m*y
2 楼
F1 Visa回上海探亲，如果是免面试的通过中信递签，大概要多久才能拿到护照，因为
要考虑定机票。 大概 9 - 11 月当中回国。 谢谢
要考虑定机票。 大概 9 - 11 月当中回国。 谢谢
S*u
3 楼
一面面金盾飞舞着，为高德奥瑞挡下了所有攻击。刚德吐气开声，大地之子的血脉力量
瞬间激发，巨斧接连斩开两面金盾，直到第三面金盾处才力尽而止。
绯色的短刀则在刺中金盾瞬间，忽然变得若有若无，刀锋直接洞穿四面金盾，至第
五面方止。从全力一击的爆发战力来看，绯色倒是比刚德高了不少。
刚德一脸懊恼，深为自己被绯色比了下去而苦恼，很是觉得自己没用。可是高德奥
瑞却不这样想，当刚德一斧斩开金盾时，他的眼皮就跳了一下，第二面金盾被斩开时，
金之子的脸色都有些变了！他用斗气凝聚出的金盾每一面都有抵挡法罗镇国强者全力一
击之力，也就是正常而言，高德奥瑞可以同时抵挡住十几位法罗镇国强者的围攻。
但是金之子还没有惊讶完，后方的绯色就一刀洞穿了四面金盾！这一下差点让高德
奥瑞叫出来。
在高德奥瑞眼中，刚德和绯色不过是十八级而已，和法罗普通镇国强者实力相当。
然而刚德一斧之力堪堪要比得上三名法罗镇国强者，这已经够让他吃惊了，绯色全力一
击竟然超过四名镇国强者的合力！甚至可以说，绯色一刀之威，已经大到让金之子有些
想不通了。
此时此刻，在正前方，李察那颗火球也飞了过来。当这颗诡异的火球飞近时，高德
奥瑞危险的感觉更加强烈，他骤然后退，一下子用身体撞开绯色，然后把所余八面金盾
全部用来拦截这颗火球。
火球撞在金盾上立刻破裂，核心中如液体一样的蓝色火焰倾泻出来，瞬间就将挡路
的金盾熔毁。后续七面金盾接连迎上蓝色液火，然后一一损毁。蓝火的颜色也一路转红
，终于化为普通的烈火。火红色的烈焰喷发了数十米，声势惊人，可是威力却是不及一
滴蓝色液火。
这颗火球的威力远远超出高德奥瑞的想象，蓝色液火的形态也让他感觉到极为熟悉
，好象在哪里看到过一样。而且蓝色液火的温度极高，正是各种金属的克星，让高德奥
瑞看得胆战心惊。
到这个时候，金之子再也不敢有所保留，反手一挥，手上光芒大亮，就象一只金色
的巨掌狠狠拍在刚德身上，将他远远拍飞。驱赶开了绯色和刚德，高德奥瑞才盯住李察
，脸上满是戒备之意。
这时李察身上泛起一层淡蓝色的光芒，光芒并不明显，甚至比普通圣域的斗气爆发
还要弱些，更比不上大魔导师那些护身魔法的璀璨光辉。然而在高德奥瑞眼中，却在这
淡淡的光芒中看到了许多浮动的神文。金之子对这些神文符号都是异常的熟悉，因为其
中大多都和他感知和掌控的金属规则相关，所以才能被看到。
看到这些神文，高德奥瑞脸色即刻大变，因为这意味着两件事：一是李察已经掌握
了规则，这是传奇领域的铁证！二就是李察掌握的居然也是金属规则，这意味着双方将
在领域和规则上展开争夺，也意味着他最顶端的实力将受到影响。
李察竟然是传奇？
高德奥瑞还没有反应过来，就见李察已凝停在百米外的空中，双手间又凝聚出一颗
火球，这次的火球又有变化，透过表面一层淡淡的火焰，可以看到里面全是流动的蓝色
液火，而且蓝焰表面还泛起了金属光泽。
火球无声无息地飞来，速度比上一颗快了近一倍，让高德奥瑞躲无可躲！金之子发
出惊天动地的狂吼，金色光芒如潮水般涌出，遥遥望去，空中就是一根近百米高的巨大
金色火柱！一面面金色盾牌不断从金色火柱中飞出，挡向射来的火球。然而那些金色小
盾在接近蓝火时，表面的金色立刻变得暗淡了许多，表面精美的花纹则锈蚀磨损，就好
象已在时光中冲刷多年了一样。高德奥瑞心中一沉，李察确实掌控了金属规则，而且程
度并不低。因此双方在争夺周围的能量，这才让高德奥瑞凝聚出的金盾威力大降，至少
少了三分之一。
蓝色液火火球这次的威力却是大增，直接冲毁了两面金盾，表面的火焰才耗尽，让
里面包裹着的蓝色液火倾泻出来。蓝色液火如有生命，主动扑向一面面金盾，都是在接
触的瞬间就将它们熔毁。金之子的脸上蒙上了一层青气，不断加催斗气，金盾源源不绝
。直到消耗了二十余面金盾，才算最终把李察的液火拦了下来。
“这是毁灭之星的火焰！你怎么会有毁灭之星的火焰？！你究竟是谁？”高德奥瑞
惊呼着，他终于想起了蓝色液火的来源。但是显然，这竟让金之子显得惊慌失措。
李察双臂平伸，双手手心中又各自凝聚出一颗火球，而且火球也在迅速变异。
李察根本没有听说过什么毁灭之星，也不知道这是不是苍蓝之月在法罗的叫法。那
枚火球附加了诸多超魔效果后，又加上了毁灭真名和苍蓝之月的属性，威力已是变得极
