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菜鸟定向克隆求助，谢谢~

菜鸟定向克隆求助，谢谢~# Biology - 生物学

s*l2010-05-09 07:05

1 楼

现在张嘉译就是电视剧演员的标杆！
张嘉译继《奸细》之后被罗天刚等人物的扮演者们超越之后，再次中枪！
＊＊＊＊＊＊＊＊
看了《乡村爱情》全部5部之后，发现其五大主力：刘能赵四刘大脑袋谢广坤王长贵的
扮演者的表演功力已经全部集体鲤鱼跳龙门，超越了张嘉译！
＊＊＊＊＊＊＊
刘能扮演者：王小利。黑龙江人，1969年4月28日生，毕业于本山艺术学院，赵本山的
第5个徒弟。刘能这个角色很有意思，说话结巴，坏点子多，爱欺负人，重感情，怕老
婆。王小利把这些特点淋漓尽致的表现的出来！
在演《乡村爱情》里的刘能的时候，王小利说“这么好的角色我肯定愿意接啊，但也有
压力。给我角色那天，我师傅说这个刘能戏挺重啊！我一听戏挺重，当时心跳就加速了
！后来听说刘能是个磕巴，我又有点心里没底了。我跟导演沟通，导演说，这个磕巴和
范伟那个磕巴必须要区别开，你要是跟人家演得一样，你演不过人家。”为了那个磕巴
刘能，王小利研究了半个多月。在选造型的时候，王小利找人给他画了十多张图纸，自
己也天天琢磨。后来选了一个光头造型，留点小胡子，上穿个大背心，下穿个吊腿裤，
或者是大裤衩啥的，穿鞋还不能穿袜子，有点吊儿郎当的。这种人在农村很常见，这才
是适合人物的造型。
＊＊＊＊＊＊
赵四扮演者：刘小光，吉林省桦甸市人，1974年3月20日生，赵本山的第24个徒弟。这
个角色竟受刘能欺负了，但是很有理性，勤劳朴实，特讲规矩，胆小怕事。最搞笑的特
征是嘴总咧一下子。
＊＊＊＊＊＊
刘大脑袋：刘流，原名刘延宾，国家一级演员，本山传媒副总裁。1963年5月生于黑龙
江省哈尔滨市，师承相声演员赵春田。曾经八次登上央视春晚。
在《乡村爱情》系列里面，他把刘大脑袋这个好吃懒做，迎风拍马，欺上瞒下，好色还
官迷的角色演得出神入化！
＊＊＊＊＊＊
谢广坤扮演者：唐鉴军，1968年12月1日生，籍贯吉林省舒兰市，二人转资深演员，是
赵本山高徒之一，现任辽宁民间艺术团团长，辽宁省曲艺家协会理事。
谢广坤这个角色几乎是最让人深恶痛绝的，但是我们生活中确实有这种小人：精明强干，
为了儿子不顾一切，总想操纵被人，领导欲望特强，脾气暴躁，见谁都不服，见谁敢和
谁玩命，他惹了所有人，包括自己老婆，自己儿子都不认他，自己女儿都不让他抱外孙
子。优点是敢说别人不敢说的真话。在生活中，有时候就期待这样人来放炮！
唐鉴军能把这个角色演好，太厉害了！
＊＊＊＊＊＊＊
王长贵扮演者：王小宝，1964年生，辽宁锦州黑山县人，二人转演员，曾在赵本山举办
的2001“东三省本山杯二人转大赛”上取得第一名的好成绩，后拜赵本山为师。王长贵
这个角色的特点是性格沉稳有派头，但是爱慕虚荣，当了村主任就想进镇里，进了镇里
作干部之后，连连倒霉，生活特无奈。人挺好，但是总是遇上谢广坤刘大脑袋这种小人
，和他们斗来斗去。王小宝把这些特点充分的展现了出来！

x*o2010-05-09 07:05

2 楼

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M*e2010-05-09 07:05

3 楼

参考这个帖子做了2nand
http://bbs.gfan.com/android-183585-1-1.html
修改之前qudrant跑分才700多修改后就2100左右了

x*22010-05-09 07:05

4 楼

最近一个克隆做的很郁闷，还望各位高手相助~
谢谢！
由于实验需要，要把两个DNA片断插入到昆虫细胞表达载体(pFastbac)的同一个多克隆
位点中，该表达载体内的多克隆位点有BssHII，EcoR1, Xba1和HindIII。
我要插入的片段是：
EcoR1-片段1-Nhe1（Xba1的同尾酶），和Xba1-片段2-HindIII，
我尝试过三个片段一起连接(three way ligation)，板子上长的两个点都不对（平行做
的BssHII-片段4-Nhe1，Xba1-片段2-HindIII成功得到正确质粒）。
我后来先把片段2插入到载体中，得到质粒：载体-EcoR1-Xba1-片段2-HindIII-载体。
然后再尝试把EcoR1-片段1-Nhe1插入，板子上长的两个点还是都不对，得到的质粒用双
酶切鉴定好像是自连质粒（虽然我双酶切的载体-EcoR1-Xba1-片段2-HindIII-载体）。
个人认为不是双酶切载体的问题，因为：1，EcoR1, Xba1两个酶切位点相隔50bp；如果只
有一个酶切动了质粒那么应该会有很多自连载体，而我的板子上只得到两个点。
我测序鉴定过载体

s*32010-05-09 07:05

5 楼

张嘉译看了就不提神不覺得他有啥演技說帥不帥說丑不醜沒有個人特點

x*o2010-05-09 07:05

6 楼

g*q2010-05-09 07:05

7 楼

For EcoR I and Xba I, "Double digest is not recommended. A sequential digest
is required, using each enzyme in its supplied NEBuffer."--from NEWB
website.

