高手请进：几个蛋白纯化的技术难题 - 未名空间MITBBS历史存档

高手请进：几个蛋白纯化的技术难题# Biology - 生物学

c*n2010-12-01 08:12

1 楼

父母持的是B2签证，在去年底第一次一起入境。当时的理由是参加我的婚礼。他们今年
5月份回国。
父亲在6月底又一次入境，10月底回国。
现在他们又决定在11月中旬同时入境。入境的理由是来美国看我，以及在美国陪我过中
国新年！
请问：
父母这次的入境理由充足吗？需要带什么材料（国内的工作证明，房产证明）？前
2次入境都没有被要求出示他们国内的工作证明！
我可以通过什么理由来争取父母这次在美国的6个月的居留期，考虑到他们在一年
内已经有入境的经历！他们这次能待6个月的机会有多大？
父母入境可能会遇到什么样的麻烦（来自海关）？我要怎么准备？
父母在入境的时候必须出示双程票吗？（前两次入境的时候都没有被要求出示双程
票，而是出示我给海关工作人员的信）

h*r2010-12-01 08:12

2 楼

好几个硬盘，各个牌子的都有，放了几年没用，结果都不能读了。连接上后（ide, or
usb enclosure），完全看不到硬盘。有人有类似经历吗？
本来想用硬盘作长期backup用，看来不可靠。
另外有人有什么招数可以恢复硬盘的数据？以前看到过冰冻的方法，不知道有没有用。

s*r2010-12-01 08:12

3 楼

1. 如果蛋白很纯，SDS一条带，怎么确定这个蛋白就是你要的蛋白？
N端block了，没法测序；
没有抗体，没法western；
2.如果蛋白不纯，比如很多杂带，你怎么确定你要的蛋白在里面？用什么方法？
3. 怎么测试蛋白的热稳定性？用什么biopgysics的方法？
4. 用质谱测MW，有时有偏离，那么表达后修饰都有那些需要考虑进去？
（不考虑糖基化）
5. 怎么确定蛋白是否有糖基化修饰？
6. 蛋白浓缩的时候有沉淀，一般你会怎么办？
愿闻高见。

a*n2010-12-01 08:12

4 楼

给海关写封信解释一下入境目的，具体看置顶 B2常见问题里面，最好有
双程票，没有遇到不代表就不需要，有了省得麻烦。
其他没有人知道，给不给6个月完全看入境官，看他管不管了。遇到的麻烦
可能会，比如让你父亲解释为什么要在一年内3次入境美国，每次都那么长
时间，当然没有问题的可能也有。不过谁也不知道。
最后说几句，你父亲明显违反B2短期探亲的规定，在美国时间比在中国还长，
入境官给多少就多少，千万别让你父亲在那里和入境官吵。见过有人本来给1
个月，一吵给几天的……而且细水长流，这次要是入境后，下次回国最好在
国内多呆一段在签证，记录已经花了，签证可能会有麻烦，当然也可能啥事
没有。

【在 c*********n 的大作中提到】

: 父母持的是B2签证，在去年底第一次一起入境。当时的理由是参加我的婚礼。他们今年
: 5月份回国。
: 父亲在6月底又一次入境，10月底回国。
: 现在他们又决定在11月中旬同时入境。入境的理由是来美国看我，以及在美国陪我过中
: 国新年！
: 请问：
: 父母这次的入境理由充足吗？需要带什么材料（国内的工作证明，房产证明）？前
: 2次入境都没有被要求出示他们国内的工作证明！
: 我可以通过什么理由来争取父母这次在美国的6个月的居留期，考虑到他们在一年
: 内已经有入境的经历！他们这次能待6个月的机会有多大？

v*m2010-12-01 08:12

5 楼

不是高手的答案。
1，质谱,各种功能实验。
2，功能实验。
3，功能实验。
4，去http://www.abrf.org/index.cfm/dm.details?DMID=235&AvgMass=all&Margin=0，查各种可能到修饰。
5，Mw, 用去糖基化酶处理，看前后分子量对比。
6，优化溶液条件，如改变离子强度，pH, detergents 等，如果还是沉淀，那就浓度
搞低点。