为可怕，已经直追九级魔法，魔力消耗则在八级魔法的水平上。刚才那记对轰，李察还
没有出全力，就已经接近将高德奥瑞全力的防御击溃。单纯以调动的能量来说，高德奥
瑞还要远在李察之上。可是他的力量不够凝练，属性上也被李察完克，所以才会有如此
悬殊的战果。
呼呼两声，两颗蓝色火球呼啸着向高德奥瑞飞来。前面两颗火球刚到，后面就又飞
上来两颗，而李察双手中又开始凝聚新的蓝火火球！
高德奥瑞已经接得十分狼狈，他甚至要靠身法拉开几颗火球，为自己争取多一些恢
复的时间，这样才能够不受伤地接下连续六颗蓝色液火的火球。就在他刚刚松了口气的
时候，身周金色光芒猛然一暗，变得极不稳定。就在这个时候，李察没有继续进攻，而
是全力同他争夺金属规则的控制权！
高德奥瑞本能地感觉到了不妙，但是在争夺法则控制权的时候，他的速度、反应和
防御都不可避免地有所下降。而就在这时，一道黑气落在他的头上，但这不是魔法，而
是神术的力量！高德奥瑞骤然感觉到自己身体沉重如山，再也维持不住浮空状态，竟然
一头向地面栽去，重重摔在地上！
金之子羞怒交加，几欲发狂，他站起来四处张望，正好看到了在急速后退的黑暗牧
师阿西瑞斯。
“还想跑吗？”高德奥瑞狞笑着，大步向阿西瑞斯追去。他的脚步极大，速度直是
阿西瑞斯的一倍，而且笔直向着黑暗牧师追去，沿途凡是进入他十米范围内的战士，都
会瞬间被淡淡的金色劲气切成无数块。金之子直接在李察的军阵中奔驰，硬是踏出了一
条巨大的血肉长廊。他又是在拿屠杀普通战士来泄愤，因为阿西瑞斯让他受了羞辱，所
以变成了高德奥瑞誓杀的目标。
就在这时，侧方忽然出现了一座小山般的身影，食人魔领主大步奔出，十吨当头砸
下！高德奥瑞横剑一架，发力狂吼，迸发的惊人力量竟然把食人魔给轰飞出去！然而高
德奥瑞显然错估了食人魔领主的恐怖实力，他自己也后退了几大步，每退一步，脚下的
地面都会瞬间金属化，但是地面就是坚固了数十倍，也一样承载不住高德奥瑞的身体，
他每一步都深深陷入金属化的地面。当高德奥瑞终于站稳时，忍不住喷出一口鲜血。刚
才硬拼食人魔领主这一下，竟然让他受了不轻的伤。
这时在金之子的视野中，不知从哪里冒出来一个装束奇特的少女，提着一根黑沉沉
的铁棍，以有些笨拙滑稽的动作一棍扫来。
高德奥瑞脸上立刻闪过怒色，这个少女不过十三四级的样子，就这种垃圾货色也敢
向他挑衅？可是高德奥瑞心底也有些疑惑，这么弱的家伙，究竟是怎么凑到他身边，而
没有被发觉的？
金之子巨剑竖立，挡在蛮族少女的铁棍前。蛮族少女忽然嘿的一声叫，双手用力，
铁棍速度又快了几分。铁棍和双手巨剑还没有开始接触，两者之间的空处就开始闪耀着
深色的电芒。而双手巨剑竟然微微扭曲！
高德奥瑞惊骇欲绝，知道自己随手一架，绝对挡不住这沉重到恐怖地步的一棍。他
立刻单膝落地，另一只手也扶上了剑锋，整个人瞬间浮现出一片金属光芒，竟是金属化
了，让自己与巨剑连成一体。
铁棍狠狠砸在巨剑上，发出让人牙酸的声音。双方僵持了一瞬，山与海就倒飞数十
米，铁棍十一吨也脱手飞出。而高德奥瑞则是死盯着自己的双手剑。那把巨剑初时还安
然无恙，但倾刻间向内弯曲，到了极致处只听啪的一声，剑刃竟然断成两截！
高德奥瑞脸上金色尽褪，变得全无血色，喉间不断上下起伏，显然一口鲜血正在要
吐未吐之间。
就在数十米外，李察也从空中落下，把山与海扶了起来，问：“怎么样？”
蛮族少女用力摇晃了几下脑袋，说：“有点晕。”
高德奥瑞脸色立刻变得极为难看。他如此凶狠的反击，那个蛮族少女就只是有点晕
？
瞬间激发，巨斧接连斩开两面金盾，直到第三面金盾处才力尽而止。
绯色的短刀则在刺中金盾瞬间，忽然变得若有若无，刀锋直接洞穿四面金盾，至第
五面方止。从全力一击的爆发战力来看，绯色倒是比刚德高了不少。
刚德一脸懊恼，深为自己被绯色比了下去而苦恼，很是觉得自己没用。可是高德奥
瑞却不这样想，当刚德一斧斩开金盾时，他的眼皮就跳了一下，第二面金盾被斩开时，
金之子的脸色都有些变了！他用斗气凝聚出的金盾每一面都有抵挡法罗镇国强者全力一
击之力，也就是正常而言，高德奥瑞可以同时抵挡住十几位法罗镇国强者的围攻。
但是金之子还没有惊讶完，后方的绯色就一刀洞穿了四面金盾！这一下差点让高德
奥瑞叫出来。
在高德奥瑞眼中，刚德和绯色不过是十八级而已，和法罗普通镇国强者实力相当。
然而刚德一斧之力堪堪要比得上三名法罗镇国强者，这已经够让他吃惊了，绯色全力一
击竟然超过四名镇国强者的合力！甚至可以说，绯色一刀之威，已经大到让金之子有些
想不通了。