s*l2010-05-09 07:05

8 楼

赵本山的剧的特点就是：自然。演员演得都很生活化。记得当初于月仙被采访时就说，
赵本山让她在开始演戏前务必忘掉在中戏学得东西，说他最怕演员带着从学校学来的东
西表演。

x*22010-05-09 07:05

9 楼

Thank you very much.
But actually I used EcoR1 HF instead of EcoR1, which can be used in the
double digestion with Xba1 in buffer 4 with BSA

i*t2010-05-09 07:05

10 楼

张宜家适合演共产党员！！！！！！！！！！

g*y2010-05-09 07:05

11 楼

看来看去，觉得问题很可能在片段1上。
你的片段1是怎么得到的呢？
有没可能你的片断末端跟你假设的不符？
比如假设是，EcoR1-片段1-Nhe1
其实是EcoR1-片段1-EcoR1－－如果你的片断1原来是在topo里面，就杯具了,除非是pcr primer末端加上nhe1位点。

【在 x**2 的大作中提到】

: 最近一个克隆做的很郁闷，还望各位高手相助~
: 谢谢！
: 由于实验需要，要把两个DNA片断插入到昆虫细胞表达载体(pFastbac)的同一个多克隆
: 位点中，该表达载体内的多克隆位点有BssHII，EcoR1, Xba1和HindIII。
: 我要插入的片段是：
: EcoR1-片段1-Nhe1（Xba1的同尾酶），和Xba1-片段2-HindIII，
: 我尝试过三个片段一起连接(three way ligation)，板子上长的两个点都不对（平行做
: 的BssHII-片段4-Nhe1，Xba1-片段2-HindIII成功得到正确质粒）。
: 我后来先把片段2插入到载体中，得到质粒：载体-EcoR1-Xba1-片段2-HindIII-载体。
: 然后再尝试把EcoR1-片段1-Nhe1插入，板子上长的两个点还是都不对，得到的质粒用双

s*l2010-05-09 07:05

12 楼

以上每个ID都有一双雪亮亮亮晶晶晶莹莹的大眼睛！

x*22010-05-09 07:05

13 楼

谢谢回复～
我的片段1确实是在TOPO里，
我的正向primer含EcoR1位点和6个保护碱基，反向pcr primer含Nhe1和6个保护碱基。扩出的片段末端加A后连到TOPO上。
这样会有问题么？
或者我把片段1前面的酶切位点改成BssHII？这样就和片段4的酶切位点一样了。
谢谢～

s*l2010-05-09 07:05

14 楼

说的太好了！

【在 s******3 的大作中提到】

: 张嘉译看了就不提神不覺得他有啥演技說帥不帥說丑不醜沒有個人特點

g*y2010-05-09 07:05

15 楼

假设所有序列分析都正确的话，
你的这个策略仍然存在一个缺欠（不确定就是这个问题）
就是， you don't know whether Nhe1 digestion is complete or not.
因为片断两端都有EcoR1位点，所以容易造成完全酶切的假象。
想像一下，如果somehow Nhe1didn't work,你根本就不知道,
回收的片断就是EcoR1-片断1－EcoR1。
既然你的片断已经在topo 里了，建议你做 sequential digestion.
先做Nhe1 digestion，然后取一点样品run gel,看是否完全linearize
（更精确的办法是取一点样品，加另外一个跟Nhe1不同测的topo上的单切点酶，
然后跑胶，确定只有两条带）。
然后再加EcoR1。最后回收所要片断。
这样可以最大限度避免EcoR1-片断1－EcoR1的存在。

。扩出的片段末端加A后连到TOPO上。

【在 x**2 的大作中提到】

: 谢谢回复～
: 我的片段1确实是在TOPO里，
: 我的正向primer含EcoR1位点和6个保护碱基，反向pcr primer含Nhe1和6个保护碱基。扩出的片段末端加A后连到TOPO上。
: 这样会有问题么？
: 或者我把片段1前面的酶切位点改成BssHII？这样就和片段4的酶切位点一样了。
: 谢谢～

s*l2010-05-09 07:05

16 楼

大脚还是中戏的呢？看来是《乡村爱情》里面学历最高的，像刘能（王小利）等都是
二人转上来的，最好也就是本山艺术学院。

【在 s****l 的大作中提到】

: 赵本山的剧的特点就是：自然。演员演得都很生活化。记得当初于月仙被采访时就说，
: 赵本山让她在开始演戏前务必忘掉在中戏学得东西，说他最怕演员带着从学校学来的东
: 西表演。