【在 s*******r 的大作中提到】

: 1. 如果蛋白很纯，SDS一条带，怎么确定这个蛋白就是你要的蛋白？
: N端block了，没法测序；
: 没有抗体，没法western；
: 2.如果蛋白不纯，比如很多杂带，你怎么确定你要的蛋白在里面？用什么方法？
: 3. 怎么测试蛋白的热稳定性？用什么biopgysics的方法？
: 4. 用质谱测MW，有时有偏离，那么表达后修饰都有那些需要考虑进去？
: （不考虑糖基化）
: 5. 怎么确定蛋白是否有糖基化修饰？
: 6. 蛋白浓缩的时候有沉淀，一般你会怎么办？
: 愿闻高见。

i*n2010-12-01 08:12

6 楼

自求多福吧

【在 c*********n 的大作中提到】

: 父母持的是B2签证，在去年底第一次一起入境。当时的理由是参加我的婚礼。他们今年
: 5月份回国。
: 父亲在6月底又一次入境，10月底回国。
: 现在他们又决定在11月中旬同时入境。入境的理由是来美国看我，以及在美国陪我过中
: 国新年！
: 请问：
: 父母这次的入境理由充足吗？需要带什么材料（国内的工作证明，房产证明）？前
: 2次入境都没有被要求出示他们国内的工作证明！
: 我可以通过什么理由来争取父母这次在美国的6个月的居留期，考虑到他们在一年
: 内已经有入境的经历！他们这次能待6个月的机会有多大？

m*z2010-12-01 08:12

7 楼

1. in-gel tryptic digestion followed by MS or MS-MS
2. ESI-MS or functional assay
3. CD denaturation
4. cys oxidation and others? not quite sure, guess depends on the mass
difference
5. not sure... MS-MS?
6. increase salt, change buffer condition, lower temperature, add a ligand
to stabilize, etc.

【在 s*******r 的大作中提到】

: 1. 如果蛋白很纯，SDS一条带，怎么确定这个蛋白就是你要的蛋白？
: N端block了，没法测序；
: 没有抗体，没法western；
: 2.如果蛋白不纯，比如很多杂带，你怎么确定你要的蛋白在里面？用什么方法？
: 3. 怎么测试蛋白的热稳定性？用什么biopgysics的方法？
: 4. 用质谱测MW，有时有偏离，那么表达后修饰都有那些需要考虑进去？
: （不考虑糖基化）
: 5. 怎么确定蛋白是否有糖基化修饰？
: 6. 蛋白浓缩的时候有沉淀，一般你会怎么办？
: 愿闻高见。

q*g2010-12-01 08:12

8 楼

顶。这里来问帮助不大。

【在 i*n 的大作中提到】

: 自求多福吧

s*y2010-12-01 08:12

9 楼

有几个地方补充一下
2.如果蛋白不纯，比如很多杂带，你怎么确定你要的蛋白在里面？用什么方法？
把符合尺寸的带切下来，送去做质谱
3. 怎么测试蛋白的热稳定性？用什么biopgysics的方法？
一大堆经典方法。自己去查
4. 用质谱测MW，有时有偏离，那么表达后修饰都有那些需要考虑进去？
（不考虑糖基化）
表达后修饰可以直接用质谱来测。只要你告诉对方你有这个需要，他们就会
给你做
5. 怎么确定蛋白是否有糖基化修饰？
质谱是最直接的方法。
6. 蛋白浓缩的时候有沉淀，一般你会怎么办？
严格控制条件，一定要加够DTT. 然后把透析的烧杯密封起来
透析完之后，用高速离心把沉淀成分去掉

c*n2010-12-01 08:12

10 楼

那我应该去哪里问呢？

s*n2010-12-01 08:12

11 楼

一些补充：

native protein or recombinant protein? 功能当然是首选；但如果有tag（如His
tag）就用其抗体检测，没有就当我没说。
首先还是功能检测，在不同温度下incubate不同时间然后测功能；DSC是测Tm的gold
standard
也可以用gel staining