此时此刻，在正前方，李察那颗火球也飞了过来。当这颗诡异的火球飞近时，高德
奥瑞危险的感觉更加强烈，他骤然后退，一下子用身体撞开绯色，然后把所余八面金盾
全部用来拦截这颗火球。
火球撞在金盾上立刻破裂，核心中如液体一样的蓝色火焰倾泻出来，瞬间就将挡路
的金盾熔毁。后续七面金盾接连迎上蓝色液火，然后一一损毁。蓝火的颜色也一路转红
，终于化为普通的烈火。火红色的烈焰喷发了数十米，声势惊人，可是威力却是不及一
滴蓝色液火。
这颗火球的威力远远超出高德奥瑞的想象，蓝色液火的形态也让他感觉到极为熟悉
，好象在哪里看到过一样。而且蓝色液火的温度极高，正是各种金属的克星，让高德奥
瑞看得胆战心惊。
到这个时候，金之子再也不敢有所保留，反手一挥，手上光芒大亮，就象一只金色
的巨掌狠狠拍在刚德身上，将他远远拍飞。驱赶开了绯色和刚德，高德奥瑞才盯住李察
，脸上满是戒备之意。
这时李察身上泛起一层淡蓝色的光芒，光芒并不明显，甚至比普通圣域的斗气爆发
还要弱些，更比不上大魔导师那些护身魔法的璀璨光辉。然而在高德奥瑞眼中，却在这
淡淡的光芒中看到了许多浮动的神文。金之子对这些神文符号都是异常的熟悉，因为其
中大多都和他感知和掌控的金属规则相关，所以才能被看到。
看到这些神文，高德奥瑞脸色即刻大变，因为这意味着两件事：一是李察已经掌握
了规则，这是传奇领域的铁证！二就是李察掌握的居然也是金属规则，这意味着双方将
在领域和规则上展开争夺，也意味着他最顶端的实力将受到影响。
李察竟然是传奇？
高德奥瑞还没有反应过来，就见李察已凝停在百米外的空中，双手间又凝聚出一颗
火球，这次的火球又有变化，透过表面一层淡淡的火焰，可以看到里面全是流动的蓝色
液火，而且蓝焰表面还泛起了金属光泽。
火球无声无息地飞来，速度比上一颗快了近一倍，让高德奥瑞躲无可躲！金之子发
出惊天动地的狂吼，金色光芒如潮水般涌出，遥遥望去，空中就是一根近百米高的巨大
金色火柱！一面面金色盾牌不断从金色火柱中飞出，挡向射来的火球。然而那些金色小
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象已在时光中冲刷多年了一样。高德奥瑞心中一沉，李察确实掌控了金属规则，而且程
度并不低。因此双方在争夺周围的能量，这才让高德奥瑞凝聚出的金盾威力大降，至少
少了三分之一。
蓝色液火火球这次的威力却是大增，直接冲毁了两面金盾，表面的火焰才耗尽，让
里面包裹着的蓝色液火倾泻出来。蓝色液火如有生命，主动扑向一面面金盾，都是在接
触的瞬间就将它们熔毁。金之子的脸上蒙上了一层青气，不断加催斗气，金盾源源不绝
。直到消耗了二十余面金盾，才算最终把李察的液火拦了下来。
“这是毁灭之星的火焰！你怎么会有毁灭之星的火焰？！你究竟是谁？”高德奥瑞
惊呼着，他终于想起了蓝色液火的来源。但是显然，这竟让金之子显得惊慌失措。
李察双臂平伸，双手手心中又各自凝聚出一颗火球，而且火球也在迅速变异。
李察根本没有听说过什么毁灭之星，也不知道这是不是苍蓝之月在法罗的叫法。那
枚火球附加了诸多超魔效果后，又加上了毁灭真名和苍蓝之月的属性，威力已是变得极
为可怕，已经直追九级魔法，魔力消耗则在八级魔法的水平上。刚才那记对轰，李察还
没有出全力，就已经接近将高德奥瑞全力的防御击溃。单纯以调动的能量来说，高德奥
瑞还要远在李察之上。可是他的力量不够凝练，属性上也被李察完克，所以才会有如此
悬殊的战果。
呼呼两声，两颗蓝色火球呼啸着向高德奥瑞飞来。前面两颗火球刚到，后面就又飞
上来两颗，而李察双手中又开始凝聚新的蓝火火球！
高德奥瑞已经接得十分狼狈，他甚至要靠身法拉开几颗火球，为自己争取多一些恢
复的时间，这样才能够不受伤地接下连续六颗蓝色液火的火球。就在他刚刚松了口气的
时候，身周金色光芒猛然一暗，变得极不稳定。就在这个时候，李察没有继续进攻，而
是全力同他争夺金属规则的控制权！
高德奥瑞本能地感觉到了不妙，但是在争夺法则控制权的时候，他的速度、反应和
防御都不可避免地有所下降。而就在这时，一道黑气落在他的头上，但这不是魔法，而
是神术的力量！高德奥瑞骤然感觉到自己身体沉重如山，再也维持不住浮空状态，竟然
一头向地面栽去，重重摔在地上！
金之子羞怒交加，几欲发狂，他站起来四处张望，正好看到了在急速后退的黑暗牧
师阿西瑞斯。
“还想跑吗？”高德奥瑞狞笑着，大步向阿西瑞斯追去。他的脚步极大，速度直是
阿西瑞斯的一倍，而且笔直向着黑暗牧师追去，沿途凡是进入他十米范围内的战士，都
