EMSA疑问# Biology - 生物学
b*r
1 楼
Part-time H1B刚生效，能在同一个公司转成full-time H1B,请问需要哪些资料，如果
被拒，原来的part-time H1B会有影响吗？谢谢了。
被拒，原来的part-time H1B会有影响吗？谢谢了。
H*S
2 楼
请教一下，申请B2签证来美投简历和参加面试是合法的吗？
P*d
3 楼
IPAD2在家里上无线网，总掉线。。。
怎么回事啊？？要不停地重新连。。
求助大侠们帮助！ bow 先～～
怎么回事啊？？要不停地重新连。。
求助大侠们帮助！ bow 先～～
b*y
4 楼
最近刚开始做EMSA，我用的是Pierce的Lightshift kit. 多次实验都只看到
nonspecifec binding（不能被unlabeled oligo竞争掉）。我发现一个原因可能是
binding reaction里盐浓度过高，因为kit提供的binding buffer（10*）含有500mM
KCl,而我的nuclear extract最后是由high salt buffer提取的，F.C.225mM NaCl。于
是我省略了binding buffer，把最后的NaCl浓度调整在50-75mM，得到了一条specific
的binding，但是非常弱。
问题1. 我看到的paper和protocol都使有类似的binding buffer，而且也用类似方法提
取核蛋白，好像并不考虑nuclear extract里的盐浓度，事实上这个浓度很高。但是，
我的几个sample extract蛋白浓度不同，加入同样多的蛋白的话最终盐浓度就会不同。
大家怎么解决这个问题？透析又怕蛋白容易降解。
问题2. 我加入的nuclear extract的体积无法忽略，大概有10ul，因为我的蛋白浓度一
直很低。--我用high salt方法提核蛋白浓度一直很低，虽然已经使用了20M细胞，最终
获得<200ug蛋白。正常吗?
问题3. 我的specific band还是很弱，不知道应该如何调节binding的条件？我现在的
binding condition是：75mM Nacl， 10mMHEPES， 8%Glycerol， 1mM EDTA， 4mM
MgCl2， 2mM DTT。6% native PAGE， running buffer是 0.5* TBE。我的目标蛋白大
概是140kD， probe 23bp.
谢谢指教！
nonspecifec binding（不能被unlabeled oligo竞争掉）。我发现一个原因可能是
binding reaction里盐浓度过高，因为kit提供的binding buffer（10*）含有500mM
KCl,而我的nuclear extract最后是由high salt buffer提取的，F.C.225mM NaCl。于
是我省略了binding buffer，把最后的NaCl浓度调整在50-75mM，得到了一条specific
的binding，但是非常弱。
问题1. 我看到的paper和protocol都使有类似的binding buffer，而且也用类似方法提
取核蛋白，好像并不考虑nuclear extract里的盐浓度，事实上这个浓度很高。但是，
我的几个sample extract蛋白浓度不同，加入同样多的蛋白的话最终盐浓度就会不同。
大家怎么解决这个问题？透析又怕蛋白容易降解。
问题2. 我加入的nuclear extract的体积无法忽略，大概有10ul，因为我的蛋白浓度一
直很低。--我用high salt方法提核蛋白浓度一直很低，虽然已经使用了20M细胞，最终
获得<200ug蛋白。正常吗?
问题3. 我的specific band还是很弱，不知道应该如何调节binding的条件？我现在的
binding condition是：75mM Nacl， 10mMHEPES， 8%Glycerol， 1mM EDTA， 4mM
MgCl2， 2mM DTT。6% native PAGE， running buffer是 0.5* TBE。我的目标蛋白大
概是140kD， probe 23bp.
谢谢指教！
m*n
5 楼
移民律师
【在 b*********r 的大作中提到】
: Part-time H1B刚生效，能在同一个公司转成full-time H1B,请问需要哪些资料，如果
: 被拒，原来的part-time H1B会有影响吗？谢谢了。
f*n
6 楼
合法
l*t
7 楼
check your modem or router status
B*N
8 楼
透析一下试试。我的蛋白量也很少，EMSA根本不行。后来透析了就work了。
H*S
9 楼
谢谢回答！
弱问B1和B2的区别在哪里呢？
【在 f*******n 的大作中提到】
: 合法
弱问B1和B2的区别在哪里呢？
【在 f*******n 的大作中提到】
: 合法
P*d
10 楼
laptop 就很好没有事， ipad就使劲掉线。。。
【在 l******t 的大作中提到】
: check your modem or router status
【在 l******t 的大作中提到】
: check your modem or router status
w*e
11 楼
try millipore YM columns for buffer exchange+concentration?