【在 s*******r 的大作中提到】

: 1. 如果蛋白很纯，SDS一条带，怎么确定这个蛋白就是你要的蛋白？
: N端block了，没法测序；
: 没有抗体，没法western；
: 2.如果蛋白不纯，比如很多杂带，你怎么确定你要的蛋白在里面？用什么方法？
: 3. 怎么测试蛋白的热稳定性？用什么biopgysics的方法？
: 4. 用质谱测MW，有时有偏离，那么表达后修饰都有那些需要考虑进去？
: （不考虑糖基化）
: 5. 怎么确定蛋白是否有糖基化修饰？
: 6. 蛋白浓缩的时候有沉淀，一般你会怎么办？
: 愿闻高见。

i*n2010-12-01 08:12

12 楼

求神拜菩萨磕头祷告随你便。问谁都没用

【在 c*********n 的大作中提到】

: 那我应该去哪里问呢？

s*r2010-12-01 08:12

13 楼

Thanks for everyone. Very good discussion and educative.
for 3, I think CD is the easiest one, and then measure Tm value.
for 1. can we do C-terminal peptide sequencing?
for 2. cut the gel and do MS, is a good way, but MS can only tell the Mw,
you still are not sure about the identity of the protein.
for 5. the MS peak will be very wide if it is glycosylated. treat with
deglycosylation enzyme and do MS might be a good way.
for 6, what kinds of buffer optimization can we use?
welcome more discussion.

【在 s*******r 的大作中提到】

: 1. 如果蛋白很纯，SDS一条带，怎么确定这个蛋白就是你要的蛋白？
: N端block了，没法测序；
: 没有抗体，没法western；
: 2.如果蛋白不纯，比如很多杂带，你怎么确定你要的蛋白在里面？用什么方法？
: 3. 怎么测试蛋白的热稳定性？用什么biopgysics的方法？
: 4. 用质谱测MW，有时有偏离，那么表达后修饰都有那些需要考虑进去？
: （不考虑糖基化）
: 5. 怎么确定蛋白是否有糖基化修饰？
: 6. 蛋白浓缩的时候有沉淀，一般你会怎么办？
: 愿闻高见。

a*n2010-12-01 08:12

14 楼

我第一篇回复你没看？问谁都没有用，看运气，入境官不管没事。他要是
觉得在美国呆的时间太久，很大可能给你短的时间，给3天我都知道有这样
的案例。

【在 c*********n 的大作中提到】

: 那我应该去哪里问呢？

m*z2010-12-01 08:12

15 楼

for 2: if the MW is not enough for you, you can do MS-MS to essentially "
sequence" the protein, although you can't expect 100% coverage. This is true
for 1 too. MS-MS is just another way to do peptide sequencing.

【在 s*******r 的大作中提到】

: Thanks for everyone. Very good discussion and educative.
: for 3, I think CD is the easiest one, and then measure Tm value.
: for 1. can we do C-terminal peptide sequencing?
: for 2. cut the gel and do MS, is a good way, but MS can only tell the Mw,
: you still are not sure about the identity of the protein.
: for 5. the MS peak will be very wide if it is glycosylated. treat with
: deglycosylation enzyme and do MS might be a good way.
: for 6, what kinds of buffer optimization can we use?
: welcome more discussion.

