e*p
2 楼
做3’RACE 快半年了,用了好几种TAQ - strategen pfu, takara, biorad bioline,
invitrogen platium hifi. 3‘引物设计了6个,条件也优化(AT,elonging time, mg+
),要不什么也没有要不没有P出目的条带(测序后错配了)。。。唉 都要崩溃了..
另外的一个基因到是P出来了,这个基因3'端有很多重复序 GC 50-60%的样子 请教大家
一般用什么办法或强大的酶。。。
非常感谢
invitrogen platium hifi. 3‘引物设计了6个,条件也优化(AT,elonging time, mg+
),要不什么也没有要不没有P出目的条带(测序后错配了)。。。唉 都要崩溃了..
另外的一个基因到是P出来了,这个基因3'端有很多重复序 GC 50-60%的样子 请教大家
一般用什么办法或强大的酶。。。
非常感谢
c*h
3 楼
国内某大学投某中档杂志的文章,主要是英语写的太别扭了。很多不专业的用法。还有
就是一段话就一个句子,从句套从句。我虽然英语也不咋的,但是这个写的实在是怎么
读起来怎么别扭,这种情况大家怎么办?不会要逐字逐句给他改吧?如果结果过的去,
让他修改文章重写么?
就是一段话就一个句子,从句套从句。我虽然英语也不咋的,但是这个写的实在是怎么
读起来怎么别扭,这种情况大家怎么办?不会要逐字逐句给他改吧?如果结果过的去,
让他修改文章重写么?
a*n
5 楼
首先看你用的cdna来源的细胞组织有没有目的基因的表达
PCR条件可以加点DMSO,槽式PCR试试,酶可以试试clontech的advantage 2 system
mg+
【在 e****p 的大作中提到】
: 做3’RACE 快半年了,用了好几种TAQ - strategen pfu, takara, biorad bioline,
: invitrogen platium hifi. 3‘引物设计了6个,条件也优化(AT,elonging time, mg+
: ),要不什么也没有要不没有P出目的条带(测序后错配了)。。。唉 都要崩溃了..
: 另外的一个基因到是P出来了,这个基因3'端有很多重复序 GC 50-60%的样子 请教大家
: 一般用什么办法或强大的酶。。。
: 非常感谢
PCR条件可以加点DMSO,槽式PCR试试,酶可以试试clontech的advantage 2 system
mg+
【在 e****p 的大作中提到】
: 做3’RACE 快半年了,用了好几种TAQ - strategen pfu, takara, biorad bioline,
: invitrogen platium hifi. 3‘引物设计了6个,条件也优化(AT,elonging time, mg+
: ),要不什么也没有要不没有P出目的条带(测序后错配了)。。。唉 都要崩溃了..
: 另外的一个基因到是P出来了,这个基因3'端有很多重复序 GC 50-60%的样子 请教大家
: 一般用什么办法或强大的酶。。。
: 非常感谢
G*e
9 楼
我也碰到这样的情况,就举出十来处例子,要求先improve English writing。提交了
report之后发现另一个审稿人强据。估计Editor会据了……
report之后发现另一个审稿人强据。估计Editor会据了……
z*l
13 楼
我一般找个3,4处,然后就说英文要改一下。
R*w
15 楼
这个是行不通的,一旦引物加到反应体系里了你就没法控制引物binding到那一端?
随机引物可以做正向的也可以做反向的。
但是我有一个方法,是我以前扩增Novel病毒是想到的,而且很有效。
在做反转录时用特殊的随机引物,在随机引物的5'端加一段已知序列例如:5'-
GCTACTAGTCGATCGTnnnnnn-3'。这样你就在所有cDNA的5’端加了一个Tail。
然后做PCR时forward primer用你的5’端Gene specific引物,反向引物用这个tail“5
'-GCTACTAGTCGATCGT-3'”你就肯定能扩到3’端,可以一步一步往3’端扩。
可能ronbell想说的也是这种方法吧?
其实Race最麻烦的还是5’-race。这以前一直用一个酶在cDNA的3’端加A。但不是很有
效,有时可以扩到5’端的序列有时弄很难
【在 r*****l 的大作中提到】
: 在基因组DNA里试试一端用随机引物pcr
:
: mg+
随机引物可以做正向的也可以做反向的。
但是我有一个方法,是我以前扩增Novel病毒是想到的,而且很有效。
在做反转录时用特殊的随机引物,在随机引物的5'端加一段已知序列例如:5'-
GCTACTAGTCGATCGTnnnnnn-3'。这样你就在所有cDNA的5’端加了一个Tail。
然后做PCR时forward primer用你的5’端Gene specific引物,反向引物用这个tail“5
'-GCTACTAGTCGATCGT-3'”你就肯定能扩到3’端,可以一步一步往3’端扩。
可能ronbell想说的也是这种方法吧?