会瞬间被淡淡的金色劲气切成无数块。金之子直接在李察的军阵中奔驰，硬是踏出了一
条巨大的血肉长廊。他又是在拿屠杀普通战士来泄愤，因为阿西瑞斯让他受了羞辱，所
以变成了高德奥瑞誓杀的目标。
就在这时，侧方忽然出现了一座小山般的身影，食人魔领主大步奔出，十吨当头砸
下！高德奥瑞横剑一架，发力狂吼，迸发的惊人力量竟然把食人魔给轰飞出去！然而高
德奥瑞显然错估了食人魔领主的恐怖实力，他自己也后退了几大步，每退一步，脚下的
地面都会瞬间金属化，但是地面就是坚固了数十倍，也一样承载不住高德奥瑞的身体，
他每一步都深深陷入金属化的地面。当高德奥瑞终于站稳时，忍不住喷出一口鲜血。刚
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高德奥瑞脸上立刻闪过怒色，这个少女不过十三四级的样子，就这种垃圾货色也敢
向他挑衅？可是高德奥瑞心底也有些疑惑，这么弱的家伙，究竟是怎么凑到他身边，而
没有被发觉的？
金之子巨剑竖立，挡在蛮族少女的铁棍前。蛮族少女忽然嘿的一声叫，双手用力，
铁棍速度又快了几分。铁棍和双手巨剑还没有开始接触，两者之间的空处就开始闪耀着
深色的电芒。而双手巨剑竟然微微扭曲！
高德奥瑞惊骇欲绝，知道自己随手一架，绝对挡不住这沉重到恐怖地步的一棍。他
立刻单膝落地，另一只手也扶上了剑锋，整个人瞬间浮现出一片金属光芒，竟是金属化
了，让自己与巨剑连成一体。
铁棍狠狠砸在巨剑上，发出让人牙酸的声音。双方僵持了一瞬，山与海就倒飞数十
米，铁棍十一吨也脱手飞出。而高德奥瑞则是死盯着自己的双手剑。那把巨剑初时还安
然无恙，但倾刻间向内弯曲，到了极致处只听啪的一声，剑刃竟然断成两截！
高德奥瑞脸上金色尽褪，变得全无血色，喉间不断上下起伏，显然一口鲜血正在要
吐未吐之间。
就在数十米外，李察也从空中落下，把山与海扶了起来，问：“怎么样？”
蛮族少女用力摇晃了几下脑袋，说：“有点晕。”
高德奥瑞脸色立刻变得极为难看。他如此凶狠的反击，那个蛮族少女就只是有点晕
？
a*0
4 楼
RT
x*x
5 楼
Mutagenesis help：请问如何插入一段 ~20bp的片段 （large vector+insert）？
Vector: 5kb
Insert: 4kb
total: 9kb
用Stratagene (agilent)的程序设计的引物。
试着用QuikChange XL kit, 不同的polymerase (PFU ultra, PrimeStar supermix, HF
PCR supermix), DMSO浓度。全都不行。
请大家给些建议， 谢谢。
Vector: 5kb
Insert: 4kb
total: 9kb
用Stratagene (agilent)的程序设计的引物。
试着用QuikChange XL kit, 不同的polymerase (PFU ultra, PrimeStar supermix, HF
PCR supermix), DMSO浓度。全都不行。
请大家给些建议， 谢谢。
s*r
6 楼
是开checking acct吗？我想要
【在 f********n 的大作中提到】
: 如题
: 赏几个包子呗
【在 f********n 的大作中提到】
: 如题
: 赏几个包子呗
n*m
7 楼
爽文阿
【在 S**********u 的大作中提到】
: 一面面金盾飞舞着，为高德奥瑞挡下了所有攻击。刚德吐气开声，大地之子的血脉力量
: 瞬间激发，巨斧接连斩开两面金盾，直到第三面金盾处才力尽而止。
: 绯色的短刀则在刺中金盾瞬间，忽然变得若有若无，刀锋直接洞穿四面金盾，至第
: 五面方止。从全力一击的爆发战力来看，绯色倒是比刚德高了不少。
: 刚德一脸懊恼，深为自己被绯色比了下去而苦恼，很是觉得自己没用。可是高德奥
: 瑞却不这样想，当刚德一斧斩开金盾时，他的眼皮就跳了一下，第二面金盾被斩开时，
: 金之子的脸色都有些变了！他用斗气凝聚出的金盾每一面都有抵挡法罗镇国强者全力一
: 击之力，也就是正常而言，高德奥瑞可以同时抵挡住十几位法罗镇国强者的围攻。
: 但是金之子还没有惊讶完，后方的绯色就一刀洞穿了四面金盾！这一下差点让高德
: 奥瑞叫出来。
【在 S**********u 的大作中提到】
: 一面面金盾飞舞着，为高德奥瑞挡下了所有攻击。刚德吐气开声，大地之子的血脉力量
: 瞬间激发，巨斧接连斩开两面金盾，直到第三面金盾处才力尽而止。