i*n2010-12-01 08:12

16 楼

楼主这个计划，要是这次还没人刁难一路顺利那是运气不是一般的好

【在 a*****n 的大作中提到】

: 我第一篇回复你没看？问谁都没有用，看运气，入境官不管没事。他要是
: 觉得在美国呆的时间太久，很大可能给你短的时间，给3天我都知道有这样
: 的案例。

a*a2010-12-01 08:12

17 楼

考试就自己做，这里不是做作业版

【在 s*******r 的大作中提到】

: 1. 如果蛋白很纯，SDS一条带，怎么确定这个蛋白就是你要的蛋白？
: N端block了，没法测序；
: 没有抗体，没法western；
: 2.如果蛋白不纯，比如很多杂带，你怎么确定你要的蛋白在里面？用什么方法？
: 3. 怎么测试蛋白的热稳定性？用什么biopgysics的方法？
: 4. 用质谱测MW，有时有偏离，那么表达后修饰都有那些需要考虑进去？
: （不考虑糖基化）
: 5. 怎么确定蛋白是否有糖基化修饰？
: 6. 蛋白浓缩的时候有沉淀，一般你会怎么办？
: 愿闻高见。

i*i2010-12-01 08:12

18 楼

楼主的父亲是否准备第三次来美已经签证完毕了？最近有案例说因为回国后在国内呆时
间较短而导致使领馆拒签。而你家父母紧密行程在国内待的时间短的很多。你父母第三
次签证，是在哪个使领馆么？感觉似乎在上海领馆最近对中信代传递的要求去面签的有
增多的趋势，而在沈阳等其他领馆感觉很少。是不是这样，有待于求证。如果是的话，
或许证明不是所谓政策上的美式“潜规则”而是个别使领馆的签证官的随机性所致吧。

a*k2010-12-01 08:12

19 楼

赞犀利

【在 a***a 的大作中提到】

: 考试就自己做，这里不是做作业版

a*n2010-12-01 08:12

20 楼

他是想利用多次签证，在签证过期前在入境，所以应该没有签证。
是不是潜规则还是签证官随机性这个根本没有办法判断，因为谁也没有真实的
统计数据，也许沈阳的人不来报而已。即使现在版面报的数量相对于同样情况
的签证来说也是小数据。不过不管是随机性还是潜规则，遵守好B2签证的规则
，细水长流，签证官很小可能会为难你，其实都是自己为难了自己。

【在 i**i 的大作中提到】

: 楼主的父亲是否准备第三次来美已经签证完毕了？最近有案例说因为回国后在国内呆时
: 间较短而导致使领馆拒签。而你家父母紧密行程在国内待的时间短的很多。你父母第三
: 次签证，是在哪个使领馆么？感觉似乎在上海领馆最近对中信代传递的要求去面签的有
: 增多的趋势，而在沈阳等其他领馆感觉很少。是不是这样，有待于求证。如果是的话，
: 或许证明不是所谓政策上的美式“潜规则”而是个别使领馆的签证官的随机性所致吧。

v*m2010-12-01 08:12

21 楼

haha

【在 a********k 的大作中提到】

: 赞犀利

s*r2010-12-01 08:12

22 楼

这就没劲了，兄弟。讨论总有益处，特别是自己不熟的东西。
俺是千老，考试是N年前的事了。你还挺敏感，别说。hh

【在 a***a 的大作中提到】

: 考试就自己做，这里不是做作业版

a*a2010-12-01 08:12

23 楼

你都千老了这些问题还问出来那我真无言以对了

【在 s*******r 的大作中提到】

: 这就没劲了，兄弟。讨论总有益处，特别是自己不熟的东西。
: 俺是千老，考试是N年前的事了。你还挺敏感，别说。hh

w*e2010-12-01 08:12

24 楼

术业有专攻嘛

【在 a***a 的大作中提到】

: 你都千老了这些问题还问出来那我真无言以对了

k*n2010-12-01 08:12

25 楼

For 5, you can use ConA blot, which is easy and straight foward.
Deglycosylation following by SDS_PAGE is good enough to identify Asn-
glycosylation.
You can safely go to MS once the above two is confirmed.

