双荧光筛选系统提高人干细胞biallelic基因编辑效率探讨# Biology - 生物学
c*6
1 楼
借着韩春雨的光,生物版这么火。想再来跟大家探讨一下一个用流式细胞仪双荧光筛选
系统来鉴定并筛选出那种两个allele都被成功编辑的干细胞。
具体思路:
1。CRISPR-Cas9和gRNA在靶标上引入双链断裂。
2。donor模版,模版上带有两段1000bp的同源臂和突变碱基,同源臂之间带有荧光标签
(GFP,BFP,或者RFP等等),同源臂之外donor的backbone上面带有与同源臂之间不同
的荧光标签。
3。每次电转的时候转入细胞:Cas9质粒,gRNA质粒,带有GFP的donor,带有RFP的
donor(两个donor的backbone上面都带有BFP用以排除random integration)。
4。电转过后几天等细胞长到足够数量筛选细胞,GFP+/RFP+/BFP-的细胞应该就是那种
两个allele都被成功编辑的。
5。很多人担心这个荧光标签无法移出,实际上可以使用Loxp系统,筛选出来的细胞直
接过表达CRE可以把荧光标签切除,虽然会有34bp的loxp位点遗留下来,但是你可以把
这个遗留位点选在intron不影响mRNA。或者可以使用piggyBac系统做到无缝移出。
不知道有没有人对这个有兴趣
系统来鉴定并筛选出那种两个allele都被成功编辑的干细胞。
具体思路:
1。CRISPR-Cas9和gRNA在靶标上引入双链断裂。
2。donor模版,模版上带有两段1000bp的同源臂和突变碱基,同源臂之间带有荧光标签
(GFP,BFP,或者RFP等等),同源臂之外donor的backbone上面带有与同源臂之间不同
的荧光标签。
3。每次电转的时候转入细胞:Cas9质粒,gRNA质粒,带有GFP的donor,带有RFP的
donor(两个donor的backbone上面都带有BFP用以排除random integration)。
4。电转过后几天等细胞长到足够数量筛选细胞,GFP+/RFP+/BFP-的细胞应该就是那种
两个allele都被成功编辑的。
5。很多人担心这个荧光标签无法移出,实际上可以使用Loxp系统,筛选出来的细胞直
接过表达CRE可以把荧光标签切除,虽然会有34bp的loxp位点遗留下来,但是你可以把
这个遗留位点选在intron不影响mRNA。或者可以使用piggyBac系统做到无缝移出。
不知道有没有人对这个有兴趣