其实Race最麻烦的还是5’-race。这以前一直用一个酶在cDNA的3’端加A。但不是很有
效,有时可以扩到5’端的序列有时弄很难
【在 r*****l 的大作中提到】
: 在基因组DNA里试试一端用随机引物pcr
:
: mg+
e*p
16 楼
请问这个随机引物是自己合成的还是可以直接买到的啊?
这样的话RT后 PCR会有很多条带吧,
谢谢!
“5
【在 R*****w 的大作中提到】
: 这个是行不通的,一旦引物加到反应体系里了你就没法控制引物binding到那一端?
: 随机引物可以做正向的也可以做反向的。
: 但是我有一个方法,是我以前扩增Novel病毒是想到的,而且很有效。
: 在做反转录时用特殊的随机引物,在随机引物的5'端加一段已知序列例如:5'-
: GCTACTAGTCGATCGTnnnnnn-3'。这样你就在所有cDNA的5’端加了一个Tail。
: 然后做PCR时forward primer用你的5’端Gene specific引物,反向引物用这个tail“5
: '-GCTACTAGTCGATCGT-3'”你就肯定能扩到3’端,可以一步一步往3’端扩。
: 可能ronbell想说的也是这种方法吧?
: 其实Race最麻烦的还是5’-race。这以前一直用一个酶在cDNA的3’端加A。但不是很有
: 效,有时可以扩到5’端的序列有时弄很难
这样的话RT后 PCR会有很多条带吧,
谢谢!
“5
【在 R*****w 的大作中提到】
: 这个是行不通的,一旦引物加到反应体系里了你就没法控制引物binding到那一端?
: 随机引物可以做正向的也可以做反向的。
: 但是我有一个方法,是我以前扩增Novel病毒是想到的,而且很有效。
: 在做反转录时用特殊的随机引物,在随机引物的5'端加一段已知序列例如:5'-
: GCTACTAGTCGATCGTnnnnnn-3'。这样你就在所有cDNA的5’端加了一个Tail。
: 然后做PCR时forward primer用你的5’端Gene specific引物,反向引物用这个tail“5
: '-GCTACTAGTCGATCGT-3'”你就肯定能扩到3’端,可以一步一步往3’端扩。
: 可能ronbell想说的也是这种方法吧?
: 其实Race最麻烦的还是5’-race。这以前一直用一个酶在cDNA的3’端加A。但不是很有
: 效,有时可以扩到5’端的序列有时弄很难
R*w
17 楼
需要你自己设计序列,让公司合成的。这段tail序列可以是任意序列,但你需要先
blast一下,不要找个与human或mouse的genome相似性很高的,否则你会有麻烦。
理论上会有很多条带,甚至smear,但实际上只会有1-3条带,你可以只挑最大的那条
带做克隆测序就可以了。
good luck
blast一下,不要找个与human或mouse的genome相似性很高的,否则你会有麻烦。
理论上会有很多条带,甚至smear,但实际上只会有1-3条带,你可以只挑最大的那条
带做克隆测序就可以了。
good luck
C*e
18 楼
你想到的这个有个类似的方法几年前就有人发表了
用RNA Ligase加一个自己设计的adaptor(DNA)到RNA的3'端,
然后用gene specific forward primer和adaptor specific reverse primer扩增
5'RACE也可以用这个方法做
我试过这个方法的3' RACE,还蛮方便的
因为我做的原核,没有poly-A tail,没有kit可以用
这个方法帮了我大忙
“5
【在 R*****w 的大作中提到】
: 这个是行不通的,一旦引物加到反应体系里了你就没法控制引物binding到那一端?
: 随机引物可以做正向的也可以做反向的。
: 但是我有一个方法,是我以前扩增Novel病毒是想到的,而且很有效。
: 在做反转录时用特殊的随机引物,在随机引物的5'端加一段已知序列例如:5'-
: GCTACTAGTCGATCGTnnnnnn-3'。这样你就在所有cDNA的5’端加了一个Tail。
: 然后做PCR时forward primer用你的5’端Gene specific引物,反向引物用这个tail“5
: '-GCTACTAGTCGATCGT-3'”你就肯定能扩到3’端,可以一步一步往3’端扩。
: 可能ronbell想说的也是这种方法吧?