【在 s*******r 的大作中提到】

: Thanks for everyone. Very good discussion and educative.
: for 3, I think CD is the easiest one, and then measure Tm value.
: for 1. can we do C-terminal peptide sequencing?
: for 2. cut the gel and do MS, is a good way, but MS can only tell the Mw,
: you still are not sure about the identity of the protein.
: for 5. the MS peak will be very wide if it is glycosylated. treat with
: deglycosylation enzyme and do MS might be a good way.
: for 6, what kinds of buffer optimization can we use?
: welcome more discussion.

a*a2010-12-01 08:12

26 楼

是分子生物学，细胞生物学的phd，这种题目连qual都不会出

【在 w******e 的大作中提到】

: 术业有专攻嘛

s*r2010-12-01 08:12

27 楼

看样子你水平很高啊
说说你的标准答案 -- 其实真的不容易。泛泛地讲，大家都可以说一堆，具体到一个
问题，就很复杂。

【在 a***a 的大作中提到】

: 你都千老了这些问题还问出来那我真无言以对了

a*a2010-12-01 08:12

28 楼

水平很一般，也就是从ecoli里表达纯化过600kd的complex而已

【在 s*******r 的大作中提到】

: 看样子你水平很高啊
: 说说你的标准答案 -- 其实真的不容易。泛泛地讲，大家都可以说一堆，具体到一个
: 问题，就很复杂。

n*t2010-12-01 08:12

29 楼

犀利不是吹的。呵呵

【在 a***a 的大作中提到】

: 你都千老了这些问题还问出来那我真无言以对了

f*e2010-12-01 08:12

30 楼

for #4: Variable Modification: met oxidation
Static Modificaiton: cys carboxy-amido-methylation if IAA is used
Other modification should be specified only when the corresponding
enrichment is performed, otherwise many false postive
identifications
will be introduced

【在 m**z 的大作中提到】

: 1. in-gel tryptic digestion followed by MS or MS-MS
: 2. ESI-MS or functional assay
: 3. CD denaturation
: 4. cys oxidation and others? not quite sure, guess depends on the mass
: difference
: 5. not sure... MS-MS?
: 6. increase salt, change buffer condition, lower temperature, add a ligand
: to stabilize, etc.

U*t2010-12-01 08:12

31 楼

参考了楼上的答案后给出我回答

酶切+质谱，质谱-质谱应该能确证该蛋白是否存在目标蛋白的片段。
首选 Western Blot；
辅助证明酶切，看是否产生目标蛋白酶切的片段。
蛋白与它的目标蛋白反应--------- 如用 SPR， Fotebio 等不需纯化好的蛋白
CD， DSC, temperature-dependent fluorescence (有不同称呼如 Tdf 或
thermFluor）
N-端去 Met；磷酸化，。。。
质谱-质谱可以 mapping 哪儿进行了修饰
SDS-PAGE 后 Glyco-staining
solubility screening 获得好的溶解条件。一个一个条件地试是比较傻的。

【在 s*******r 的大作中提到】

: 1. 如果蛋白很纯，SDS一条带，怎么确定这个蛋白就是你要的蛋白？
: N端block了，没法测序；
: 没有抗体，没法western；
: 2.如果蛋白不纯，比如很多杂带，你怎么确定你要的蛋白在里面？用什么方法？
: 3. 怎么测试蛋白的热稳定性？用什么biopgysics的方法？
: 4. 用质谱测MW，有时有偏离，那么表达后修饰都有那些需要考虑进去？
: （不考虑糖基化）
: 5. 怎么确定蛋白是否有糖基化修饰？
: 6. 蛋白浓缩的时候有沉淀，一般你会怎么办？
: 愿闻高见。

s*r2010-12-01 08:12

32 楼

不错。谢谢

【在 U*****t 的大作中提到】

: 参考了楼上的答案后给出我回答
:
: 酶切+质谱，质谱-质谱应该能确证该蛋白是否存在目标蛋白的片段。
: 首选 Western Blot；
: 辅助证明酶切，看是否产生目标蛋白酶切的片段。
: 蛋白与它的目标蛋白反应--------- 如用 SPR， Fotebio 等不需纯化好的蛋白
: CD， DSC, temperature-dependent fluorescence (有不同称呼如 Tdf 或
: thermFluor）
: N-端去 Met；磷酸化，。。。
: 质谱-质谱可以 mapping 哪儿进行了修饰