: 绯色的短刀则在刺中金盾瞬间，忽然变得若有若无，刀锋直接洞穿四面金盾，至第
: 五面方止。从全力一击的爆发战力来看，绯色倒是比刚德高了不少。
: 刚德一脸懊恼，深为自己被绯色比了下去而苦恼，很是觉得自己没用。可是高德奥
: 瑞却不这样想，当刚德一斧斩开金盾时，他的眼皮就跳了一下，第二面金盾被斩开时，
: 金之子的脸色都有些变了！他用斗气凝聚出的金盾每一面都有抵挡法罗镇国强者全力一
: 击之力，也就是正常而言，高德奥瑞可以同时抵挡住十几位法罗镇国强者的围攻。
: 但是金之子还没有惊讶完，后方的绯色就一刀洞穿了四面金盾！这一下差点让高德
: 奥瑞叫出来。
x*h
8 楼
8月最后一周 or 9月第一周?
s*y
9 楼
最好的方法是在那个地方的附近找两个靠近的restriction site,
然后直接合成两段oligo, 中间含有你要的序列，两端粘合后正好形成两个restriction
site
如果没有办法这样做的话，就用3-step ovelapping PCR.要插个20bp还是很容易的，
HF
【在 x**x 的大作中提到】
: Mutagenesis help：请问如何插入一段 ~20bp的片段 （large vector+insert）？
: Vector: 5kb
: Insert: 4kb
: total: 9kb
: 用Stratagene (agilent)的程序设计的引物。
: 试着用QuikChange XL kit, 不同的polymerase (PFU ultra, PrimeStar supermix, HF
: PCR supermix), DMSO浓度。全都不行。
: 请大家给些建议， 谢谢。
然后直接合成两段oligo, 中间含有你要的序列，两端粘合后正好形成两个restriction
site
如果没有办法这样做的话，就用3-step ovelapping PCR.要插个20bp还是很容易的，
HF
【在 x**x 的大作中提到】
: Mutagenesis help：请问如何插入一段 ~20bp的片段 （large vector+insert）？
: Vector: 5kb
: Insert: 4kb
: total: 9kb
: 用Stratagene (agilent)的程序设计的引物。
: 试着用QuikChange XL kit, 不同的polymerase (PFU ultra, PrimeStar supermix, HF
: PCR supermix), DMSO浓度。全都不行。
: 请大家给些建议， 谢谢。
f*n
10 楼
no longer available. tks
o*l
11 楼
韩立数宝
李察数人
一个个点名
【在 S**********u 的大作中提到】
: 一面面金盾飞舞着，为高德奥瑞挡下了所有攻击。刚德吐气开声，大地之子的血脉力量
: 瞬间激发，巨斧接连斩开两面金盾，直到第三面金盾处才力尽而止。
: 绯色的短刀则在刺中金盾瞬间，忽然变得若有若无，刀锋直接洞穿四面金盾，至第
: 五面方止。从全力一击的爆发战力来看，绯色倒是比刚德高了不少。
: 刚德一脸懊恼，深为自己被绯色比了下去而苦恼，很是觉得自己没用。可是高德奥
: 瑞却不这样想，当刚德一斧斩开金盾时，他的眼皮就跳了一下，第二面金盾被斩开时，
: 金之子的脸色都有些变了！他用斗气凝聚出的金盾每一面都有抵挡法罗镇国强者全力一
: 击之力，也就是正常而言，高德奥瑞可以同时抵挡住十几位法罗镇国强者的围攻。
: 但是金之子还没有惊讶完，后方的绯色就一刀洞穿了四面金盾！这一下差点让高德
: 奥瑞叫出来。
李察数人
一个个点名
【在 S**********u 的大作中提到】
: 一面面金盾飞舞着，为高德奥瑞挡下了所有攻击。刚德吐气开声，大地之子的血脉力量
: 瞬间激发，巨斧接连斩开两面金盾，直到第三面金盾处才力尽而止。
: 绯色的短刀则在刺中金盾瞬间，忽然变得若有若无，刀锋直接洞穿四面金盾，至第
: 五面方止。从全力一击的爆发战力来看，绯色倒是比刚德高了不少。
: 刚德一脸懊恼，深为自己被绯色比了下去而苦恼，很是觉得自己没用。可是高德奥
: 瑞却不这样想，当刚德一斧斩开金盾时，他的眼皮就跳了一下，第二面金盾被斩开时，
: 金之子的脸色都有些变了！他用斗气凝聚出的金盾每一面都有抵挡法罗镇国强者全力一