specific
【在 b**y 的大作中提到】
: 最近刚开始做EMSA，我用的是Pierce的Lightshift kit. 多次实验都只看到
: nonspecifec binding（不能被unlabeled oligo竞争掉）。我发现一个原因可能是
: binding reaction里盐浓度过高，因为kit提供的binding buffer（10*）含有500mM
: KCl,而我的nuclear extract最后是由high salt buffer提取的，F.C.225mM NaCl。于
: 是我省略了binding buffer，把最后的NaCl浓度调整在50-75mM，得到了一条specific
: 的binding，但是非常弱。
: 问题1. 我看到的paper和protocol都使有类似的binding buffer，而且也用类似方法提
: 取核蛋白，好像并不考虑nuclear extract里的盐浓度，事实上这个浓度很高。但是，
: 我的几个sample extract蛋白浓度不同，加入同样多的蛋白的话最终盐浓度就会不同。
: 大家怎么解决这个问题？透析又怕蛋白容易降解。
specific
【在 b**y 的大作中提到】
: 最近刚开始做EMSA，我用的是Pierce的Lightshift kit. 多次实验都只看到
: nonspecifec binding（不能被unlabeled oligo竞争掉）。我发现一个原因可能是
: binding reaction里盐浓度过高，因为kit提供的binding buffer（10*）含有500mM
: KCl,而我的nuclear extract最后是由high salt buffer提取的，F.C.225mM NaCl。于
: 是我省略了binding buffer，把最后的NaCl浓度调整在50-75mM，得到了一条specific
: 的binding，但是非常弱。
: 问题1. 我看到的paper和protocol都使有类似的binding buffer，而且也用类似方法提
: 取核蛋白，好像并不考虑nuclear extract里的盐浓度，事实上这个浓度很高。但是，
: 我的几个sample extract蛋白浓度不同，加入同样多的蛋白的话最终盐浓度就会不同。
: 大家怎么解决这个问题？透析又怕蛋白容易降解。
f*n
12 楼
B1是business原因去的。B2是个人原因去的。
【在 H***S 的大作中提到】
: 谢谢回答！
: 弱问B1和B2的区别在哪里呢？
【在 H***S 的大作中提到】
: 谢谢回答！
: 弱问B1和B2的区别在哪里呢？
P*d
13 楼
嗯有仙人指点要把router改成静态设置。。。worked了
【在 P*********d 的大作中提到】
: IPAD2在家里上无线网，总掉线。。。
: 怎么回事啊？？要不停地重新连。。
: 求助大侠们帮助！ bow 先～～
【在 P*********d 的大作中提到】
: IPAD2在家里上无线网，总掉线。。。
: 怎么回事啊？？要不停地重新连。。
: 求助大侠们帮助！ bow 先～～
b*y
14 楼
Thanks! Which product did you use?
【在 B****N 的大作中提到】
: 透析一下试试。我的蛋白量也很少，EMSA根本不行。后来透析了就work了。
【在 B****N 的大作中提到】
: 透析一下试试。我的蛋白量也很少，EMSA根本不行。后来透析了就work了。
E*1
15 楼
我今天刚买了个ipad2 3g版的，家里连无线一开始能连上，之后就老掉线，再之后就干
脆连不上了，重启都没用。。。电脑连wifi一切正常...果粉们救救我吧～
【在 P*********d 的大作中提到】
: IPAD2在家里上无线网，总掉线。。。
: 怎么回事啊？？要不停地重新连。。
: 求助大侠们帮助！ bow 先～～
B*N
16 楼
millipore
P*d
17 楼
你试试这个。。
http://bbs.weiphone.com/read-htm-tid-2595342.html
【在 E***1 的大作中提到】
:
: 我今天刚买了个ipad2 3g版的，家里连无线一开始能连上，之后就老掉线，再之后就干
: 脆连不上了，重启都没用。。。电脑连wifi一切正常...果粉们救救我吧～
http://bbs.weiphone.com/read-htm-tid-2595342.html
【在 E***1 的大作中提到】
:
: 我今天刚买了个ipad2 3g版的，家里连无线一开始能连上，之后就老掉线，再之后就干
: 脆连不上了，重启都没用。。。电脑连wifi一切正常...果粉们救救我吧～
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