:05

6 楼

Thanks. Actually I want two MS runs: one for the original peptide mixture
solution and another one on a sample pulled down by a big protein. As long
as the mixture can be separated, I will use the ratio of each peptide in the
two samples to determine which peptides are preferentially pulled down by
the big protein. As such, differences in ionization efficiency can be
ignored. As long as 19 peaks can be well discerned, I am OK.
The question is "can I get the 19 well separated peaks?"

MS

【在 l****y 的大作中提到】

: 不好弄，离子化效率不一样，而且有些质量接近，
: 如果UPLC能分开就好办，不过估计也不好分，
: [在 bearbaby (小熊) 的大作中提到：]
: :借问：
: :我合成了一个30aa的多肽，其中一个位置是X（＝20aa中的任意一个）。不知能否用MS
: :定量每一个aa在该位置的丰度。当然，Ile and Leu can't be distinguished.
: :多谢！

l*y2016-05-11 07:05

7 楼

有些只差一Da, 像D和N, 单用ms就分不开，
如果用lc-ms, 多一维分离，可能分开，
估计你就是个初筛，然后还是要单独合成验证，所以分不开的就单独合吧。
[在 bearbaby (小熊) 的大作中提到：]
:Thanks. Actually I want two MS runs: one for the original peptide mixture
:solution and another one on a sample pulled down by a big protein. As long
:as the mixture can be separated, I will use the ratio of each peptide in
the two samples to determine which peptides are preferentially pulled down
by
:the big protein. As such, differences in ionization efficiency can be
:ignored. As long as 19 peaks can be well discerned, I am OK.
:The question is "can I get the 19 well separated peaks?"

s*y2016-05-11 07:05

8 楼

你说的这个实验其实适合用Phage display or ribosome display 来做，然后再上NGS
来看pulldown result.

the

【在 b******y 的大作中提到】

: Thanks. Actually I want two MS runs: one for the original peptide mixture
: solution and another one on a sample pulled down by a big protein. As long
: as the mixture can be separated, I will use the ratio of each peptide in the
: two samples to determine which peptides are preferentially pulled down by
: the big protein. As such, differences in ionization efficiency can be
: ignored. As long as 19 peaks can be well discerned, I am OK.
: The question is "can I get the 19 well separated peaks?"
:
: MS

l*y2016-05-11 07:05

9 楼

我估计他是已经知道一种组合会bind，就是看看mutation的影响，
Display好像有点大才小用。
[在 sunnyday (胖头鱼。按斤卖就赚了) 的大作中提到：]
:你说的这个实验其实适合用Phage display or ribosome display 来做，然后再上NGS
:来看pulldown result.
:the

K*S2016-05-11 07:05

10 楼

as long as you use high resolution mass, you don't need to separate them
very well from LC. you can use mass difference to separate the peak. Google
EIC or XIC MS1 quantification.

：Thanks. Actually I want two MS runs: one for the original peptide mixture
：solution and another one on a sample pulled down by a big protein. As long

R*n2016-05-11 07:05

11 楼

我有个可行的方法，你查一下edman degradation。这个是个time-dependent单向降解
peptide。你1：1混合，做个time series,然后用MALDI-tof打个谱应该差不多比出来丰
度。

MS

【在 b******y 的大作中提到】

: 借问：
: 我合成了一个30aa的多肽，其中一个位置是X（＝20aa中的任意一个）。不知能否用MS
: 定量每一个aa在该位置的丰度。当然，Ile and Leu can't be distinguished.
: 多谢！

j*g2016-05-11 07:05

12 楼

现在SILAC过时了吧
都是非标记的了

b*y2016-05-11 07:05

13 楼

I am developing a method based on my understanding of a thermodynamics of a
phenomenon. Phage display is better than mine in terms of sequence space if
we are talking about the 20 amino acid residual due to the NGS thing you
mentioned. But my method is simple but limited to MS detection. I am
thinking to use it to none natural amino acid residuals, e.g. D-amino acid.
As such, no genetic methods is possible (or nearly impossible).

NGS

【在 s******y 的大作中提到】

: 你说的这个实验其实适合用Phage display or ribosome display 来做，然后再上NGS
: 来看pulldown result.
:
: the

b*y2016-05-11 07:05

14 楼

Is LC-MS a common method in core facility? Probably yes, right? Just couple
a HPLC to a MS machine, I guess.

long

【在 l****y 的大作中提到】

: 有些只差一Da, 像D和N, 单用ms就分不开，
: 如果用lc-ms, 多一维分离，可能分开，
: 估计你就是个初筛，然后还是要单独合成验证，所以分不开的就单独合吧。
: [在 bearbaby (小熊) 的大作中提到：]
: :Thanks. Actually I want two MS runs: one for the original peptide mixture
: :solution and another one on a sample pulled down by a big protein. As long
: :as the mixture can be separated, I will use the ratio of each peptide in
: the two samples to determine which peptides are preferentially pulled down
: by
: :the big protein. As such, differences in ionization efficiency can be

b*y2016-05-11 07:05

15 楼

YOur guess is actually very very close.

NGS

【在 l****y 的大作中提到】

: 我估计他是已经知道一种组合会bind，就是看看mutation的影响，
: Display好像有点大才小用。
: [在 sunnyday (胖头鱼。按斤卖就赚了) 的大作中提到：]
: :你说的这个实验其实适合用Phage display or ribosome display 来做，然后再上NGS
: :来看pulldown result.
: :the

b*y2016-05-11 07:05

16 楼

多谢！

【在 R****n 的大作中提到】

: 我有个可行的方法，你查一下edman degradation。这个是个time-dependent单向降解
: peptide。你1：1混合，做个time series,然后用MALDI-tof打个谱应该差不多比出来丰
: 度。
:
: MS

b*y2016-05-11 07:05

17 楼

多谢！

Google
mixture
long

【在 K******S 的大作中提到】

: as long as you use high resolution mass, you don't need to separate them
: very well from LC. you can use mass difference to separate the peak. Google
: EIC or XIC MS1 quantification.
:
: ：Thanks. Actually I want two MS runs: one for the original peptide mixture
: ：solution and another one on a sample pulled down by a big protein. As long

j*g2016-05-11 07:05

18 楼

现在SILAC过时了吧
都是非标记的了

B*v2016-05-11 07:05

19 楼

你把合成的peptide挂到beads上，比如通过His6，然后pull down你的蛋白，再检测多
简单。MS定量很差，通常你样本里10倍的差别，MS能看到2倍，样本2倍的差别MS就看不
到了。MS最好的用途是identify, 不是quantify。
而且你想跑两次MS, 但严格来讲两次MS结果就不可比，因为离子化效率就不一样。这也
是为什么SILAC要把样品混合的原因。
display就别想了，你自己把系统建立起来就2年过去了，而且那个是几千几万的筛选。

MS

【在 b******y 的大作中提到】

K*S2016-05-11 07:05

20 楼

it's amazing to see how little biologists know about mass spec

：你把合成的peptide挂到beads上，比如通过His6，然后pull down你的蛋白，再检测多
：简单。MS定量很差，通常你样本里10倍的差别，MS能看到2倍，样本2倍的差别MS就看
不到了。MS最好的用途是identify, 不是quantify。