: 击之力，也就是正常而言，高德奥瑞可以同时抵挡住十几位法罗镇国强者的围攻。
: 但是金之子还没有惊讶完，后方的绯色就一刀洞穿了四面金盾！这一下差点让高德
: 奥瑞叫出来。
i*o
12 楼
Are you sure sure about this? If so, it will be fantastic.
Waiting for low-cost iPhone
【在 x******h 的大作中提到】
: 8月最后一周 or 9月第一周?
Waiting for low-cost iPhone
【在 x******h 的大作中提到】
: 8月最后一周 or 9月第一周?
b*n
13 楼
subcloning一段区域然后转到别的载体上操作
突变好之后再cloning back
sometimes the most stupid way is the most efficient way
HF
【在 x**x 的大作中提到】
: Mutagenesis help：请问如何插入一段 ~20bp的片段 （large vector+insert）？
: Vector: 5kb
: Insert: 4kb
: total: 9kb
: 用Stratagene (agilent)的程序设计的引物。
: 试着用QuikChange XL kit, 不同的polymerase (PFU ultra, PrimeStar supermix, HF
: PCR supermix), DMSO浓度。全都不行。
: 请大家给些建议， 谢谢。
突变好之后再cloning back
sometimes the most stupid way is the most efficient way
HF
【在 x**x 的大作中提到】
: Mutagenesis help：请问如何插入一段 ~20bp的片段 （large vector+insert）？
: Vector: 5kb
: Insert: 4kb
: total: 9kb
: 用Stratagene (agilent)的程序设计的引物。
: 试着用QuikChange XL kit, 不同的polymerase (PFU ultra, PrimeStar supermix, HF
: PCR supermix), DMSO浓度。全都不行。
: 请大家给些建议， 谢谢。
n*m
14 楼
劳模好久不数宝了
【在 o****l 的大作中提到】
: 韩立数宝
: 李察数人
: 一个个点名
【在 o****l 的大作中提到】
: 韩立数宝
: 李察数人
: 一个个点名
S*I
15 楼
Rumor said it's September; ATT are doing all kinds of tests to prepare for
iphone 5 release now.
【在 a*****0 的大作中提到】
: RT
iphone 5 release now.
【在 a*****0 的大作中提到】
: RT
x*x
16 楼
Thank you for your reply.
我找了，没有可用的restriction site...
可以展开说说 3-step overlapping PCR么？
谢谢
restriction
【在 s******y 的大作中提到】
: 最好的方法是在那个地方的附近找两个靠近的restriction site,
: 然后直接合成两段oligo, 中间含有你要的序列，两端粘合后正好形成两个restriction
: site
: 如果没有办法这样做的话，就用3-step ovelapping PCR.要插个20bp还是很容易的，
:
: HF
我找了，没有可用的restriction site...
可以展开说说 3-step overlapping PCR么？
谢谢
restriction
【在 s******y 的大作中提到】
: 最好的方法是在那个地方的附近找两个靠近的restriction site,
: 然后直接合成两段oligo, 中间含有你要的序列，两端粘合后正好形成两个restriction
: site
: 如果没有办法这样做的话，就用3-step ovelapping PCR.要插个20bp还是很容易的，
:
: HF
k*n
17 楼
lol...
a*0
18 楼
谢了，看来是劳动节以后的事。
x*x
19 楼
thank you.