s*l2010-05-09 07:05

17 楼

你说的太对了！
我看了张嘉译无数的电视剧，从借枪到范党育，他永远是一个表情：皱眉头。后来我猜
测他那是在想台词呢。

【在 i******t 的大作中提到】

: 张宜家适合演共产党员！！！！！！！！！！

j*j2010-05-09 07:05

18 楼

赵的屯子戏，部分作品的编剧是刘老根里演乡委书记的何庆魁，也就是巅峰时期铁三角
中的高秀敏的丈夫。
刚才查了一下，乡村系列的编剧是张继。以前看这个乡村的时候，觉得剧组塑造的几个
很生活化的活灵活现的人物是比较有意思。如果不用这种找乐的形式讲述家事八卦，估
计不少人对那些人情世故的琐事是没有兴趣和耐心的。编剧把一些典型人物性格和为人
处世的态度，集中到剧中人物身上，感觉即鲜明夸张又真实。
比较搞笑的段子，比如以前的一集里谢广坤拎着一个树枝子站在门口，看着他的宝贝驴
在地上打滚（看来驴真的喜欢打滚），来人跟他客气地打招呼说：“广坤叔，打滚啊。
。。”
广坤叔为防止小两口分居而出现漏洞，连出损招帮倒忙。他自己跟梢去上海出差一趟，
果然很快很纯情地惦记上了一职业美女，拍照的时候还忍不住往美女身边倾斜。
赵四也很典型，老实胆小又较真。被亲家忽悠，说由于他为人不好，村里人知道他快抱
孙子了没一人高兴，只有眼红他的。结果他难过得，专门跑到老哥们家里，当面求证，
知道没那回事之后，感动得那个委屈啊。
张继[作家] - 简介
中国当代文坛颇负盛名的乡村现实主义小说作家。张继生于山东省枣庄市峄城区，1996
年进入北京鲁迅文学院作家班学习，1999年调入枣庄市文联创作室工作，2003年调入济
南市文联专业创作。已出版小说集《玉米、玉米地》、《人样》、《村长的耳朵》，长
篇小说《去城市受苦吧》，曾获山东省首届齐鲁文学奖，1998年度中国电影华表奖最佳
编剧奖。张继以风格独特的乡村题材小说与影视创作闻名全国。由他编剧的乡村题材轻
喜剧电影《惹事生非》、《男妇女主任》、电视连续剧《村长李四平》曾经红遍全国。
《乡村爱情》由张继编剧，本山艺术公司和北京庄稼院影视公司录制，是一部反映农村
青年爱情、婚姻、事业、生活的轻喜剧。2008年，由张继编剧的《石榴花开》、《乡村
爱情》2热播，以反映社会主义新农村建设引人关注。[1]
张继[作家] - 作品
著有长篇小说《去城里受苦吧》、《乡村爱情》，小说集《玉米地》、《村长的耳朵》
、《人样》。

【在 s**l 的大作中提到】

: 现在张嘉译就是电视剧演员的标杆！
: 张嘉译继《奸细》之后被罗天刚等人物的扮演者们超越之后，再次中枪！
: ＊＊＊＊＊＊＊＊
: 看了《乡村爱情》全部5部之后，发现其五大主力：刘能赵四刘大脑袋谢广坤王长贵的
: 扮演者的表演功力已经全部集体鲤鱼跳龙门，超越了张嘉译！
: ＊＊＊＊＊＊＊
: 刘能扮演者：王小利。黑龙江人，1969年4月28日生，毕业于本山艺术学院，赵本山的
: 第5个徒弟。刘能这个角色很有意思，说话结巴，坏点子多，爱欺负人，重感情，怕老
: 婆。王小利把这些特点淋漓尽致的表现的出来！
: 在演《乡村爱情》里的刘能的时候，王小利说“这么好的角色我肯定愿意接啊，但也有

M*u2010-05-09 07:05

19 楼

男妇女主任啊，太有印象了，原来赵本山的编剧这个张继这么厉害啊。

【在 j***j 的大作中提到】

: 赵的屯子戏，部分作品的编剧是刘老根里演乡委书记的何庆魁，也就是巅峰时期铁三角
: 中的高秀敏的丈夫。
: 刚才查了一下，乡村系列的编剧是张继。以前看这个乡村的时候，觉得剧组塑造的几个
: 很生活化的活灵活现的人物是比较有意思。如果不用这种找乐的形式讲述家事八卦，估
: 计不少人对那些人情世故的琐事是没有兴趣和耐心的。编剧把一些典型人物性格和为人
: 处世的态度，集中到剧中人物身上，感觉即鲜明夸张又真实。
: 比较搞笑的段子，比如以前的一集里谢广坤拎着一个树枝子站在门口，看着他的宝贝驴
: 在地上打滚（看来驴真的喜欢打滚），来人跟他客气地打招呼说：“广坤叔，打滚啊。
: 。。”
: 广坤叔为防止小两口分居而出现漏洞，连出损招帮倒忙。他自己跟梢去上海出差一趟，