: 其实Race最麻烦的还是5’-race。这以前一直用一个酶在cDNA的3’端加A。但不是很有
: 效,有时可以扩到5’端的序列有时弄很难
用RNA Ligase加一个自己设计的adaptor(DNA)到RNA的3'端,
然后用gene specific forward primer和adaptor specific reverse primer扩增
5'RACE也可以用这个方法做
我试过这个方法的3' RACE,还蛮方便的
因为我做的原核,没有poly-A tail,没有kit可以用
这个方法帮了我大忙
“5
【在 R*****w 的大作中提到】
: 这个是行不通的,一旦引物加到反应体系里了你就没法控制引物binding到那一端?
: 随机引物可以做正向的也可以做反向的。
: 但是我有一个方法,是我以前扩增Novel病毒是想到的,而且很有效。
: 在做反转录时用特殊的随机引物,在随机引物的5'端加一段已知序列例如:5'-
: GCTACTAGTCGATCGTnnnnnn-3'。这样你就在所有cDNA的5’端加了一个Tail。
: 然后做PCR时forward primer用你的5’端Gene specific引物,反向引物用这个tail“5
: '-GCTACTAGTCGATCGT-3'”你就肯定能扩到3’端,可以一步一步往3’端扩。
: 可能ronbell想说的也是这种方法吧?
: 其实Race最麻烦的还是5’-race。这以前一直用一个酶在cDNA的3’端加A。但不是很有
: 效,有时可以扩到5’端的序列有时弄很难
R*w
19 楼
你说的用RNA ligase我后来也见过。但直接在RT的时候加一个tail比那种合成cDNA后再加tail更方便、更有效。毕竟合成cDNA后,再加tail不是100%cDNA都会有tail。
我这个方法是我当时自己想到的,但我一直没发表,后来博士毕业了不做测序工作了,也没想过去发表。好多年了不知是否其他有人发表类似的方法,估计也会有其他人想到。
【在 C*******e 的大作中提到】
: 你想到的这个有个类似的方法几年前就有人发表了
: 用RNA Ligase加一个自己设计的adaptor(DNA)到RNA的3'端,
: 然后用gene specific forward primer和adaptor specific reverse primer扩增
: 5'RACE也可以用这个方法做
: 我试过这个方法的3' RACE,还蛮方便的
: 因为我做的原核,没有poly-A tail,没有kit可以用
: 这个方法帮了我大忙
:
: “5
我这个方法是我当时自己想到的,但我一直没发表,后来博士毕业了不做测序工作了,也没想过去发表。好多年了不知是否其他有人发表类似的方法,估计也会有其他人想到。
【在 C*******e 的大作中提到】
: 你想到的这个有个类似的方法几年前就有人发表了
: 用RNA Ligase加一个自己设计的adaptor(DNA)到RNA的3'端,
: 然后用gene specific forward primer和adaptor specific reverse primer扩增
: 5'RACE也可以用这个方法做
: 我试过这个方法的3' RACE,还蛮方便的
: 因为我做的原核,没有poly-A tail,没有kit可以用
: 这个方法帮了我大忙
:
: “5
R*w
20 楼
其实要做5'or3'race还有一种方法:用ligase把cNDA连成环状,然后用背对背的PCR引
物做PCR。可以同时把5'or3'序列都得到,这种方法理论上很perfect,但实际上还是不
太有效
物做PCR。可以同时把5'or3'序列都得到,这种方法理论上很perfect,但实际上还是不
太有效
C*e
23 楼
用RNA ligase的那个不是在合成cDNA以后加tail
是mRNA直接加tail
然后再RT-PCR
再加tail
更方便、更有效。毕竟合成cDNA后,再加tail不是100%cDNA都会有tail。
,也没想过去发
表。好多年了不知是否其他有人发表类似的方法,估计也会有其他人想到。
【在 R*****w 的大作中提到】
: 你说的用RNA ligase我后来也见过。但直接在RT的时候加一个tail比那种合成cDNA后再加tail更方便、更有效。毕竟合成cDNA后,再加tail不是100%cDNA都会有tail。
: 我这个方法是我当时自己想到的,但我一直没发表,后来博士毕业了不做测序工作了,也没想过去发表。好多年了不知是否其他有人发表类似的方法,估计也会有其他人想到。
是mRNA直接加tail
然后再RT-PCR
再加tail
更方便、更有效。毕竟合成cDNA后,再加tail不是100%cDNA都会有tail。
,也没想过去发
表。好多年了不知是否其他有人发表类似的方法,估计也会有其他人想到。
【在 R*****w 的大作中提到】
: 你说的用RNA ligase我后来也见过。但直接在RT的时候加一个tail比那种合成cDNA后再加tail更方便、更有效。毕竟合成cDNA后,再加tail不是100%cDNA都会有tail。
: 我这个方法是我当时自己想到的,但我一直没发表,后来博士毕业了不做测序工作了,也没想过去发表。好多年了不知是否其他有人发表类似的方法,估计也会有其他人想到。
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