就是我要创建几个不同的construct,
这样工作量就是有点大。
不过如果能有效的话，我应该试试的。
【在 b******n 的大作中提到】
: subcloning一段区域然后转到别的载体上操作
: 突变好之后再cloning back
: sometimes the most stupid way is the most efficient way
:
: HF
就是我要创建几个不同的construct,
这样工作量就是有点大。
不过如果能有效的话，我应该试试的。
【在 b******n 的大作中提到】
: subcloning一段区域然后转到别的载体上操作
: 突变好之后再cloning back
: sometimes the most stupid way is the most efficient way
:
: HF
o*l
20 楼
哦，俺已经放弃凡人了，看来风格变了
【在 n*****m 的大作中提到】
: 劳模好久不数宝了
【在 n*****m 的大作中提到】
: 劳模好久不数宝了
j*a
21 楼
用了几个月的ip4怎么出掉？想升到ip5
【在 a*****0 的大作中提到】
: 谢了，看来是劳动节以后的事。
【在 a*****0 的大作中提到】
: 谢了，看来是劳动节以后的事。
s*y
22 楼
描述起来还挺麻烦的。
你可以到google搜搜这个overlapping PCR mutagenesis, 然后点上面看图片
【在 x**x 的大作中提到】
: Thank you for your reply.
: 我找了，没有可用的restriction site...
: 可以展开说说 3-step overlapping PCR么？
: 谢谢
:
: restriction
你可以到google搜搜这个overlapping PCR mutagenesis, 然后点上面看图片
【在 x**x 的大作中提到】
: Thank you for your reply.
: 我找了，没有可用的restriction site...
: 可以展开说说 3-step overlapping PCR么？
: 谢谢
:
: restriction
s*e
23 楼
哎， 咋搞的，我怎么现在都觉得看不下去了？
a*0
24 楼
有老婆女友没有？ 想办法把她升级到iphone4
【在 j*a 的大作中提到】
: 用了几个月的ip4怎么出掉？想升到ip5
x*x
25 楼
thank you.
it looks not very complicated.
I will give it a try.
【在 s******y 的大作中提到】
: 描述起来还挺麻烦的。
: 你可以到google搜搜这个overlapping PCR mutagenesis, 然后点上面看图片
it looks not very complicated.
I will give it a try.
【在 s******y 的大作中提到】
: 描述起来还挺麻烦的。
: 你可以到google搜搜这个overlapping PCR mutagenesis, 然后点上面看图片
c*u
26 楼
都在进行跨界面强者PK。
【在 o****l 的大作中提到】
: 哦，俺已经放弃凡人了，看来风格变了
【在 o****l 的大作中提到】
: 哦，俺已经放弃凡人了，看来风格变了
j*a
27 楼
换个sim不就完了……
【在 a*****0 的大作中提到】
:
: 有老婆女友没有？ 想办法把她升级到iphone4
【在 a*****0 的大作中提到】
:
: 有老婆女友没有？ 想办法把她升级到iphone4
s*y
28 楼
描述起来确实很难。不过做起来其实挺简单的，就是做三次PCR而已。
【在 x**x 的大作中提到】
: thank you.
: it looks not very complicated.
: I will give it a try.
【在 x**x 的大作中提到】
: thank you.
: it looks not very complicated.
: I will give it a try.
T*e
29 楼
构装骑士们呢？不是说了好几次集体掷矛可以轰杀传奇，怎么不轰呀
i*1
30 楼
ebay/craiglist ...
【在 j*a 的大作中提到】
: 用了几个月的ip4怎么出掉？想升到ip5
【在 j*a 的大作中提到】
: 用了几个月的ip4怎么出掉？想升到ip5
z*k
31 楼
推荐Invitrogen的GENEART® Site-Directed Mutagenesis System
我一个8kb多的质粒做了10几个突变了
非常方便
HF
【在 x**x 的大作中提到】
: Mutagenesis help：请问如何插入一段 ~20bp的片段 （large vector+insert）？
: Vector: 5kb
: Insert: 4kb
: total: 9kb
: 用Stratagene (agilent)的程序设计的引物。
: 试着用QuikChange XL kit, 不同的polymerase (PFU ultra, PrimeStar supermix, HF
: PCR supermix), DMSO浓度。全都不行。
: 请大家给些建议， 谢谢。
我一个8kb多的质粒做了10几个突变了
非常方便
HF
【在 x**x 的大作中提到】
: Mutagenesis help：请问如何插入一段 ~20bp的片段 （large vector+insert）？
: Vector: 5kb
: Insert: 4kb
: total: 9kb
: 用Stratagene (agilent)的程序设计的引物。
: 试着用QuikChange XL kit, 不同的polymerase (PFU ultra, PrimeStar supermix, HF
: PCR supermix), DMSO浓度。全都不行。
: 请大家给些建议， 谢谢。
j*a
32 楼
开多少合适？
【在 i***1 的大作中提到】
: ebay/craiglist ...
【在 i***1 的大作中提到】
: ebay/craiglist ...
j*x
33 楼
这个相比Stratagene quikchange没什么优势啊感觉，用过的给讲讲？
个人推荐Clonetech的Transformer Site-Directed Mutagenesis Kit，如果要同时突变
多个位点的话。
【在 z*****k 的大作中提到】
: 推荐Invitrogen的GENEART® Site-Directed Mutagenesis System
: 我一个8kb多的质粒做了10几个突变了
: 非常方便
:
: HF
个人推荐Clonetech的Transformer Site-Directed Mutagenesis Kit，如果要同时突变
多个位点的话。
【在 z*****k 的大作中提到】
: 推荐Invitrogen的GENEART® Site-Directed Mutagenesis System
: 我一个8kb多的质粒做了10几个突变了
: 非常方便
:
: HF
k*o
34 楼
你的20bp是你设计的特定序列吧？
如sunny所说：
http://www.nature.com/nprot/journal/v2/n4/fig_tab/nprot.2007.132_F1.html
没见过再简单的了..
再说现在70mer以下的oligos都质量很好又不贵
【在 x**x 的大作中提到】
: thank you.
: it looks not very complicated.
: I will give it a try.
如sunny所说：
http://www.nature.com/nprot/journal/v2/n4/fig_tab/nprot.2007.132_F1.html
没见过再简单的了..
再说现在70mer以下的oligos都质量很好又不贵
【在 x**x 的大作中提到】
: thank you.
: it looks not very complicated.
: I will give it a try.
k*o
35 楼
要不我把独家的两步PCR告诉你？？呵呵~~大同小异，效果差不多..
x*x
36 楼
thanks a lot.
I saw that paper too.
【在 k*****o 的大作中提到】
: 你的20bp是你设计的特定序列吧？
: 如sunny所说：
: http://www.nature.com/nprot/journal/v2/n4/fig_tab/nprot.2007.132_F1.html
: 没见过再简单的了..
: 再说现在70mer以下的oligos都质量很好又不贵
I saw that paper too.
【在 k*****o 的大作中提到】
: 你的20bp是你设计的特定序列吧？
: 如sunny所说：
: http://www.nature.com/nprot/journal/v2/n4/fig_tab/nprot.2007.132_F1.html
: 没见过再简单的了..
: 再说现在70mer以下的oligos都质量很好又不贵
x*x
37 楼
I agree.
Insertion mutagenesis (>15bp) is more difficult than point mutation or
deletion with those mutagenesis kits.
【在 j****x 的大作中提到】
: 这个相比Stratagene quikchange没什么优势啊感觉，用过的给讲讲？
: 个人推荐Clonetech的Transformer Site-Directed Mutagenesis Kit，如果要同时突变
: 多个位点的话。
Insertion mutagenesis (>15bp) is more difficult than point mutation or
deletion with those mutagenesis kits.
【在 j****x 的大作中提到】
: 这个相比Stratagene quikchange没什么优势啊感觉，用过的给讲讲？
: 个人推荐Clonetech的Transformer Site-Directed Mutagenesis Kit，如果要同时突变
: 多个位点的话。
s*n
38 楼
NEB的mutagenesis kit，用PCR扩增整个plasmid，同时插入你的片段，然后自连。具体
操作看manual。
操作看manual。
C*e
39 楼
我用过这个方法
不过没有用kit
PCR扩增整个Plamid的时候是两对引物
一对没有insertion/mutation/deletion
一对有
然后PCR产物用DpnI处理
anneal
直接转化
不过lz要的是9 kb的
这个操作起来麻烦一点
如果可以vector先做insertion/mutation/deletion
然后再放5 kb片段进去会容易些
【在 s********n 的大作中提到】
: NEB的mutagenesis kit，用PCR扩增整个plasmid，同时插入你的片段，然后自连。具体
: 操作看manual。
不过没有用kit
PCR扩增整个Plamid的时候是两对引物
一对没有insertion/mutation/deletion
一对有
然后PCR产物用DpnI处理
anneal
直接转化
不过lz要的是9 kb的
这个操作起来麻烦一点
如果可以vector先做insertion/mutation/deletion
然后再放5 kb片段进去会容易些
【在 s********n 的大作中提到】
: NEB的mutagenesis kit，用PCR扩增整个plasmid，同时插入你的片段，然后自连。具体
: 操作看manual。
s*n
40 楼
可以只用一对引物就可以了，对于大的插入片段可能有问题，但20 bp成功率非常高的
，看附件。
【在 s********n 的大作中提到】
: NEB的mutagenesis kit，用PCR扩增整个plasmid，同时插入你的片段，然后自连。具体
: 操作看manual。
，看附件。
【在 s********n 的大作中提到】
: NEB的mutagenesis kit，用PCR扩增整个plasmid，同时插入你的片段，然后自连。具体
: 操作看manual。
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